本申请要求2010年11月8日提交的美国临时专利申请第61/259173号的优先权，其通过引用整体并入本文。
本文公开的工作部分得到来自NewJerseyCommissiononSpinalCordResearch(NJCSCR)的基金第04-023-SCR2号的支持。
发明领域
本申请至少部分涉及向人或动物患者的脊髓施用小干扰RNA(siRNA)的方法，并且还涉及治疗脊髓损伤和神经性疼痛的方法。具体地，本申请公开了预防和治疗神经性疼痛和异常性疼痛的方法和治疗受损伤的脊髓以促进CNS功能恢复的方法。
背景
siRNA代表有希望的治疗技术，然而在向患者施用siRNA中还存在待克服的障碍。已采用各种技术来将siRNA引入细胞中，包括阳离子脂质介导的转染、病毒递送和核转染。使用阳离子脂质的递送看来是最简单的转染方法，然而其效率通常是低的并限制于特定细胞类型。虽然病毒递送很好地用于一些困难的细胞、细胞系和用于体内递送(Garraway等，2007，JPharmacolExpTher.322：982-8)，其具有增加的安全顾虑。未修饰的siRNA单链或双链体在血清中极不稳定，单链的半衰期小于1分钟，而双链体的半衰期为3.3到5分钟(Sioud，2005.CurrDrugTargets.6：647-53；Sioud和Iversen，2005.CurrDrugTargets.6：647-53)。然而，siRNA的化学修饰已展现出稳定性显著改善；修饰的siRNA比未修饰的siRNA稳定性增加大约900倍(Morrissey等，2005.NatBiotechnol.23：1002-7)。转让给本发明申请人的PCT专利公布WO2008/050329和WO2009/044392公开了某些稳定的和活性的siRNA化合物，所述专利公布通过引用整体并入本文。
由于血脑屏障(BBB)，siRNA向中枢神经系统(CNS)的递送是成问题的，并且最成功的策略是使用鞘内路径。经由微泵向啮齿类动物大脑中脑室内输注高浓度的裸露的siRNA已成功抑制了靶基因表达，然而，在远离输注位点的区域，靶基因表达的敲低显著下降(Thakker等，2004.ProcNatlAcadSciUSA.101：17270-5)。使用连接至微型渗透泵的腰椎留置插管，在脊髓中鞘内应用高剂量(400μg/天)siRNA沉默了ATP-门控的阳离子通道P2X3，并缓解了慢性神经性疼痛(Dorn等，2004.NucleicAcidsRes.32：e49)。其他研究在鞘内递送后实现了治疗作用：以显著较低的剂量在ALS进展的慢性小鼠模型中使用植入的Alzet泵(Wang等，2008.JBiolChem.283：15845-52)以及在急性疼痛模型中采用预治疗(Christoph等，2006.BiochemBiophysResCommun.350：238-43；Luo等，2005.MolPain.1：29)。Rohl和Kerreck综述了疼痛模型中的各种RNAi方法(J.Neurochem.99：371-380)。Inoue暗示神经性疼痛中RhoA的活化(Inoue等，2004.NatMed10(7)：712-8)。
对脊髓的挫伤性损伤产生对组织的初级损害，并启动称为次级损伤的级联事件，次级损伤经数天至数周以几个阶段进展(Beattie等，2000.JNeurotrauma.17：915-25)。脊髓内的小胶质细胞在损伤后被快速活化。在大鼠中，活化的巨噬细胞在脊髓损伤后3天开始积累(Schwab等，2004.Glia.47：377-86)。在SCI后的前几天，损伤位点中和周围存在大量细胞死亡，以及神经元的轴突过程从损伤位点死亡。这些过程伴有复杂的分子变化，包括在神经细胞(D′Alessandri等，1995.Curr.EyeRes.14：911-926；Dubreuil等，2003.JCellBiol.162：233-43；Erschbamer等，2005.JCompNeurol.484：224-33；Yune等，2007..JNeurosci.27：7751-61)和免疫细胞(Fu等，2007.JNeurosci.27：4154-64；Pixley等，2005JCellSci.118：1873-83；Schwab等，2004)二者中RhoA的上调和活化，这被认为促成了次级损害以及限制轴突再生和功能恢复。细胞穿透性Rho拮抗剂(如BA-210)，其抑制磷酸化的包括RhoA在内的Rho家族蛋白的活性，显示在啮齿类动物中改善脊髓损伤后的恢复(Lord-Fontaine等，2008.JNeurotrauma.25：1309-22)，并正在临床测试中测试以促进轴突再生和功能恢复(Baptiste等，2009.ExpertOpinInvestigDrugs.18：663-73)。RhoA蛋白水平上调数倍，在脊髓挫伤后～7天在大鼠脊髓中达到其最高水平，提供了用于SCI后治疗干预的窗口(Erschbamer等，2005同上)。然而，发现RhoA的BA-210抑制最多仅至急性治疗后4天而不是一周(Lord-Fontaine等，2008)，此时RhoA表达是稳健的(Erschbamer等，2005)。靶向递送siRNA至CNS的方法和靶细胞中增强的活性将是期望的。
疼痛是疾病最常见的症状，并且是患者向医师呈现的最经常的不适。不适当的疼痛管理仍是大的公共健康问题。异常性疼痛/SCI相关的疼痛的目前可用的治疗选择是有限的，并且因为许多SCI疼痛病症不易于治疗，特别是处于损伤水平(at-level)和损伤水平以下(below-level)神经性疼痛，管理变得主要是针对症状的。因此需要用于治疗异常性疼痛/SCI相关的疼痛的解决方案。
发明概述
本文提供了治疗中枢神经系统疾病、疾患和损伤的方法。本申请公开了在不存在转导载体(transductionvehicle)、递送载体(deliverycarrier)或递送系统下向受治疗者中的受损或病态脊髓递送siRNA的方法，并提供了治疗中枢神经系统的疾病、疾患和损伤(包括脊髓损伤、神经变性和神经性疼痛)的方法。
在一方面，提供了治疗患有与靶基因的表达有关的CNS疾病、疾患或损伤的受治疗者的方法，包括以有效治疗受治疗者的量局部地向受治疗者的脊髓施用定向至靶基因的双链RNA化合物。在一些实施方案中，实质内施用和/或通过腰椎注射施用双链RNA化合物。在一些实施方案中，实质内施用双链RNA化合物。在优选的实施方案中，通过腰椎注射施用双链RNA化合物。在一些实施方案中，通过在损伤或疾病发作后0至48小时腰椎穿刺向受治疗者施用双链RNA。在一些实施方案中，通过在损伤或疾病发作后0至42小时、0至36小时、0至30小时或0至24小时腰椎穿刺向受治疗者施用双链RNA。
在一些实施方案中，受治疗者患有疼痛。在不同的实施方案中，疼痛是神经性疼痛。在特定的实施方案中，提供了治疗或预防受治疗者中的神经性疼痛的方法，包括以有效治疗或预防受治疗者中的神经性疼痛的量向受治疗者施用定向至选自RhoA或TLR4的靶基因的双链RNA化合物。在优选的实施方案中，双链RNA化合物通过腰椎注射施用。
在一些实施方案中，神经性疼痛是疱疹后神经痛、三叉神经痛和与选自由以下组成的组的病症有关的神经性疼痛：疱疹、HIV、外伤性神经损伤、中风、缺血后(post-ischemia)、纤维肌痛、反射性交感神经营养不良、复杂区域性疼痛综合征、脊髓损伤、坐骨神经痛、幻肢痛、糖尿病性神经病变和癌症化疗诱导的神经性疼痛。
在一些实施方案中，双链RNA是siRNA。在优选的实施方案中，siRNA化合物作为裸露的siRNA施用。
在一些实施方案中，siRNA是合成的、化学修饰的siRNA。在一些实施方案中，CNS疾病、疾患或损伤与选自以下的基因的表达有关：伤害性感受器特异基因或伤害性感受神经元中表达的基因。在一些实施方案中，CNS疾病、疾患或损伤与选自以下的基因的表达有关：APP、MAPT、SOD1、BACE1、CASP3、TGM2、NFE2L3、TARDBP、ADRB1、CAMK2A、CBLN1、CDK5R1、GABRA1、MAPK10、NOS1、NPTX2、NRGN、NTS、PDCD2、PDE4D、PENK、SYT1、TTR、FUS、LRDD、CYBA、ATF3、ATF6、CASP2、CASP1、CASP7、CASP8、CASP9、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、ANXA2、RHOA、DUOX1、RTP801、RTP801L、NOX4、NOX1、NOX2(gp91pho、CYBB)、NOX5、DUOX2、NOXO1、NOXO2(p47phox、NCF1)、NOXA1、NOXA2(p67phox、NCF2)、p53(TP53)、HTRA2、KEAP1、SHC1、ZNHIT1、LGALS3、HI95、SOX9、ASPP1、ASPP2、CTSD、CAPNS1、FAS和FASLG、NOGO和NOGO-R；TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL1bR、MYD88、TICAM、TIRAP、HSP47。
在一些实施方案中，本文公开的方法导致具有SCI的受治疗者中某些丧失的功能(包括运动功能)的恢复。运动功能包括使用臂和腿，包括重新获得行走功能。在一些实施方案中，该方法导致患有CNS的疾病、疾患或损伤的受治疗者中白质的保留。在一些实施方案中，该方法阻抑SCI诱导的神经性疼痛或异常性疼痛。在一些实施方案中，该方法预防具有SCI的受治疗者中的异常性疼痛。
