一种手性-羟基酯类化合物的酶催化合成方法.pdf

本发明涉及一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法，合成路线如式（1）所示。通过使化合物i与化合物ii在0℃~室温、吡啶做缚酸剂的条件下反应，所得产物经萃取浓缩后再在R2OH中回流，然后重结晶得化合物iii；再将化合物iii、酮还原酶以及辅酶一起加入pH=6~8的磷酸缓冲液中，15~40℃下反应2~24小时，得到本发明的手性β-羟基酯类化合物iv。本发明采用酶催化合成方法制得手性β-羟基酯类化合物，无需使用昂贵的手性试剂，具有生产工艺条件温和、原料易得、转化率高、生产成本低等诸多优点，宜于大规模工业化生产。

1.一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法，其特征在于：合成路线和步骤如下：1）、使化合物(i)与化合物(ii)在0℃~室温、吡啶做缚酸剂的条件下反应，所得产物经萃取浓缩后再在ROH中回流，然后重结晶得化合物(iii)；2）、将化合物(iii)、酮还原酶以及辅酶一起加入pH=6~8的磷酸缓冲液中，15~40℃下反应2~24小时，得到所述手性β-羟基酯类化合物(iv)；其中，按质量计，酮还原酶在反应体系中的加入量与化合物(iii)的加入量的比为1~10:1；所述辅酶为或。 2.根据权利要求1所述的酶催化合成方法，其特征在于：所述化合物(i)至化合物(iv)中的R和R各自独立地选自烷基或芳基。 3.根据权利要求2所述的酶催化合成方法，其特征在于：所述化合物(i)至化合物(iv)中的R选自碳原子3~15之间的饱和烷基，R选自碳原子在1~6之间的饱和烷基。 4.根据权利要求3所述的酶催化合成方法，其特征在于：所述化合物(i)至化合物(iv)中的R选自CH-，R选自CH-。 5.根据权利要求1所述的酶催化合成方法，其特征在于：步骤2）的反应体系中还加入了用于辅酶再生的辅酶再生系统，所述辅酶再生系统选自如下几种辅酶再生系统中的一种：①葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、②异丙醇、③甲酸铵和甲酸铵脱氢酶。 6.根据权利要求1所述的酶催化合成方法，其特征在于：步骤2）的反应体系中还加入了助溶剂，所述助溶剂为。

技术领域

本发明属于化学合成领域，具体涉及一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法。 

背景技术

手性β-羟基酯类化合物的一项重要用途是作为合成药物奥利司他（Orlistat）的中间体。奥利司他是一种脂肪酶抑制剂。它在胆汁盐的参与下，与胃肠道脂肪酶形成无活性的中间体，对酶产生不可逆抑制，从而削弱脂肪的消化和吸收，使肠道内长期处于油相状态，使胆固醇隔离出来并经粪便排泄，从而减少热量摄入，控制体重。奥利司他（Orlistat）以其独特的生物活性被各国研究者广泛的研究，并于1999年6月被批准上市。

瑞士的弗·哈弗曼-拉罗切有限公司在中国申请的一项专利中公开了制备奥利司他中间体的合成路线（专利申请号01111916.0）。具体做法是：先将5,6-二氢吡喃-2-酮氢化还原，然后将生成的手性δ-内酯在碱性条件下进行开环反应并分离，得到β-羟基酯类的奥利司他中间体。开环反应时，还需要用手性试剂（PG）与5位羟基反应，将5位羟基保护起来，同时使得β-羟基具有手性。如该专利中所描述的，这种利用化学合成方法合成手性β-羟基酯化合物的方法在产业上并不实用和经济，原因是：1）合成路线长，使β-羟基酯的生产成本高；2）控制5位羟基的手性试剂比较昂贵，导致这种合成路线的实用价值较低。因此，开发一种高效、低成本且易于产业化生产的手性β-羟基酯化合物的合成方法是十分有必要的。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法，合成路线和步骤如下：

1）、使化合物(i)与化合物(ii)在0℃~室温、吡啶做缚酸剂的条件下反应，所得产物经萃取浓缩后再在R 2 OH中回流，然后重结晶得化合物(iii)；

2）、将化合物(iii)、酮还原酶以及辅酶一起加入pH=6~8的磷酸缓冲液中，15~40℃下反应2~24小时，得到所述手性β-羟基酯类化合物(iv)；其中，按质量计，酮还原酶在反应体系中的加入量与化合物(iii)的加入量的比为1~10:1；所述辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）。

优选地，所述化合物(i)至化合物(iv)中的R 1 和R 2 各自独立地选自烷基或芳基。

进一步地，所述化合物(i)至化合物(iv)中的R 1 选自碳原子3~15之间的饱和烷基，R 2 选自碳原子在1~6之间的饱和烷基。

本发明的一个具体实施方式是，所述化合物(i)至化合物(iv)中的R 1 选自C 11 H 23 -，R 2 选自CH 3 -。

优选地，步骤2）的反应体系中还加入了用于辅酶再生的辅酶再生系统，所述辅酶再生系统选自如下几种辅酶再生系统中的一种：①葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、②异丙醇、③甲酸铵和甲酸铵脱氢酶。

优选地，步骤2）中还加入了助溶剂，所述助溶剂选自二甲亚砜、乙二醇、聚乙二醇400（即PEG400）和甘油中的一种或多种的混合物。

由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：

本发明采用酶催化合成方法制得手性β-羟基酯类化合物，无需使用昂贵的手性试剂，具有生产工艺条件温和、原料易得、转化率高、生产成本低等诸多优点，因此具有很高的实用价值。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但不限于这些实施例。

