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一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
转铁蛋白(TF)是一种非血红素的铁结合糖蛋白，能使得铁离子与之紧密结合，并将其有选择地释放到特定部位与靶细胞上的特异受体结合以行使生理功能(Schanbacher FL，et al..J Dairy Sci.1993，76(12)：3812-3831)，同时它还参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节(Zakin MM，et al..Dev Neurosci.2002，24(2-3)：222-226)，最近还有报导称转铁蛋白是胚胎干细胞和神经干细胞生长非常重要的一种调节因子(Lu J，et al..Proc Natl Acad Sci USA.2006，103(15)：5688-5693；Kanemura Y，et al.Cell Transplant.2005，14(9)：673-682；Koivisto H，et al.ReprodBiomed Online.2004，9(3)：330-337)，它的开发利用具有重要的经济和社会效益。
TF主要在肝脏、脑及生殖器官中表达，在一些物种的乳腺中亦发现有TF的表达。对比各种物种的TF的表达水平发现，人TF表达水平较低，以在乳汁中的表达水平为例，人TF的表达水平不到50μg/mL，而兔TF的表达水平达到了2mg/mL。人、兔两个物种的TF在乳汁中的含量相差甚远，但它们的TF启动子却具有一定的同源性。
本申请的发明人克隆得到了226bp的兔转铁蛋白启动子(RP promoter)，并以pcDNA3.1(-)为骨架，在其多克隆位点处顺次插入RP和人转铁蛋白(hTF)小基因，得到表达载体δpcDNA3.1-RP-hTF，并转染大鼠肝脏细胞株BRL-3A分析hTF表达情况。结果表明，RP可以启动hTF的表达，但效率并不高，在表达载体δpcDNA3.1-RP-hTF转染的BRL-3A细胞的上清培养液中，hTF的表达水平仅为30ng/ml左右(潘树标，颜景斌，任兆瑞.人转铁蛋白重组载体的构建及其表达调控的研究，中国生物工程杂志，2008，28(6)：50-55)。因此，期待能构建进一步提高hTF表达的载体，以利于今后转基因动物生物反应器的研究和应用。
发明内容
本发明的第一个目的，在于提供一种人转铁蛋白的表达载体。
本发明的第二个目的，在于提供人转铁蛋白表达载体的构建方法。
本发明的第三个目的，在于提供人转铁蛋白表达载体的应用。
本发明的人转铁蛋白的表达载体，由人转铁蛋白小基因，兔转铁蛋白启动子，兔转铁蛋白增强子以及去除CMV启动子的pcDNA3.1(-)载体构成。
本发明的人转铁蛋白的表达载体，所述兔转铁蛋白启动子接在所述人转铁蛋白小基因的上游，所述兔转铁蛋白增强子接在所述兔转铁蛋白启动子的上游。所述人转铁蛋白小基因包含人转铁蛋白的cDNA和内含子1。所述人转铁蛋白小基因的序列如SEQ ID No.1所示。所述兔转铁蛋白启动子的序列如SEQ ID No.2所示。所述兔转铁蛋白增强子的序列如SEQ ID No.3所示。
本发明的人转铁蛋白的表达载体，所述兔转铁蛋白增强子的数目为一个，构成的载体为δ3.1-EP-TFN；所述δ3.1-EP-TFN载体的序列如SEQ ID No.4所示。
本发明的人转铁蛋白的表达载体，所述兔转铁蛋白增强子的数目为两个，串联接在所述兔转铁蛋白启动子的上游，构成的载体为δ3.1-2EP-TFN；所述δ3.1-2EP-TFN载体的序列如SEQ ID No.5所示。
本发明的人转铁蛋白表达载体δ3.1-2EP-TFN的构建方法，包括以下步骤：
A、构建去除CMV启动子的载体pcDNA3.1；
B、扩增人转铁蛋白小基因，接入pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1-TFN载体；
C、扩增兔转铁蛋白启动子，接入pSL301载体，获得301-RTF载体；
D、扩增兔转铁蛋白增强子，接入pGEM-T载体，获得T-RTFE载体；
E、两个T-RTFE载体和一个301-RTF载体连接获得pSL301-2EP载体；
F、pSL301-2EP载体和δpcDNA3.1载体连接获得δ3.1-2EP载体；