不希望受理论束缚，当根据本方法施用时，siRNA在CNS组织中快速扩散，并被包括神经元、星形胶质细胞、巨噬细胞和内皮细胞的多种细胞类型摄取，并在治疗后一周时降低SCI诱导的靶蛋白(即表A中的靶基因)的增加。
本发明的其他目标、特征和优点将从以下描述和实施例中是清楚的。
附图简述
图1A-1F：SCI中的siRNA摄取。SCI和在3个位点(冲击位点中央以及2mm嘴侧(rostral)和尾侧(caudal))以1μl的1μg/μlCy3.5-siRNA实质内注射后3天拍摄的显微照片(图1A)，每个实质内注射均在1mm深度。摄取是广泛的，在远至距注射位点5mm嘴侧和尾侧鉴定到标记的细胞。显微照片显示分析的不同细胞类型的实例，包括运动神经元(图1B)、巨噬细胞(图1C)、轴突(图1D)和内皮细胞(图1E)。比例尺＝20um(微米)。图1F中的表格总结了不同孵育时间时每种标记的细胞类型的相对发生率(罕见，+至频繁，++++)。
图2A-2B.siRhoA在体外的活性和稳定性。在使用LipofectamineTM2000转染到HeLa和REF52细胞后使用qPCR定量siGFP和siRhoA对RhoAmRNA的效应。垂直轴显示作为对照模拟转染细胞的百分比的RhoAmRNA量(图2A)。将1μgsiRhoA的等份在20L完全大鼠CSF中在37℃孵育不同时间间隔，然后非变性20％聚丙烯酰胺凝胶电泳上分析(图2B)。使用溶解在PBS中的相似量的siRhoA用于体积控制。
图3A-3C.siRNA治疗对RhoA蛋白和SCI后功能恢复的效应。在3个位点将三(3)μg的siRhoA或siGFP注射到实质组织中，然后在SCI的大鼠MASCIS模型中使用12.5重物坠落(weightdrop)挫伤脊髓。在SCI和治疗后一周，siRhoA治疗的大鼠显示用针对RhoA的抗体的降低的免疫印迹；同一泳道的GAPDH的免疫印迹证实相等的蛋白上样(图3A)。使用12.5和25mm重物坠落检验了与siGFP对照相比3ugsiRhoA脊髓内注射的治疗效应。当通过ANOVA事后重复测量来分析时，siRhoA治疗的大鼠显示在12.5mm挫伤损伤(图3B)中与siGFP对照相比显著的(p-值＝.0098)运动器BBB改善(n＝6)。对于更严重的25mm挫伤损伤(图3C)观察到了运动器改善的相似趋势，但是观察到的差异不是统计学显著的(n＝6)。
图4.在中央5mmSCI位点通过免疫印迹测量的siRNA治疗对RhoA蛋白的效应。在SCI的MASCIS模型中使用12.5重物坠落的挫伤后立即将3μg的siRhoA或siGFP注射到实质组织(如图3中的在3个位点1μg/μl的1μl脊髓内注射。在SCI和治疗后一周，siRhoA治疗的大鼠显示当归一化为同一泳道中的GAPDH的强度时降低的用针对RhoA蛋白的抗体免疫印迹后的平均强度。
图5.在中央5mmSCI位点通过ELISA测量的siRNA治疗对RhoA蛋白的效应。在SCI的MASCIS模型中使用12.5重物坠落的挫伤后立即将3μg的siRhoA或siGFP注射到实质组织(在3个位点1μg/μl的1μl脊髓内注射。在SCI和治疗后一周，siRhoA治疗的大鼠显示当归一化为用仅SCI治疗的大鼠中的平均信号时降低的ELISA后的平均强度。通过与GFPsiRNA对照比较，在RhoAsiRNA治疗后检测到较低水平的RhoA蛋白。
图6A-6G.通过腰椎穿刺递送后一天Cy3.5-标记的siRNA的分布。在T9-10在12.5mmMASCIS挫伤后约24h，将Cy3.5-标记的siRNA以L3/4水平注射。荧光解剖显微镜下完整脊髓的背视图(图6A)；箭头显示腰椎穿刺的位置。在固定和低温切片后，在损伤中央(I)和在损伤位点的近端位置(P)(包括图6B中的颈区)(位置未在图6A中显示)，和远端位置(D-)拍摄横切片，如所示的(图6B-6G)。在损伤位点的灰质中观察到标记的siRNA，并在近端区域非常微弱地观察到标记的siRNA(图6B)。在远端区域(图6E-6G)，Cy3.5-标记的siRNA主要在脊髓的表面周围、在中央管中和在灰质中定位。
图7A-7B.经由腰椎穿刺注射siRNA后3天RhoAmRNA的抑制。用MASCIS冲击、使用12.5mm重物坠落(Hasegawa等，2005)使大鼠受损伤，并在一天后经由腰椎穿刺注射siRNA。图7A显示在中度挫伤损伤后第4天损伤位点(I)的RhoA的基因表达水平(如通过q-RTPCR测量的)被使用腰椎穿刺施用时的siRhoA治疗显著降低(仅SCI：n＝5；对照siRNA：n＝8；30ugsiRhoA：n＝5和100ugsiRhoA：n＝5)。图7B显示，在中度挫伤损伤后第4天损伤位点(I)的通过ELISA测量的RhoA蛋白水平也被使用腰椎穿刺施用的100ugsiRhoA显著阻抑。
图8.腰椎穿刺(L3/4)注射后大鼠后肢行走的功能恢复(BBB)。在SCI的MASCIS模型中12.5mm挫伤损伤挫伤后，siRhoA治疗显示在8周时与siGFP对照相比的改善(菱形对比三角)。
图9A-9B.SCI后腰椎施用siRhoA对异常性疼痛的效应。(图9A)在12.5mmMASCIS挫伤后一天，在腰椎管中注射siRNA，并且测量由用vonFrye纤维丝的在后肢光洁表面上的压力回缩阈值(PWT)构成(siGFPn＝7，siRhoAn＝7)；ANOVA、p＝0.0023。(图9B)在图9A中包括的同一组大鼠上进行侧后肢测试；敏感性更高，但是变化模式与对光洁爪测试观察到的变化模式平行(siGFPn＝7，siRhoAn＝7)；ANOVA，p＝0.0001。
图10.SCI和用siRNA治疗后脊髓中节约的组织的测量。在用MASCIS冲击器12.5mm挫伤并注射siRNA后，来自脊髓所示区域的横切片用LFB染色，并计算具有超阈值染色的总面积的部分。汇集来自两个8-周实验(包括用于图9中测试的大鼠中的4只大鼠)的组织。与在SCI后24小施用siGFP(n＝8)的对照相比，siRhoA组(n＝8)显示更高的LFB染色面积；ANOVA，p＝0.0006。
图11A-11D.SCI后腰椎施用siRhoA对活化的巨噬细胞和背CST的效应。在来自图9和10中分析的相同大鼠的切片上进行ED1(图11A、11B)和PKCγ(图11C、11D)的免疫染色。识别活化的巨噬细胞和小胶质细胞的ED1染色在挫伤位点四周是最强健的，与siGFP相比被siRhoA治疗降低；显示的切片是在挫伤震中的2mm嘴侧(+2)。阈值后ED1-阳性面积的定量显示与用siGFP相比，在延伸至2mm嘴侧的损伤震中用siRhoA的平均面积显著更低(ANOVA，p＝0.018)。在用ED1对PKCγ染色进行双重免疫染色后，对应于背CST的面积被圈出和放大。阈值化后，测量PKCγ面积并显示平均值(图11D)。结果显示与siGFP(n＝8)相比，在损伤震中嘴侧区域数毫米内siRhoA组(n＝8)的PKCγ信号的显著(p＝0.028)保留。来自损伤位点8mm嘴侧(+8)的切片对应于背CST的区域表现正常水平的PKCγ免疫染色。板II中的PKCγ免疫染色显示没有差异。比例尺＝500μm。
图12A-12E.siRhoA促进更高的损伤位点尾侧血清素能纤维反应性。病损远端12mm处的脊髓横切片显示siRhoA-治疗的大鼠(图12B)中比siGFP治疗的对照(图12A)中多个区域血清素能纤维的更高的强度。测量的八个区域(每个区域是167.41umX167.41um)的位置(图12C)。血清素能染色的代表性更高功率共聚焦显微图像显示纤维染色(图12D)。定量所示区域(图12C)的血清素纤维长度，发现与siGFP(n＝8)对照相比，siRhoA组(n＝8)中区域1-4、5-8和1-8中的平均值全部显著(***p＝0.018)更高(图12E)，比例尺＝50μm。
图13A-13B.显示siRhoA或siTLR4在治疗(图13A)或预防(图13B)中的效应所进行的实验的方案。SCI诱导的异常性疼痛。结果显示在图14A-14B。
图14A-14B.SCI后施用siRhoA和siTLR4对异常性疼痛的效应。(A)(B)12.5mmMASCIS挫伤后一天，在腰椎管中注射siRNA，并且测量由用vonFrye纤维丝的在后肢光洁表面上的压力回缩阈值(PWT)构成。
发明详述
本发明的代表性递送方法包括1)在稳定受损害椎骨的手术时实质内注射(LenehanB等，2010)或在脊髓上的任何其他手术，例如用于减压、肿瘤等的手术时实质内注射；和2)经由腰椎穿刺递送的推注。
定义
为方便起见，这里描述了说明书、实施例和权利要求中采用的某些术语。
应注意，如本文所用，除非内容另外清楚指明，否则单数形式“一(a)、“一(an)”和“该(the)”包括复数形式。
当以Markush组或替代的其他分组描述本发明的方面或实施方案时，本领域技术人员将认识到，也由此以该组的任何单个成员或成员的亚组描述本发明。
“抑制剂”是能够降低基因的表达或该基因的产物的活性至足以实现期望的生物学或生理学效应的程度的化合物。如本文所用的术语“抑制剂”指一种或多种寡核苷酸抑制剂，包括双链RNA和反义化合物。双链RNA包括siRNA、shRNA和miRNA。本申请包括例如针对RhoA、TLR4和其他靶基因诸如表A中公开的靶基因的反义和siRNA寡核苷酸。抑制还可称为下调，或对于RNAi，称为沉默。
如本文所用的术语”抑制”指降低基因的表达或该基因的产物的活性至足以实现期望的生物学或生理学效应的程度。抑制可以是完全的或部分的。