本发明的一种具体实施方式是用酶催化合成方法制备出一种用于合成奥利司他的中间体(S)-3-羟基十四碳酸甲酯，具体步骤如下： 

1）、使月桂酰氯Ⅰ与丙二酸环亚异丙酯Ⅱ在0℃至室温、吡啶做缚酸剂、二氯甲烷做溶剂的条件下反应2小时左右，所得产物经萃取浓缩，再加入甲醇中回流4~6小时，然后重结晶，得到月桂酰乙酸甲酯Ⅲ。合成路线如下： 

2）、将步骤1）得到的月桂酰乙酸甲酯Ⅲ、酮还原酶和辅酶一起加入pH=6~8的磷酸缓冲液中，15~40℃下反应2~24小时，得到光学纯的(S)-3-羟基十四碳酸甲酯Ⅳ。其中，酮还原酶的加入量为1~50g/L，月桂酰乙酸甲酯Ⅲ的加入量为1~10g/L，辅酶可选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）。反应体系中还加入了助溶剂二甲亚砜和用于辅酶再生的辅酶再生系统，且二甲亚砜的加入量为10~300mL/L，合成路线如下：

本发明中的辅酶再生系统可选自如下几种辅酶再生系统中的一种：①葡萄糖和葡萄糖脱氢酶、②异丙醇、③甲酸铵和甲酸铵脱氢酶。

本发明中使用的酮还原酶、葡萄糖脱氢酶和甲酸氨脱氢酶均可通过发酵大量制备，是相对易得和廉价的催化剂，这些酶均由市购得到。其中，酮还原酶的来源可以参考文献(Acc. Chem. Res. 2007, 40, 1412-1419)。本发明中的助溶剂还可以选择乙二醇、聚乙二醇400（PEG400）和甘油等。

以下提供合成(S)-3-羟基十四碳酸甲酯的具体实施例：

实施例1

1）月桂酰乙酸甲酯的制备：

氮气保护、0℃冰浴搅拌条件下，向250mL反应瓶中加入二氯甲烷60mL、吡啶（9mL，0.1112mol）和丙二酸环亚异丙酯（8g，0.0556mol）。向反应液中缓慢滴加月桂酰氯（13.6mL，0.059mol），在0℃冰浴中搅拌反应混合液10min，反应液慢慢升至室温，继续搅拌2h。反应完毕后将反应混合液依次用盐酸（1M）、水、饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥、过滤，再浓缩。

将浓缩物溶于甲醇（50mL），加热回流反应液5h，然后使反应液慢慢降至室温，再在-30℃的低温下重结晶，得浅黄色固体，即为月桂酰乙酸甲酯。

）(S)-3-羟基十四碳酸甲酯的制备：

向2L反应瓶中加入2.2g月桂酰乙酸甲酯（8.594mmol）、100mL二甲亚砜、1L磷酸盐缓冲溶液（Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 ，0.25M，pH=7.0）、10g酮还原酶ADH-RE、4g葡萄糖、15g葡萄糖脱氢酶和0.01g 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（一种辅酶，即NADP），在35℃水浴条件下搅拌，反应6h后得到光学纯的(S)-3-羟基十四碳酸甲酯。取样进行GC分析，转化率为91.8%；进行HPLC分析，ee值大于99%。

实施例2

1）月桂酰乙酸甲酯的制备：

同实施例1。

）(S)-3-羟基十四碳酸甲酯的制备：

向10L反应瓶中加入9.4g月桂酰乙酸甲酯、0.6L二甲亚砜、6L磷酸盐缓冲溶液（Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 ，0.1M, pH=7.0）、60g酮还原酶ADH-RE、20g葡萄糖、65g葡萄糖脱氢酶和0.05gNADP，在35℃水浴条件下搅拌，反应12h后得到光学纯的(S)-3-羟基十四碳酸甲酯。取样进行GC分析，转化率为>90%；进行HPLC分析，ee值大于>95%。

实施例3

1）月桂酰乙酸甲酯的制备：

同实施例1。

）(S)-3-羟基十四碳酸甲酯的制备：

向25mL反应瓶中加入32mg月桂酰乙酸甲酯、0.5mL二甲亚砜、10mL磷酸盐缓冲溶液（Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 ，0.2M， pH=7.0）、48mg酮还原酶ADH-T、5mg异丙醇和1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（一种辅酶，即NAD），在35℃水浴条件下搅拌，反应24h后得到光学纯的(S)-3-羟基十四碳酸甲酯。取样进行GC分析，转化率为>88%；进行HPLC分析，ee值大于>80%.

实施例4

1）月桂酰乙酸甲酯的制备：

同实施例1。

）(S)-3-羟基十四碳酸甲酯的制备：

向25mL反应瓶中加入25mg月桂酰乙酸甲酯、1mL二甲亚砜、10mL磷酸盐缓冲溶液（Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 ，0.2M，pH=7.0）、25mg酮还原酶ADH-RE、7.56mg甲酸铵、25mg甲酸铵脱氢酶和0.6mg NAD，30mL PEG 400。在35℃水浴条件下搅拌，反应23h后得到光学纯的(S)-3-羟基十四碳酸甲酯。取样进行GC分析，转化率为75%；进行HPLC分析，ee值大于>80%。

实施例5

1）月桂酰乙酸甲酯的制备：

同实施例1。

）(S)-3-羟基十四碳酸甲酯的制备：

向25mL反应瓶中加入15mg月桂酰乙酸甲酯、1mL二甲亚砜、10mL磷酸盐缓冲溶液（Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 ，0.2M，pH=7.0）、25mg酮还原酶ADH-T、0.5mg甘油、0.4mg NADP，在35℃水浴条件下搅拌，反应23h后得到光学纯的(S)-3-羟基十四碳酸甲酯。取样进行GC分析，转化率为75%；进行HPLC分析，ee值大于>74%.

以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。