G、δ3.1-2EP载体和pcDNA3.1-TFN载体连接获得δ3.1-2EP-TFN载体。
本发明的人转铁蛋白表达载体δ3.1-EP-TFN的构建方法，包括以下步骤：
A、构建去除CMV启动子的载体pcDNA3.1；
B、扩增人转铁蛋白小基因，接入pcDNA3.1载体，获得pcDNA3.1-TFN载体；
C、扩增兔转铁蛋白启动子，接入pSL301载体，获得301-RTF载体；
D、扩增兔转铁蛋白增强子，接入pGEM-T载体，获得T-RTFE载体；
E、两个T-RTFE载体和一个301-RTF载体连接获得pSL301-2EP载体；
F、双酶切pSL301-2EP载体，补平、去磷酸化自连形成pSL301-EP载体；
G、pSL301-EP载体和δpcDNA3.连接后获得δ3.1-EP载体；
H、δ3.1-EP载体和pcDNA3.1-TFN载体连接后获得δ3.1-EP-TFN载体。
本发明的人转铁蛋白表达载体的构建方法，所述人转铁蛋白小基因包含人转铁蛋白的cDNA和内含子1。
本发明的人转铁蛋白表达载体，在制备人转铁蛋白的应用中，具体的，在大鼠肝脏细胞株和转基因小鼠血浆中，可高效表达人转铁蛋白。
附图说明
图1为δpcDNA3.1的酶切鉴定图。
图2为人转铁蛋白cDNA的PCR扩增图。
图3为人转铁蛋白外显子1和内含子1的PCR扩增图。
图4为兔转铁蛋白基因启动子的PCR扩增图。
图5为兔转铁蛋白基因增强子的PCR扩增图。
图6为pcDNA3.1-TFN的构建过程图。
图7为δpcDNA3.1-2EP-TFN构建过程的示意图。
图8为δpcDNA3.1-2EP-TFN酶切鉴定图。
图9为δpcDNA3.1-EP-TFN构建过程的示意图。
图10为δpcDNA3.1-EP-TFN酶切鉴定图。
图11为BRL-3A细胞转染上清液中hTF表达水平分析图。
图12为转基因小鼠血浆中hTF平均表达水平图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明构建的表达载体，以去除CMV启动子的pcDNA3.1(-)为骨架，以人转铁蛋白小基因为目的基因，在其上游接入RP启动子，在RP启动子的上游接入兔转铁蛋白增强子。载体构建完成后，采用脂质体转染的方法将载体转染大鼠肝脏细胞株BRL-3A，采用原核显微注射的方法制备整合载体的转基因小鼠，并采用ELISA方法分别检测细胞上清液和血浆中hTF的表达水平，验证表达效果。
本发明使用的质粒pcDNA3.1、pSL301载体购自invitrogen公司；PCR相关试剂购自TaKaRa公司；人胎肝cDNA文库购自Clontech公司；pGEM-T载体、pGEM-T easy载体购自Promega公司；BRL-3A细胞株购自中科院上海生化细胞所；细胞培养基高糖DMEM购自Gibco公司；小牛血清购自民海公司；人表皮生长因子(EGF)购自中科院上海生化所；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；人胰岛素由上海生化制药厂生产；鼠抗hTF单克隆抗体购自DAKO公司；生物素标记的鼠抗hTF单克隆抗体购自Sigma公司；HRP酶联羊抗生物素抗体购自华美公司。其它各种分子生物学使用的酶分别购自TaKaRa、MBI公司。
实施例1、去除CMV启动子的载体pcDNA3.1
采用Bgl II酶切pcDNA3.1载体，反应体系为：
质粒DNA 10μg；10×H buffer 15μL；Bgl II 20U；H₂O补足至150μL。
于37℃水浴中酶切2h后，在反应体系中加入2倍体积乙醇，沉淀后，溶于50μL H₂O，然后再用Nhe I酶切，反应体系为：
质粒DNA 50μL；10×M buffer 15μL；Nhe I 20U；H₂O补足至150μL。
于37℃水浴中酶切2h后，在反应体系中加入2倍体积乙醇沉淀后，溶于6μLH₂O，加入dNTP和T4DNA聚合酶进行补平，反应体系为：
质粒DNA6μL；10×buffer 1μL；dNTP 1μL；2％BSA 1μL。
于70℃水浴反应5min后，加入1μLT4DNA聚合酶37℃水浴反应5min。最后加入10μL TaKaRa公司的2×连接液(含有连接酶和反应缓冲液)，于16℃水浴中自连30min，得到载体。采用酶切鉴定，结果如图1所示，泳道1为用Xho I酶切载体，泳道2为所抽提的质粒，泳道M为1Kb分子量标准。在泳道1的4.5Kb位置处存在明显条带，符合预期，表明得到去除CMV启动子的载体δpcDNA3.1。