“脊髓损伤”或“SCI”或脊髓病是造成感觉和/或运动性损失的脊髓失调。脊髓损伤的两种常见类型是由于外伤和疾病。外伤性损伤可由以下造成：汽车事故、跌倒、枪击、潜水事故及其他外伤，和可影响脊髓的疾病，包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、脊髓空洞症、横贯性脊髓炎和弗里德赖希氏共济失调。SCI指由压迫、向脊髓神经的血液供应中断、或脊髓的断开造成的脊髓损害。SCI包括为由对脊髓本身的直接损伤造成的脊髓伤害或间接地来自对周围骨、组织、或血管的伤害的脊髓外伤。
“伤害性感受器”指响应于疼痛或压力、温度或化学品的感觉感受器。伤害性感受器通常根据其响应的环境刺激分类。一些伤害性感受器响应于多于一种刺激，并被称为多觉型的(polymodal)。与本公开特定相关的伤害性感受器是GABA能神经元中表达的伤害性感受器。(例如，参见PharmacologicalManagementOfNeuropathicPainFollowingSpinalCordInjury.BaastrupC，FinnerupNB.CNSDrugs.2008；22(6)：455-75)。
神经性疼痛的特征在于不同的症状集合，症状可包括对无害的热-机械刺激增强的敏感性、对有害的刺激的异常敏感性、压痛和自发的灼烧性疼痛。神经性疼痛还是进展性的，并通常随时间而恶化。神经性疼痛由对周围神经系统(PNS)或中枢神经系统(CNS)的损害或其中的病理学变化产生。
病理学变化的实例包括延长的周围或中枢神经致敏作用、中枢致敏作用相关的对神经系统抑制功能的损害以及躯体和交感神经系统之间的异常相互作用。神经性疼痛的实例包括单一神经根病(monoradiculopathies)、三叉神经痛、疱疹后神经痛、幻肢痛、复杂区域性疼痛综合征和各种周围神经病变。在一些实施方案中，神经性疼痛是疱疹后神经痛、或与选自以下的病症有关的神经性疼痛：疱疹、HIV、外伤性神经损伤、中风、缺血后、纤维肌痛、反射性交感神经营养不良、复杂区域性疼痛综合征、脊髓损伤、坐骨神经痛、幻肢痛、糖尿病性神经病变、和癌症化疗诱导的神经性疼痛。如权利要求1所述的方法，其中所述神经性疼痛与选自由以下组成的组的病症有关：外伤性神经损伤、缺血后、纤维肌痛、反射性交感神经营养不良、复杂区域性疼痛综合征、坐骨神经痛、幻肢痛、糖尿病性神经病变、和癌症化疗诱导的神经性疼痛。在一些实施方案中，神经性疼痛由以下引起：恶性肿瘤、中风、疱疹后神经痛、具有单克隆蛋白的神经病变(neuropathywithmonoclonalprotein)、血管炎性神经病变、与格-巴二氏综合征有关的神经病变、与法布里病有关的神经病变、炎性病症、包括多发性硬化在内的自身免疫性疾患、毒素、药物、遗传性异常、乳房切除术、或截肢术。
神经性疼痛的标志是慢性异常性疼痛和痛觉过敏。
异常性疼痛指由通常不会引发疼痛响应的刺激例如轻压力造成的疼痛。
痛觉过敏指对正常的疼痛刺激的增加的敏感性。C-纤维的致敏作用引起的初级痛觉过敏立即发生于损伤区域内。由背角神经元的致敏作用引起的次级痛觉过敏发生于损伤周围未受损害的区域。
痛觉缺失或疼痛知觉的降低可受沿伤害通路传递降低的影响。CNS-介导的痛觉缺失导致疼痛传递的整体抑制。
疼痛是疾病最常见的症状，并且是患者向医师呈现的最经常的不适。短语“疼痛管理药物治疗”包括施用以整体预防、缓解或消除疼痛的一种或多种治疗剂。根据本申请，疼痛管理药物治疗包括抑制或下调选自表A的靶基因的双链RNA分子，包括siRNA分子。
“siRNA抑制剂”是能够降低基因的表达或该基因的产物的活性至足以实现期望的生物学或生理学效应的程度的化合物。如本文所用的术语“siRNA抑制剂”指siRNA、siNA、shRNA、合成shRNA；miRNA中的一种或多种。抑制还可称为下调，或对于RNA干扰(RNAi)，称为沉默。
如本文所用的术语“抑制”指降低或下调基因的表达或该基因的产物的活性至足以实现期望的生物学或生理学效应的程度。抑制可以是完全的或部分的。
如本文所用，术语靶基因的“抑制”意指基因表达(转录或翻译)或多肽活性的抑制。靶mRNA序列的多核苷酸序列指mRNA序列、或其任何同源序列，优选同源序列与靶mRNA具有至少70％同一性、更优选80％同一性、甚至更优选90％或95％同一性，靶基因mRNA序列的非限制性实例列于SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。因此，经历如本文所述的突变、变化或修饰的多核苷酸序列涵盖在本发明内。术语“mRNA多核苷酸序列”和”mRNA”可互换使用。RhoA是调节肌动蛋白细胞骨架的GTP酶，其在脊髓损伤后被上调，并显示在眼的小梁网中表达。
如本文所用，术语“多核苷酸”和”核酸”可互换使用，并指包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。该术语应理解为包括由核苷酸类似物构成的RNA或DNA类似物作为等同物。贯穿本申请，mRNA序列列为代表对应的基因。
“寡核苷酸”或“寡聚体”指约2至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。每个DNA或RNA核苷酸可以独立地是天然的或合成的，和或修饰的或未修饰的。修饰包括改变寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和或核苷酸之间的连接。本文公开的化合物涵盖包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸和其组合的分子。
“核苷酸”意欲涵盖脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以是天然的或合成的，和或修饰的或未修饰的。修饰包括改变寡核糖核苷酸中的糖部分、碱基部分和或核糖核苷酸之间的连接。如本文所用，术语“核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未修饰的和修饰的核糖核苷酸。修饰包括改变寡核苷酸中的糖部分、碱基部分和/或核糖核苷酸之间的连接。
RNA干扰和siNA核酸分子
RNA干扰(RNAi)指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中的序列特异性转录后基因沉默过程(Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Fire等，1998，Nature，391，806；Hamilton等，1999，Science，286，950-951；Lin等，1999，Nature，402，128-129；Sharp，1999，Genes&Dev.，13：139-141；和Strauss，1999，Science，286，886)。植物中对应的过程(Heifetz等，PCT国际公布第WO99/61631号)通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默。
细胞中长dsRNA的存在刺激称为Dicer的核糖核酸酶III酶的活性(Bass，2000，Cell，101，235；Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Hammond等，2000，Nature，404，293)。Dicer参与将dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA区段(Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Bass，2000，Cell，101，235；Berstein等，2001，Nature，409，363)。来源于Dicer活性的短干扰RNA通常为约21至约23个核苷酸长并包括约19碱基对双链体(Zamore等，2000，Cell，101，25-33；Elbashir等，2001，GenesDev.，15，188)。细胞质RNAi响应的特征在于内切核酸酶复合体，通常称为RISC，即RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex)，其介导对具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的切割。靶RNA的切割发生在与siRNA双链体的反义链互补的区域的中部(Elbashir等，2001，GenesDev.，15，188)。
本文公开的抑制剂或治疗剂包含核酸分子。如本文所用，术语“核酸分子”或“核酸”可互换使用，并指寡核苷酸，核苷酸或多核苷酸。此处更详细地描述“核酸分子”的变化。核酸分子涵盖修饰的核酸分子和未修饰的核酸分子二者，如本文所述。核酸分子可包括任何组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或核苷酸类似物。
在一些实施方案中，提供了具有结构(A)的双链核酸分子：
(A)’5(N)x-Z3’(反义链)
3’Z’-(N’)y-z”5’(有义链)
其中N和N’中的每一个是可以为未修饰的或修饰的、或非常规的部分的核苷酸；
其中(N)x和(N’)y中的每一个是其中每个连续的N或N’通过共价键连接至下一个N或N’的寡核苷酸；
其中Z和Z’中的每一个独立地存在或不存在，但是如果存在，则独立地包括连接在其所存在的链的3’末端的1-5个连续的核苷酸或非核苷酸部分或其组合；
其中z”可存在或不存在，但是如果存在则是连接在(N’)y的5’末端的加帽部分；
x和y中的每一个独立地是18至40的整数；
其中(N’)y的序列具有与(N)x的序列的互补性；且其中(N)x包括脊髓损伤、疾病或疾患中上调的基因的mRNA的反义序列。
在一些实施方案中，连接每个连续的N或N’的共价键是磷酸二酯键。
在一些实施方案中，x＝y且x和y中的每一个是19、20、21、22或23。在不同的实施方案中，x＝y＝19。在一些实施方案中，反义和有义链通过碱基配对形成双链体。
在一些实施方案中，反义链的5’末端核苷酸(反义链的位置1)是与靶mRNA错配的。在一些实施方案中，反义链的5’末端核苷酸是修饰的核糖腺苷或修饰的核糖尿苷。
在一些实施方案中，Z和Z’不存在。在其他实施方案中，Z或Z’中的一个存在。
如本文所用，术语“核苷酸”指具有糖(或其类似物、或修饰的糖)、核苷酸碱基(或其类似物、或修饰的碱基)、和磷酸基团(或其类似物、或修饰的磷酸基团)的化学部分。核苷酸涵盖修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸二者，如本文所述。如本文所用的，核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸(如，未修饰的脱氧核糖核苷酸)、核糖核苷酸(如，未修饰的核糖核苷酸)、和修饰的核苷酸类似物(包括，尤其是，锁核酸和非锁核酸)、肽核酸、L-核苷酸(也称为镜像核苷酸)、乙烯桥接核酸(ENA)、阿糖胞苷、PACE、具有6碳糖的核苷酸、以及经常被视为非核苷酸的核苷酸类似物(包括无碱基核苷酸)。在一些实施方案中，核苷酸可以是在糖、核苷酸碱基和/或在磷酸基团中用本领域已知的任何修饰，诸如本文描述的修饰来修饰的。如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”指连接的核苷酸链；多核苷酸和寡核苷酸可同样地具有在核苷酸糖、核苷酸碱基和磷酸骨架中的修饰，如本领域所熟知的和/或本文所公开的。
如本文所用，术语“短干扰核酸”、“siNA”、或“短干扰核酸分子”指能够调控基因表达或病毒复制的任何核酸分子。优选地，siNA抑制或下调基因表达或病毒复制。siNA包括且不限于能够介导序列特异性RNAi的核酸分子，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微-RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)、和其他。如本文所用的，“短干扰核酸”、“siNA”、或“短干扰核酸分子”具有在本文其他地方更详细地描述的含义。
如本文所用，术语“互补”意指核酸可通过传统的Watson-Crick或其他非传统的类型与另一核酸序列形成氢键。百分比互补性指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(如，第一寡核苷酸中总共10个核苷酸中的5、6、7、8、9、或10个核苷酸与具有10个核苷酸的第二核酸序列碱基配对分别代表50％、60％、70％、80％、90％、和100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基形成氢键。在一个实施方案中，本文公开的核酸分子包括与一种或多种靶核酸分子或其部分互补的约15至约35个或更多(如，约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个或更多)核苷酸。
如本文所用，术语“有义区”指与siNA分子的反义区互补(部分地或完全地)的siNA分子的核苷酸序列。siNA分子的有义链可包括与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。如本文所用的，“有义链”指包括有义区并且还可包括另外的核苷酸的核酸分子。有义链还被称为乘客链。
如本文所用，术语“反义区”指与靶核酸序列互补(部分地或完全地)的siNA分子的核苷酸序列。siNA分子的反义链可任选地包括与siNA分子的有义区互补的核酸序列。如本文所用的，”反义链”指包括反义区并且还可包括另外的核苷酸的核酸分子。反义链还被称为引导链。
如本文所用，术语“RNA”指包括至少一个核糖核苷酸残基的分子。
如本文所用，术语“双链体区”指通过Watson-Crick碱基配对或允许互补的或大致互补的寡核苷酸链之间的双链体的任何其他方式彼此形成碱基对的两个互补的或大致互补的寡核苷酸中的区域。例如，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可以具有21个核苷酸单元的另一寡核苷酸碱基配对，但是每条链上仅有19个碱基是互补的或大致互补的，使得“双链体区”由19个碱基对组成。剩余的碱基对可，例如，作为5’和3’突出部分存在。此外，在双链体区内，不要求100％互补性；大致互补性在双链体区内是允许的。大致互补性指链之间的互补性使得它们能够在生物学条件下退火。根据经验确定两条链是否能够在生物学条件下退火的技术是本领域公知的。可选择地，可合成两条链并在生物学条件下将它们添加在一起以确定它们是否彼此退火。
如本文所用，术语“非配对核苷酸类似物”意指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，非碱基配对部分包括但不限于：6脱氨基腺苷(ebularine)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-MedC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC、N3-MedC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其他实施方案中，其为脱氧核糖核苷酸。
如本文所用，术语”末端官能团”包括且不限于卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮、醚基团。
如本文所用的“无碱基部分”或“无碱基核苷酸类似物”在本文和本领域也称为假核苷酸或非常规部分。核苷酸是核酸的单体单元，通常由核糖或脱氧核糖、磷酸、和碱基(DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶；RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、或胞嘧啶)。而无碱基或假核苷酸缺乏碱基，并因此不是严格意义上的本领域通常使用的术语核苷酸。无碱基脱氧核糖部分包括例如，无碱基脱氧核糖-3’-磷酸；1，2-二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸；1，4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸。反向无碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖无碱基；3’，5’反向脱氧无碱基5’-磷酸。
如本文所用的术语”加帽部分”(或结构(A)中的”z”)包括可共价连接至(N’)y的5’末端的部分，并包括无碱基核糖部分、无碱基脱氧核糖部分、修饰无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分包括2’O烷基修饰；反向无碱基核糖和无碱基脱氧核糖部分和其修饰；C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸(包括L-DNA和L-RNA)；5’OMe核苷酸；和核苷酸类似物(包括4’，5’-亚甲基核苷酸)；1-(β-D-赤藓呋喃糖基)核苷酸；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5’-氨基-烷基磷酸；1，3-二氨基-2-丙基磷酸、3-氨基丙基磷酸；6-氨基己基磷酸；12-氨基十二烷基磷酸；羟丙基磷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-呋喃核糖核苷酸；无环3’，4’-开环核苷酸；3，4-二羟基丁基苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5’-5’-反向无碱基部分；1，4-丁二醇磷酸；5’-氨基；和桥接或非桥接甲基膦酸和5’-巯基部分。
某些加帽部分可以是无碱基核糖或无碱基脱氧核糖部分；反向无碱基核糖或无碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi；镜像核苷酸(包括L-DNA和L-RNA)。如本文公开的核酸分子可使用一种或多种反向核苷酸例如反向胸苷或反向腺嘌呤合成(例如参见Takei等，2002.JBC277(26)：23800-06)。
如本文所用的术语”非常规部分”指非核苷酸部分(包括无碱基部分、反向无碱基部分、烃(烷基)部分和其衍生物)，且还包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸(L-DNA或L-RNA)、非碱基配对核苷酸类似物和通过2’-5’核苷酸间磷酸键连接至相邻核苷酸的核苷酸；桥接核酸包括LNA和乙烯桥接的核酸、连接修饰的(如PACE)和碱基修饰的核苷酸以及本文明确公开为非常规部分的其他部分。