实施例2、扩增人转铁蛋白小基因
首先采用PCR扩增人胎肝cDNA文库，引物序列为：
TR-1：5’-CGACGCGTGACTGTGCTCGCTGCTCA-3’
TR-2：5’-GGACTAGTCATCTGCGTTCCCATCTTC-3’
反应体系如表1所示，PCR反应条件为：94℃5min；(94℃45sec，55℃45sec，72℃2min)×35个循环；72℃10min。
表1扩增人转铁蛋白cDNA的反应体系

  10×PCR buffer  2.5μL  dNTP(2.5mM)  2μL  TR-1  1μL  TR-4  1μL  人胎肝文库  1μL  Ex Taq E(5U/L)  0.2μL  H₂O  17.3μL  V总  25μL
将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，M为1Kb分子量标准，1为扩增条带，可见扩增出特异性的2.2Kb长的条带，经测序验证，获得的条带为人转铁蛋白cDNA。
采用酚/氯仿法，从健康人外周血中提取人基因组DNA，使用从人基因组DNA中扩增人转铁蛋白基因外显子1(exon 1)和内含子1(intron 1)序列，引物序列为：
IN-1：5’-CGGCTAGCAAACACGGGAGGTCAAAG-3’
IN-2：5’-AATTGTTCCAAAGTGACTGG-3’
扩增人转铁蛋白外显子1和内含子1的反应体系如表2所示，PCR反应条件为：94℃5min；(94℃45sec，55℃45sec，72℃2min)×35个循环；72℃10min。
表2扩增人转铁蛋白外显子1和内含子1的反应体系
  10×PCR buffer  2.5μL  dNTP(2.5mM)  2μL  IN-1  1μL  IN-2  1μL  人基因组DNA(约100ng/L)  1uL  Ex Taq E(5U/L)  0.2μL  H₂O  17.3μL  V总  25μL
将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图3所示，M为1Kb分子量标准，1为扩增条带，可见扩增出特异性的2.35Kb长的条带，符合预期，经测序验证，获得的条带包含人转铁蛋白外显子1和内含子1。
实施例3、扩增RP启动子
采用酚/氯仿法，从新西兰白兔外周血中提取兔基因组DNA，使用RTF-1/2从兔基因组DNA中扩增兔转铁蛋白基因启动子，引物序列为：
RTF-1：5’-CACGCTCCGGTCCAGCAG-3’
RTF-2：5’-CTTGTAGCTCAGGGGTGGTGGC-3’
PCR扩增的退火温度从57-67℃不等，反应体系如表3所示，反应条件为：94℃5min；(94℃45sec，57-67℃45sec，72℃45sec)×35个循环；72℃10min。
将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图4所示，M为1Kb分子量标准，条带上方的数字为PCR扩增的退火温度，可见当温度为67℃时即可扩增出特异性的226bp长的条带，经测序验证，获得的条带为兔转铁蛋白启动子。
表3扩增兔转铁蛋白基因启动子的反应体系
  10×PCR buffer  2.5μL  dNTP(2.5mM)  2μL  RTF-1  1μL  RTF-2  1μL  兔基因组DNA(约100ng/L)  1μL  Ex Taq E(5U/L)  0.2μL  H₂O  17.3μL  V总  25μL
实施例4、扩增兔转铁蛋白增强子
采用酚/氯仿法，从新西兰白兔外周血中提取兔基因组DNA，使用RTFE-1/2扩增兔转铁蛋白基因增强子，退火温度梯度从57-67℃。引物序列为：
RTFE-1：5’-GGCACCAACTGCAGCAGACA-3’
RTFE-2：5’-TTCAGTTCCAGACCAACACAAGCAT-3’
反应体系如表4所示，反应条件为：94℃5min；(94℃45sec，57-67℃45sec，72℃45sec)×35个循环；72℃10min。
表4扩增兔转铁蛋白基因增强子的反应体系
  10×PCR buffer  2.5μL  dNTP(2.5mM)  2μL  引物1  1μL  引物2  1μL  兔基因组DNA(约100ng/L)  1μL  Ex Taq E(5U/L)  0.2μL  H₂O  17.3μL  V总  25μL
将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图5所示，M为1Kb分子量标准，条带上方的数字为PCR扩增的退火温度，可见当温度＞64℃时即可扩增出特异性的261bp长的条带。回收扩增获得的261bp长的条带，经测序验证，获得的条带为兔转铁蛋白增强子。
实施例5、构建人转铁蛋白表达载体
5.1构建pcDNA3.1-TFN载体
将实施例2中的PCR产物依次接入pGEM-T载体中，分别得到pGEM-T-TFcDNA和pGEM-T-TF exon I+intron I。如图6所示，将pGEM-T-TFcDNA使用Mlu I+Spe I将片段切下，装入用相同酶切的pSL301载体，获得pSL301-TF。然后将pGEM-T-TFcDNA采用Nhe I+Nde I双酶切，将切下的片段装入同样用Nhe I+Nde I酶切的pSL301-TF载体中，构成pSL301-TFN。最后将pSL301-TFN用Sal I+Sfi I双酶切后补平，并装入用EcoR V酶切的pcDNA3.1载体中，获得pcDNA3.1-TFN(简称3.1-TFN)载体。获得的结果经酶切鉴定，结果符合预期。
5.2构建δ3.1-2EP-TFN载体
如图7a所示，首先，将PCR扩增的兔TF启动子装入pGEM-T easy载体，接着将该载体和pSL301载体分别用Sac II和Xho I双酶切，将启动子装入pSL301载体，构成301-RTF载体，如图7b所示。
如图7c所示，将PCR扩增的兔TF增强子装入pGEM-T载体，构成T-RTFE载体。然后将301-RTF载体用Apa I/Sac II双酶切，将两个T-RTFE载体分别用Apa I/Not I双酶切和Sac II/Not I双酶切，进行3片段连接，形成pSL301-2EP载体，如图7d所示。接着将pSL301-2EP载体和δpcDNA3.1分别用Apa I/Xho I双酶切，连接后形成δ3.1-2EP载体，如图7e所示。最后将δ3.1-2EP载体和3.1-TFN载体均用Xho I/Afl II双酶切，连接后形成δ3.1-2EP-TFN载体，如图7f所示。
质粒构建完成后分别用BamH I、EcoR I和Hind III等酶鉴定，37℃酶切2hr，酶切反应体系如表5所示。
鉴定结果如图8所示，M为1Kb分子量标准；H为Hind III，E为EcoR I，B为BamH I酶切。酶切结果显示载体采用Hind III酶切后可得到1.8Kb+7.8Kb的片段；采用EcoR I酶切可得到3.2Kb+6.4Kb的片段；而用BamH I酶切可得到9.6Kb的片段，均与预期相符。
表5酶切鉴定反应体系
  10×buffer  2μL  质粒DNA  1μL  内切酶  0.5μL  H₂O  16.5μL  V总  20μL
5.3构建δ3.1-EP-TFN载体
如图9所示，为构建δ3.1-EP-TFN载体，将pSL301-2EP载体用Not I/Sac II双酶切，补平、去磷酸化后进行自连接，形成pSL301-EP载体。接着将pSL301-EP载体和δpcDNA3.1分别用Apa I/Xho I双酶切，连接后形成δ3.1-EP载体。最后将δ3.1-EP载体和3.1-TFN载体均用Xho I/Afl II双酶切，连接后形成δ3.1-EP-TFN载体。
质粒构建完成后分别用BamH I、EcoR I和Hind III等酶鉴定。结果如图10所示，M为1Kb分子量标准；H为Hind III，E为EcoR I，B为BamH I酶切。酶切结果显示载体采用Hind III酶切后可得到1.8Kb+7.6Kb的片段；采用EcoR I酶切可得到3.2Kb+6.2Kb的片段；而用BamH I酶切可得到9.4Kb的片段，均与预期相符。
实施例6、转染BRL-3A细胞
配置转染液，方法如下：
将100μL B液分别加入到A液中，轻轻摇匀，室温静置20min制得转染液，其中，A液为1.6μg人转铁蛋白表达载体(分别为δpcDNA3.1-2EP-TFN、δpcDNA3.1-EP-TFN、δpcDNA3.1-RP-TFN)质粒DNA，用Opti-MEM培养液分别定容到100μL，轻摇。室温放置5min；B液为3μL LipofectamineTM 2000用Opti-MEM培养液定容到100μL，轻摇。室温放置5min。