如本文所用，对于基因表达，术语“抑制”、“下调”、或“降低”意指基因的表达、或、编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等同RNA分子(如，mRNA)的水平、或一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性被降低到低于在不存在抑制因子(诸如核酸分子，如siNA，例如具有如本文所述的结构特征的)下所观察的；例如表达可被降低至比在不存在抑制剂下观察到的低90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。
siNA核酸分子可从两条单独的多核苷酸链组装，其中一条链是有义链而另一条是反义链，其中反义和有义链是自身互补的(即每条链包括与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列)；诸如其中反义链和有义链形成具有如本文对所提供的核酸分子所述的任何长度和结构的双链体或双链结构，例如其中所述双链区(双链体区)是约17至约40(如，约17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基对)；反义链包括与靶核酸分子(即，RhoA或TLR4mRNA)中的核苷酸序列或其部分互补的核苷酸序列，而有义链包括对应于靶核酸序列或其部分(如，本文的核酸分子的约17至约49或更多核苷酸与靶核酸或其部分互补)的核苷酸序列。
在某些方面和实施方案中，本文提供的核酸分子(如，siNA分子)可以是“RISC长度”分子或可以是如下文更详细地描述的Dicer底物。
siNA核酸分子可包括单独的有义和反义序列或区域，其中有义和反义区可通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接体分子共价连接，或可选地通过离子相互作用、氢键键合、vanderWaals相互作用、疏水相互作用、和/或堆叠相互作用非共价地连接。核酸分子可包括与靶基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。核酸分子可以导致靶基因表达的抑制的方式与靶基因的核苷酸序列相互作用。
可选地，siNA核酸分子从单一多核苷酸组装，其中核酸分子的自身互补的有义和反义区借助基于核酸的或非基于核酸的连接体连接，例如形成本领域熟知的“发夹”结构)。此类siNA核酸分子可以是具有双链体、非对称双链体、发夹或非对称发夹二级结构、具有自身互补的有义和反义区的多核苷酸，其中所述反义区包括与单独的靶核酸分子或其部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区具有对应于靶核酸序列(如，RhoA和TLR4mRNA序列)的核苷酸序列。此类siNA核酸分子可以是具有两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区包括与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，而有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，且其中所述环状多核苷酸可在体内或在体外被加工以产生能够介导RNAi的活性核酸分子。
以下命名在本领域中经常用于描述siNA分子的长度和突出部分，并可贯穿说明书和实施例使用。给予双链体的名称指示寡聚体的长度和突出部分的存在或不存在。
核酸分子的化学修饰
在某些方面和实施方案中，本文所提供的核酸分子(如，siNA分子)包括一种或多种修饰(或化学修饰)。在某些实施方案中，此类修饰包括对核酸分子或多核苷酸的任何改变，该改变将使得该分子不同于标准核糖核苷酸或RNA分子(即，包括标准腺嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、或鸟嘌呤部分)；其可被称为“未修饰的”核糖核苷酸或未修饰的核糖核酸。由腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤部分表示的具有2’-脱氧糖的传统的DNA碱基和多核苷酸可被称为“未修饰的脱氧核糖核苷酸”或”未修饰的脱氧核糖核酸”；相应地，如本文所用的术语”未修饰的核苷酸”或”未修饰的核酸”指“未修饰的核糖核苷酸”或”未修饰的核糖核酸”，除非有明确指示相反。此类修饰可以在多核苷酸的核苷酸糖、核苷酸碱基、核苷酸磷酸基团和/或磷酸骨架。
在某些实施方案中，如本文公开的修饰可用于增加分子的RNAi活性和/或增加分子的体内核酸外切酶和或核酸内切酶稳定性，特别是在血清中的稳定性，和/或增加分子的生物利用度。修饰的非限制性实例包括但不限于核苷酸间或核苷间连接；核碱基修饰和糖修饰。
修饰的核苷酸包括具有Northern构象的那些，包括锁核酸(LNA)核苷酸(如，2’-O、4’-C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷酸)；2’-甲氧基乙氧基(MOE)核苷酸；2’-甲基-硫代-乙基、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧-2’-氯核苷酸、2’-叠氮基核苷酸、和2’-O-甲基核苷酸。锁核酸、或LNA描述于，例如，Elman等，2005；Kurreck等，2002；Crinelli等，2002；Braasch和Corey，2001；Bondensgaard等，2000；Wahlestedt等，2000；和国际专利公布第WO00/47599、WO99/14226、和WO98/39352和WO2004/083430号。在一个实施方案中，LNA被掺入有义链的5’末端。
化学修饰还包括非锁核酸或UNA，其是非核苷酸、非环状类似物，其中糖的C2’-C3’键不存在(尽管UNA不是真正的核苷酸，但是如本文所预期的，它们明确包括在“修饰的”核苷酸或核酸或非常规部分的范围内)。在特定的实施方案中，具有突出部分的核酸分子可被修饰为在突出部分位置具有UNA(即，2核苷酸锁缝)。在其他实施方案中，UNA被包括在3’-或5’-端。UNA可位于沿核酸链的任何位置，即在位置7。核酸分子可含有一个或多个UNA。示例性UNA公开于NucleicAcidsSymposiumSeriesNo.52p.133-134(2008)。在一些实施方案中，具有3’-突出部分的如本文所述的核酸分子在3’突出部分包括一个或两个UNA。在一些实施方案中，如本文所述的核酸分子(如，siNA分子)在反义链中包括UNA(例如一个UNA)；例如在反义链的位置6或位置7。化学修饰还包括非配对核苷酸类似物，例如如本文所公开的。化学修饰还包括如本文所公开的非常规部分。
对糖的化学修饰包括六元“六元环核苷酸类似物”。六元环核苷酸类似物的实例公开于Allart等(Nucleosides&Nucleotides，1998，17：1523-1526；和Perez-Perez等，1996，Bioorg.andMedicinalChemLetters6：1457-1460)。包括6-元环核苷酸类似物包括己糖醇和阿卓糖醇核苷酸单体的寡核苷酸公开于国际专利申请公布第WO2006/047842号。
化学修饰还包括“镜像”核苷酸，其与正常的天然存在的核苷酸相比具有相反的手性；即镜像核苷酸可以是天然存在的D-核苷酸的“L-核苷酸”类似物(参见美国专利第6,602,858号)。镜像核苷酸还可包括至少一种糖或碱基修饰和/或骨架修饰，例如，如本文所述，诸如硫代磷酸或膦酸部分。美国专利第6,602,858号公开了核酸催化剂，包括至少一种L-核苷酸取代。镜像核苷酸包括例如L-DNA(L-脱氧核糖腺苷-3’-磷酸(镜像dA)；L-脱氧核糖胞苷-3’-磷酸(镜像dC)；L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像dG)；L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸(镜像dT))和L-RNA(L-核糖腺苷-3’-磷酸(镜像rA)；L-核糖胞苷-3’-磷酸(镜像rC)；L-核糖鸟苷-3’-磷酸(镜像rG)；L-核糖尿嘧啶-3’-磷酸(镜像dU)。
在一些实施方案中，修饰的核糖核苷酸包括修饰的脱氧核糖核苷酸，例如5’OMeDNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸)，其可用作5’末端位置(位置编号1)的核苷酸；PACE(脱氧核糖腺嘌呤3’磷乙酸、脱氧核糖胞苷3’磷乙酸、脱氧核糖鸟苷3’磷乙酸、脱氧核糖胸苷3’磷乙酸。
修饰可存在于本文公开的核酸分子的一条或多条链中，如在有义链、反义链、或两条链中。在某些实施方案中，反义链可包括修饰而有义链可仅包括未修饰的RNA。
核碱基