将BRL-3A细胞接种在6孔板中，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基(含青链霉素)在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下培养。转染前，倾去细胞悬液，用1mL不含血清的1640培养液漂洗细胞二次，倾去培养液。每孔中加入200μL转染液，前后摇几次，使转染液完全覆盖细胞。每种质粒均平行转染3个孔，同时以转染空质粒的孔作为阴性对照。
于37℃，5％CO₂下培养6h后，吸除转染液，加0.5mL完全培养液(含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基)，在37℃，5％CO₂及饱和湿度下继续培养。66h后收集细胞上清液，稍离心，去除细胞悬液中的残留细胞，供ELISA测定。
实施例7、测定细胞上清液中hTF的表达水平
采用ELISA法检测细胞上清液中的hTF。
将鼠抗人hTF抗体用0.2M碳酸盐缓冲液(pH 9.6)1∶1000稀释，酶标板中每孔加入120mL上述稀释的抗体，在37℃进行包被。2h后，取出酶标板，倾去包被抗体，用含有0.5％Tween20的PBS室温洗涤5次，每孔中加入150mL含2％BSA的PBS 4℃封闭过夜。然后倾去封闭液，用含有0.5％Tween20的PBS洗涤液洗涤4次，每孔依次加入100mL PBS(空白对照)、hTF浓度为1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.3ng/mL、15.6ng/mL的标准品，以及待测的细胞上清液，37℃温育。2h后，倾去样品，洗涤5次，在每孔中加入100mL用含2％BSA的PBS 1∶1000稀释的生物素标记的一抗鼠抗人hTF抗体，37℃孵育。2h后，倾去一抗，洗脱5次，在每孔加入100mL用含2％BSA的PBS1∶1000稀释的二抗羊抗生物素抗体，37℃孵育2h后，倾去二抗，洗涤5次，在每孔加入100mL TMB显色，待标准品显色梯度明显后加入100mL 1M H₂SO₄终止反应，用酶标仪读取数据，结果如图11所示。
结果显示分别采用δpcDNA3.1-2EP-TFN、δpcDNA3.1-EP-TFN、δpcDNA3.1-RP-TFN等三种不同的载体转染的细胞，其上清液中hTF的表达水平有明显差异，在兔转铁蛋白启动子中加入增强子后hTF的表达有显著性提高，增强子的作用相当明显，统计学检验后发现存在显著性差异(P＜0.05)。
实施例8、制备、鉴定转基因小鼠
8.1扩增纯化质粒
分别大量扩增表达载体δpcDNA3.1-2EP-TFN、δpcDNA3.1-EP-TFN、δpcDNA3.1-RP-TFN。按EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN公司)方法提取纯化质粒。将质粒DNA用Sal I(Takara，10U/μL)进行酶切线性化，反应体系为：
质粒DNA 30μg；10×H buffer 10μL；Sal I 3μL；H₂O补足至150μL。
于37℃水浴酶切2h，进行普通凝胶电泳，在长波紫外灯下切下7.2Kb和6.9Kb的目的片段，尽量切去无用凝胶，装入预先称重的EP管，片段依次采用QIAquickGel Ekatraction Kit(QIAGEN公司)和S&S Elutip minicolumns(Schleicher &Schuell公司)进行纯化。
质粒DNA经三次纯化最终得到40-60ng/μL高纯度的目的片段，-20℃保存。显微注射前将质粒DNA稀释成4ng/μL，同时离心10min，将DNA溶液上层的80-90％转移入新的EP管。
8.2制备转基因小鼠
采用原核显微注射的方法分别制备整合δpcDNA3.1-RP-hTF、δpcDNA3.1-EP-hTFN和δpcDNA3.1-2EP-hTFN载体的转基因小鼠，分别命名为RTF、EPTF和2EPTF。
利用显微注射仪，将质粒DNA溶液分别注射到小鼠受精卵的雄原核，随后将注射完毕的受精卵置于37℃的5％CO₂培养箱中培养一段时间，选出完整的受精卵，将其直接移植到假孕母鼠的输卵管。移植后18-21天，母鼠即可分娩出转基因小鼠。
8.3鉴定转基因小鼠
待转基因小鼠生长至21天时，剪取1cm尾组织，提取鼠基因组DNA。
PCR扩增，引物序列分别为
hTF-1：5’-TGGATGCCAAGATGTACCTG-3’
hTF-2：5’-CGCCTGTGTAGCCGTAGTAT-3’