本文公开的核酸的核碱基可包括未修饰的核糖核苷酸(嘌呤和嘧啶)，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿苷。一条或两条链中的核碱基可以用诸如以下的天然的和合成的核碱基修饰：胸腺嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、任何“通用碱基”核苷酸；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、氨基、硫醇、硫烷基、羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、去氮嘌呤、嘌呤和嘧啶的杂环取代的类似物如氨基乙氧基吩噁嗪、嘌呤和嘧啶的衍生物(如1-烷基-、1-烯基-、杂芳族-和1-炔基衍生物)和其互变异构体、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-二氮杂黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-(1-丙炔基)尿嘧啶、5-(1-丙炔基)胞嘧啶和4，4-桥亚乙基胞嘧啶)。合适的碱基的其他实例包括非嘌呤和非嘧啶碱基诸如2-氨基吡啶和三嗪。
糖部分
本文公开的核酸中的糖部分可包括无任何修饰的2’-羟基-呋喃核糖糖部分。可选地，糖部分可以是修饰的，诸如2’-脱氧-呋喃核糖糖部分、D-核糖、己糖、在呋喃核糖糖部分的2’位置修饰诸如2’-O-烷基(包括2’-O-甲基和2’-O-乙基)，即，2’-烷氧基、2’-氨基、2’-O-烯丙基、2’-S-烷基、2’-卤素(包括2’-氟、氯、和溴)、2’-甲氧基乙氧基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O-2-甲氧基乙基、2’-烯丙基氧(-OCH2CH＝CH2)、2’-炔丙基、2’-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基、CF、氰基、咪唑、羧酸酯、硫代酯(thioate)、C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3、OCN、O-、S-、或N-烷基；O-、S、或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2、N3；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基或取代的甲硅烷基。
烷基基团包括饱和的脂肪基团，包括直链烷基基团(如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支链烷基基团(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷基(脂环族的)基团(环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在某些实施方案中，直链或支链烷基在其骨架中具有6个或更少碳原子(如对于直链为C1-C6、对于支链为C3-C6)、和更优选地4个或更少。同样地，优选的环烷基可在其环结构中具有3-8个碳原子，且更优选地在其环结构中具有5或6个碳原子。术语C1-C6包括含有1至6个碳原子的烷基基团。烷基基团可以是取代的烷基基团，诸如具有替代烃骨架的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基部分。此类取代基可包括，例如烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸、磷酰基、次磷酰基(phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚硫酰基、磺酸根合、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂芳族部分。
烷氧基基团包括共价连接至氧原子的取代的和未取代的烷基、烯基、和炔基基团。烷氧基基团的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、丁氧基、和戊氧基基团。取代的烷氧基基团的实例包括卤素化的烷氧基基团。烷氧基基团可以用诸如以下的基团取代：烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、烷基硫羰基、烷氧基、磷酸、磷酰基、次磷酰基、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚氨基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚硫酰基、磺酰基、氨磺酰基、磺酰胺基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基、或芳族或杂芳族部分。卤素取代的烷氧基基团的实例包括但不限于，氟甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
在一些实施方案中，呋喃核糖环可用缺乏呋喃核糖环的C2’-C3’键的非环状衍生物替代。例如，无环核苷酸可用2-羟基乙氧基甲基基团取代通常存在于dNMP中的2’-脱氧呋喃核糖基糖。
卤素包括氟、溴、氯、碘。
骨架
本文公开的核酸的核苷亚基可通过磷酸二酯键彼此共价连接。磷酸二酯键可任选地用其他连接取代。例如，硫代磷酸、硫磷酸-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’-5’桥接的骨架(还可称为5’-2’)、PACE、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或-5’)硫-硫代磷酸、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、3’-或-5’)脱氧次磷酸酯、硼代磷酸酯(boranophosphate)、3’-(或-5’)脱氧-3’-(或5’-)氨基磷酸酰胺、氢膦酸酯(hydrogenphosphonate)、膦酸酯、硼代磷酸酯(boranophosphateesters)、磷酸酰胺、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯修饰和不含磷的连接例如碳酸酯、氨基甲酸酯、甲硅烷基、硫、磺酸酯、磺酰胺、甲酰基、硫代甲酰基、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲基氧甲基亚氨基连接。
本文公开的核酸分子可包括肽核酸(PNA)骨架。PNA骨架包括通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元。不同的碱基诸如嘌呤、嘧啶、天然的和合成的碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架。
末端磷酸
可在末端磷酸基团进行修饰。可以使用不同的稳定化学的非限制性实例，如，核酸序列的3’-端，包括(1)[3-3’]-反向脱氧核糖；(2)脱氧核糖核苷酸；(3)[5’-3’]-3’-脱氧核糖核苷酸；(4)[5’-3’]-核糖核苷酸；(5)[5’-3’]-3’-O-甲基核糖核苷酸；(6)3’-甘油基；(7)[3’-5’]-3’-脱氧核糖核苷酸；(8)[3’-3’]-脱氧核糖核苷酸；(9)[5’-2’]-脱氧核糖核苷酸；和(10)[5-3’]-二脱氧核糖核苷酸。
本文公开的核酸分子(如，siNA、siRNA分子)可以是在两侧为平端、在两侧具有突出部分或平端和突出端的组合。突出部分可发生于有义或反义链的5’-或3’-端。
双链核酸分子(如，siNA)的5’-和/或3’-端可以为平端或具有突出部分。在有义链或反义链中，5’-端可以为平端和3’-端具有突出部分。在其他实施方案中，在有义链或反义链中，3’-端可以为平端和5’-端具有突出部分。在又其他的实施方案中，5’-和3’-端均为平端或5’-和3’-端均具有突出部分。
核酸的一条链或两条链的5’-和/或3’-端可包括游离羟基基团和/或磷酸基团。任何核酸分子链的5’-和/或3’-端可以被修饰为包括化学修饰。此类修饰可稳定核酸分子，如3’-端可由于核酸分子修饰的存在而具有增加的稳定性。
本文公开的核酸分子(如，siNA、siRNA分子)可包括作为核酸分子中存在的核苷酸总数的一定百分比的修饰的核苷酸。如此，核酸分子可包括约5％至约100％修饰的核苷酸(如，约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％修饰的核苷酸)。给定核酸分子中存在的修饰的核苷酸的实际百分比将取决于核酸中存在的核苷酸的总数。如果核酸分子是单链，则百分比修饰可以基于单链核酸分子中存在的核苷酸的总数。同样地，如果核酸分子是双链，则百分比修饰可以基于有义链、反义链、或有义链和反义链二者中存在的核苷酸的总数。
化学修饰的短干扰核酸(siNA)分子可包括反义区，其中反义区中存在的任何(如，一个或多个或全部)嘧啶核苷酸为2’-O-甲氧基或2’-脱氧-2’-氟嘧啶核苷酸。
核酸化合物的修饰模式和交替修饰
本文提供的核酸分子(如，siNA分子)可具有修饰的和未修饰的核酸的模式。一连串核苷酸中的核苷酸的修饰模式可以是单一核苷酸或经由标准磷酸二酯键或至少部分地通过硫代磷酸键彼此共价连接的核苷酸组内含有的修饰。相应地，本文预期的“模式”不必需要涉及重复单元，尽管其可以涉及重复单元。可与本文提供的核酸分子(如，siNA分子)联合使用的修饰模式的实例包括公开于Giese，美国专利第7,452,987号中的那些。例如，本文提供的核酸分子(如，siNA分子)包括具有诸如与美国专利第7,452,987号中图表地显示的模式相似或相同的修饰模式的那些。