PCR反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL；dNTP(2.5mM)2μL；引物11μL；引物21μL；鼠基因组DNA(约100ng/L)1μL；Ex Taq E(5U/L)0.2μL；H₂O 17.3μL，混匀后瞬间离心。反应条件：94℃5min；(94℃1min，55℃45sec，72℃1min)×32个循环；72℃10min。
取8mL PCR产物，经2％Agarose凝胶电泳检测，统计结果如表6所示，表明通过显微注射每种表达载体均获得了多个转基因小鼠。
表6转基因小鼠汇总表
  转基因小鼠简称  调控元件  转基因小鼠  整合率  2EPTF  EPTF  RTF  2×兔TF增强子+启动子  兔TF增强子+启动子  兔TF启动子  7(3♂+4♀)  8(4♂+4♀)  6(3♂+3♀)  11.9％  17.0％  9.1％
实施例9、测定转基因小鼠血浆中hTF的表达水平
所有的转基因小鼠均在长至3月龄时采集外周血，采用ELISA法(方法与实施例7相同)测定血浆中hTF的表达水平，每个样品重复测定2次，如图12所示，结果表明在兔转铁蛋白启动子前加入增强子后血浆中hTF平均表达水平有明显提高，表明在个体水平上增强子对提高hTF的表达作用相当明显，统计学检验后发现差异极显著(P＜0.01)。
综上所述，载体δpcDNA3.1-2EP-TFN、δpcDNA3.1-EP-TFN转染BRL-3A细胞的上清液中以及制备的转基因小鼠的血浆中hTF表达水平明显提高，表明本发明构建的人转铁蛋白表达载体在制备人转铁蛋白的应用中，可高效表达人转铁蛋白。
序列表
<110>上海市儿童医院，上海滔滔转基因工程股份有限公司
<120>一种人转铁蛋白的表达载体及其构建方法和应用
<130>P5091062
<160>5
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>4119
<212>DNA
<213>人
<400>1
gctcagcgcc gcacccggag gatgaggctc gccgtgggag ccctgctggt ctgcgccgtc     60
ctgggtgagt gcgggcacgg ggtagcaccg cagagtcgct ggcccgcgcg ttccctgcaa    120
cccgggcggc caccgcgcag cctgcatgca ctccgcgctc aggctggaag cctgggtgtc    180
tgggtgcctt tccattgcct ctctacgccc cacccctggc ctttgcttgg gcttctagac    240
acctttcact gcactcactg tcttctcccc ctcctcctct ttgtccagta aatcttgcag    300
cagtgaaata caataaatca gagcacgtct aaccaggtta tcaaaaccct ttgctgctgc    360
ctcttgtcaa gtccgaactc cttagcatgg cattcaaggc ctcccgggtc tgaccattcc    420
cctttcagag gctgacgtcc cctgggtgcc ctgggagctg tagatgtcct gccaaggaag    480
cggtgccatc gagcggtcag agcatggggt ttgaagccag acttcttgga tccaagtcct    540
ggccggctcc tcaccaggga gggggtcatc acagcacttg cctgggaggg tcaaatgagg    600
gtcagcgagg tggcagatgc tgagtaccag tggcagatgt tgcacacatc ctgctatggg    660
gcagtggctg acgccacact ccccgacctc ctgaggtggg gcccccttca tactctaact    720
tctgcctgcc attcatgggg catttgtcac actgttgggg cttccacgtt tagttttctc     780
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