在一些包括2’-O-甲基(2’-O甲氧基；2’-OCH3)修饰的核苷酸和非修饰的核苷酸，优选不是2’-O-甲基修饰的核苷酸的双链核酸分子中，其以交替的方式并入在两条链上，造成交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸和未修饰的或至少不包括2’-O-甲基修饰的核糖核苷酸的模式。在某些实施方案中，2’-O-甲基修饰和非修饰的相同序列存在于第二条链上；在其他实施方案中，交替的2’-O-甲基修饰的核苷酸仅存在于有义链而不存在于反义链；和在又其他的实施方案中，交替2’-O-甲基修饰的核苷酸仅存在于有义链而不存在于反义链。在某些实施方案中，两条链之间存在相位移，使得第一条链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与第二条链上的非修饰的核苷酸碱基配对，反之亦然。
核酸化合物的示例性修饰位置和模式
虽然下面更详细地提供了示例性模式，但是预期了具有本文公开的核酸分子的所有可能的特征和本领域中已知的那些的模式的所有排列(如，包括但不限于以下的特征：有义链的长度、反义链的长度、双链体区的长度、突出部分的长度、双链核酸分子的一端或两端是平的或具有突出部分、修饰的核酸的位置、修饰的核酸的数目、修饰的类型、双突出部分的核酸分子在每一侧的突出部分上是具有相同或不同数目的核苷酸、核酸分子中是否使用一种或多于一种类型的修饰和连续的修饰的/未修饰的核苷酸的数目)。关于下面提供的所有详细的实例，虽然双链体区显示为19个核苷酸，但是本文提供的核酸分子可具有1至49个核苷酸长度的双链体区，因为双链体区的每条链可独立地是17-49个核苷酸长度。本文提供了示例性模式。
本发明的siRNA分子可通过直接应用以载体或稀释剂配制的裸露的分子递送至靶组织。
术语”裸露的siRNA”指不含起辅助、促进或利于进入细胞作用的任何递送载体的siRNA分子，递送载体包括病毒序列、病毒粒子、脂质体制剂、lipofectin或沉淀剂和类似载体。例如，PBS中的siRNA是“裸露的siRNA”。
然而，在一些实施方案中，本发明的siRNA分子在脂质体制剂和lipofectin制剂和类似制剂中递送，并可通过本领域技术人员熟知的方法制备。此类方法描述于，例如美国专利第5,593,972、5,589,466，和5,580,859号，其通过引用并入本文。
本文使用的具体siRNA分子包括：
RHOA_4：
该分子的未修饰序列为：有义5’＞3’：GCCACTTAATGTATGTTAC和反义5’＞3’：GTAACATACATTAAGTGGC。化学修饰的化合物如下：
有义：5’rG；mC；rC；mA；rC；mU；rU；mA；rA；mU；rG；mU；rA；mU；rG；mU；rU；mA；rC
反义：5’mG；rU；mA；rA；mC；rA；mU；rA；mC；rA；mU；rU；mA；rA；mG；rU；mG；rG；mC
TLR4_4：
该分子的未修饰序列为：有义5’＞3’：GAGTTCAGGTTAACATATA
反义5’＞3’：TATATGTTAACCTGAACTC。化学修饰的化合物如下：
有义：5’rG；mA；rG；mU；rU；mC；rA；mG；rG；mU；rU；mA；rA；mC；rA；mU；rA；mU；rA
反义：5’mU；rA；mU；rA；mU；rG；mU；rU；niA；rA；mC；rC；mU；rG；mA；rA；mC；rU；mC
其中核糖核苷酸A、C、G或U之前的“r”指示未修饰的核糖核苷酸而”m”指示2’-OCH3修饰的核糖核苷酸。
定向至相关靶基因的另外的siRNA公开于转让给本发明的受让人的PCT专利申请公布第WO2008/050329和WO2009/044392号，其通过引用整体并入本文。
适应症
脊髓损伤(SCI)
在一个实施方案中，CNS的损伤是脊髓损伤(SCI)或脊髓病。SCI或脊髓病是造成感觉和/或运动性损失的脊髓失调。脊髓损伤的两种常见类型是由于外伤和疾病。外伤性损伤可由以下造成：汽车事故、跌倒、枪击、潜水事故及其他外伤，和可影响脊髓的疾病，包括脊髓灰质炎、脊柱裂、肿瘤、肌萎缩侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、脊髓空洞症、横贯性脊髓炎和弗里德赖希氏共济失调。
在不同的实施方案中，本文公开的化合物和方法用于治疗或预防脊髓损伤引起的伤害，特别是由电动车辆、跌倒、运动损伤、工业事故、枪击伤引起的脊髓外伤，脊柱弱化(诸如因类风湿性关节炎或骨质疏松)或如果保护脊髓的脊椎管由于正常的老化过程变得太窄(椎管狭窄)引起的脊髓外伤，当脊髓被牵拉时、侧压、或压缩造成的直接损害，脊髓内部或脊髓外部(但在脊椎管内)流血、流体积累和肿胀后对脊髓的损害。本发明的耳用药物组合物还用于治疗或预防由于疾病诸如脊髓灰质炎或脊柱裂引起的脊髓损伤造成的损害。其他适应症包括痛觉过敏和异常性疼痛。
异常性疼痛
异常性疼痛是“其他疼痛”，定义为正常不疼痛的刺激造成的疼痛。该疼痛可发生在刺激区域以外。
异常性疼痛和脊髓损伤(SCI)
慢性疼痛是SCI最频繁和令人头疼的后遗症之一，经常干扰患者的有效康复。除了在非SCI群体中见到的慢性疼痛综合征如偏头痛和疱疹后神经痛之外，患有SCI的患者还可遭受SCI独有的疼痛综合征。报告的慢性SCI疼痛的发病率在25％和94％之间变化，这些患者中有近三分之一经历严重的疼痛(BonicaJJ.Introduction：semantic，epidemiologic，andeducationalissues.于：CaseyKL编，Painandcentralnervoussystemdisease：thecentralpainsyndromes.NewYork：RavenPress，1991：13-29；SiddallPJ、TaylorDA、McClellandJM、RutkowskiSB、CousinsMJ.Painreportandtherelationshipofpaintophysicalfactorsinthefirstsixmonthsfollowingspinalcordinjury.Pain1999；81：187-97；GerhartKA、JohnsonRL、WhiteneckGG.Healthandpsychosocialissuesofindividualswithincompleteandresolvingspinalcordinjuries.Paraplegia1992；30：282-7)。数项研究已报告各种类型的SCI疼痛的发病率。肌肉骨骼疼痛是损伤后6个月(40％)(SiddallPJ、TaylorDA、McClellandJM、RutkowskiSB、CousinsMJ.Painreportandtherelationshipofpaintophysicalfactorsinthefirstsixmonthsfollowingspinalcordinjury.Pain1999；81：187-97)和SCI后5年(59％)(SiddallPJ、McClellandJM、RutkowskiSB、CousinsMJ.Alongitudinalstudyoftheprevalenceandcharacteristicsofpaininthefirst5yearsfollowingspinalcordinjury.Pain2003；103：249-57)经历的最常见的类型。SCI后5年以上相似地观察到损伤水平和损伤水平以下神经性疼痛发病率的增加。影响SCI疼痛发展的变量还不清楚。已考虑了诸如损伤的水平、损伤的完全度、损伤的原因和心理因素的因素(SiddallPJ、YezierskiRP、LoeserJDTaxonomyandepidemiologyofspinalcordinjurypain.于：YezierskiRP，BurchielKJ，编Spinalcordinjurypain：assessment，mechanisms，management.ProgressinPainResearchandManagement.Vol.23Seattle：IASPPress，2002：9-24)。肌肉骨骼疼痛在具有胸廓水平损伤的患者中更常见，并被报告在SCI后2周具有手术干预的那些患者中发病率更高(SvedP、SiddallPJ、McClellandJM、CousinsMJ.Relationshipbetweensurgeryandpainfollowingspinalcordinjury.SpinalCord1997；35：526-30)。观察到与异常性疼痛有关的神经性疼痛在具有不完全脊髓病损的患者中、在颈而不是胸廓脊髓损伤中、和在中央脊髓综合征中更常见(SiddallPJ、TaylorDA、McClellandJM、RutkowskiSB、CousinsMJ.Painreportandtherelationshipofpaintophysicalfactorsinthefirstsixmonthsfollowingspinalcordinjury.Pain1999；81：187-97)。
SCI后疼痛类型
除了Tier2下SCI疼痛的四种主要类型外，存在其他公认的疼痛病症，其中大多数在InternationalAssociationfortheStudyofPainTaxonomy中是在Tier3下(SiddallPJ，YezierskiRP，LoeserJD.Painfollowingspinalcordinjury：clinicalfeatures，prevalence，andtaxonomy.InternationalAssociationfortheStudyofPainNewsletter2000；3：3-7)。这些需要进行临床鉴定以便可制定适当的治疗。
肌肉骨骼疼痛
脊柱的机械不稳定性：这种类型的疼痛是由韧带/关节的受损或骨折引起的，造成脊柱的不稳定性。其发生在损伤后早期，并位于脊柱靠近SCI位点的区域。其与位置有关，随活动恶化并随休息降低。通过放射照相、计算机断层扫描或MRI辅助诊断以鉴定病理学的性质和位点。
肌肉痉挛疼痛：痉挛状态定义为特征在于具有夸张的腱反射的紧张性牵张反射(肌肉紧张)的速度依赖性增加的运动障碍，由牵张反射的兴奋性过高引起。对α运动神经元和肌肉的众多兴奋性和抑制性调节突触影响中的任何的不平衡造成牵张反射弧的活性过高。这一疼痛类型通常发生于SCI后晚期，并经常鉴于具有不完全SCI的人中。
损伤水平神经性疼痛
节段性去传入/Girdle或Border或移行带疼痛：这是发生在二至四节段带内的SCI的损伤水平以上或以下的损伤水平神经性疼痛的变化形式。其经常发生在正常感觉的和麻醉的皮肤边界。
脊髓空洞症：由于瘘管(即，脊髓中的异常囊肿)的疼痛经常以延迟发作发生，平均为6年。具有颈损伤的对脊髓中央部分的损害造成中央脊髓综合征，特征为臂的疼痛和虚弱，以及相对强壮但僵硬的腿功能。脊髓空洞症的疼痛有时描述为具有异常性疼痛的不断的灼烧性疼痛。
损伤水平以下神经性疼痛
中央触物感痛综合征/中央疼痛/去传入疼痛：弥散性地位于SCI水平尾侧，即遍及从肩到足的整个身体的疼痛，典型的损伤水平以下神经性疼痛。该疼痛可与痛觉过敏有关并可随时间逐渐恶化。其自发和/或诱发发作地发生，并经常因感染、突然的噪音、和冲突性运动而恶化。
SCI疼痛的病理学和机制
与SCI有关的疼痛是特征为机械性外伤造成的病理学变化的损伤和脊髓实质的血管受累两者的结果。其受病损的性质、所损害的神经结构和存活组织的次级病理学变化的影响。存在至少三种建议的SCI疼痛背后的基础机制：增加的神经元兴奋性过高、降低的抑制、和神经元再组织或可塑性。
增加的神经元兴奋性过高
外伤性或缺血性SCI后SCI的初始结果是兴奋性氨基酸的短暂但显著的增加，这触发次级病理学变化的损伤级联。这一脊柱“中央损伤级联”的主要组成包括共同地相互作用以增加损伤水平的神经元响应性的解剖学、神经化学、兴奋性中毒和炎性事件，造成产生异常性疼痛和痛觉过敏的临床症状(YezierskiRP.Pathophysiologyandanimalmodelsofspinalcordinjurypain.于：YezierskiRP，BurchielKJ，编Spinalcordinjurypain：assessment，mechanisms，management.Progressinpainresearchandmanagement.Vol.23.Seattle：IASPPress，2002：117-36)。
现有治疗选择
药理学治疗
一线药物治疗包括全身性利多卡因、加巴喷丁、和普加巴林。二线药物治疗包括单独或与抗癫痫药联合的三环抗抑郁剂。三线药物治疗包括氯胺酮、阿片样物质、选择性血清素再吸收抑制剂、其他抗癫痫药、鞘内吗啡与可乐定、和鞘内巴氯芬。
具有局部疼痛症状的患者可响应于局部利多卡因治疗。在弥散性和复杂性综合征中，建议最低剂量的加巴喷丁或去甲替林进行初始初始药物治疗，然后逐渐滴定至期望的止痛效应和最少的不利效应。充分试验后对药物的不完全或部分响应可通过添加具有不同作用机制的另一药物来增强。
神经增强治疗
SCI疼痛的神经增强选择包括经皮电神经刺激、脊髓刺激、和深度脑刺激，所有这些都几乎没有效力证据。
手术治疗
在众多类型的SCI疼痛中，仅有一些可用手术成功缓解。这些包括用于稳定脊柱的脊柱融合术、神经根压迫的手术减压、和瘘管的引流与分流，其可能需要随后的脊髓去栓系。其他手术治疗，包括脊髓前侧柱切断术、索带切除术(cordectomy)、脊髓切开术、和背根进入区病损(特别是对于损伤水平神经性疼痛)具有有限的效力证据。
脊柱康复
康复治疗是恢复具有SCI的患者的功能独立性和改善其生活质量的治疗的主要组成之一。然而证实各种康复治疗的效力的证据非常有限。物理治疗包括锻炼和水疗法、姿势再教育、压力缓解、使用物理辅助诸如拐杖、矫形器和轮椅和其他物理形式。遗憾的是，物理治疗没有帮助降低神经性SCI疼痛。
治疗方法
在一方面，本发明提供治疗有相应需要的受治疗者中的CNS疾病、疾患或损伤的方法，方法包括以有效治疗受治疗者的量和时间段经由实质内递送或腰椎穿刺向受治疗者的脊髓直接地施用定向至与CNS疾病、疾患或损伤有关的靶基因的至少一种寡核苷酸化合物。具体的疾病、疾患和损伤在本文公开，并包括神经病变，包括糖尿病相关的神经病变、痛觉过敏和异常性疼痛。
靶基因的实例在本文公开。RhoA和TLR4是在实施本发明中有用的特别靶基因。
神经病变、包括糖尿病相关的神经病变、痛觉过敏和异常性疼痛中任何一种的治疗可能需要长期护理和疼痛管理形式。疼痛管理的目标是提供症状缓解和改善个体进行日常活动的水平。
在另一方面，本发明提供减弱患有CNS疾病、疾患或损伤的受治疗者中的靶基因的表达的方法，方法包括以有效减弱靶基因的表达的量和时间段经由实质内递送或腰椎穿刺向受治疗者的脊髓直接地施用定向至与CNS疾病、疾患或损伤有关的靶基因的至少一种寡核苷酸化合物。在一些实施方案中，方法还包括以有效减弱靶基因的表达的量和时间段经由实质内递送或腰椎穿刺的至少一种药理学剂、CNS疾患或损伤。
在一些实施方案中，药理学剂选自非甾体抗炎药(NSAID)、甾体抗炎药、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂、自由基清除剂、抗癌剂和化疗剂。
在一些实施方案中，CNS疾病、疾患或损伤与选自以下的基因的表达有关：伤害性感受器、APP、MAPT、SOD1、BACE1、CASP3、TGM2、NFE2L3、TARDBP、ADRB1、CAMK2A、CBLN1、CDK5R1、GABRA1、MAPK10、NOS1、NPTX2、NRGN、NTS、PDCD2、PDE4D、PENK、SYT1、TTR、FUS、LRDD、CYBA、ATF3、ATF6、CASP2、CASP1、CASP7、CASP8、CASP9、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、ANXA2、RHOA、DUOX1、RTP801、RTP801L、NOX4、NOX1、NOX2(gp91pho、CYBB)、NOX5、DUOX2、NOXO1、NOXO2(p47phox、NCF1)、NOXA1、NOXA2(p67phox、NCF2)、p53(TP53)、HTRA2、KEAP1、SHC1、ZNHIT1、LGALS3、HI95、SOX9、ASPP1、ASPP2、CTSD、CAPNS1、FAS和FASLG、NOGO和NOGO-R；TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL1bR、MYD88、TICAM、TIRAP、HSP47。下面的表A提供了与每种靶基因有关的mRNA的基因标识号(GI)和登录号。
具体mRNA序列与每个GI和登录号有关。参考示例性靶基因提供了不同方面和实施方案的描述。然而，不同的方面和实施方案也定向至相关靶基因，诸如与某些靶基因有关的同源物基因和转录物变体，和多态性(如，单核苷酸多态性(SNP))。
在本发明的一些实施方案中，抑制以下靶基因中的任何一种：TGM2、NFE2L3、TARDBP、ADRB1、CAMK2A、CBLN1、CDK5R1、GABRA1、MAPK10、NOS1、NPTX2、NRGN、NTS、PDCD2、PDE4D、PENK、SYT1、TTR、FUS、LRDD、CYBA、ATF3、ATF6、CASP2、CASP1、CASP7、CASP8、CASP9、HRK、C1QBP、BNIP3、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、ANXA2、RHOA、DUOX1、RTP801、RTP801L、NOX4、NOX1、NOX2(gp91pho、CYBB)、NOX5、DUOX2、NOXO1、NOXO2(p47phox、NCF1)、NOXA1、NOXA2(p67phox、NCF2)、p53(TP53)、HTRA2、KEAP1、SHC1、ZNHIT1、LGALS3、HI95、SOX9、ASPP1、ASPP2、CTSD、CAPNS1、FAS和FASLG、NOGO和NOGO-R；TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL1bR、MYD88、TICAM、TIRAP、HSP47可用于缓解、预防或治疗神经性疼痛。
在一些实施方案中，靶基因选自TGM2、MAPK10、PDE4D、CYBA、C1QBP、MAPK8、MAPK14、Rac1、GSK3B、P2RX7、TRPM2、PARG、CD38、STEAP4、BMP2、GJA1、TYROBP、CTGF、ANXA2、RHOA、DUOX1、NOX4、NOX1、NOX2(gp91pho、CYBB)、NOX5、DUOX2、NOXO1、NOXO2(p47phox、NCF1)、NOXA1、NOXA2(p67phox、NCF2、KEAP1、SHC1、LGALS3、SOX9、NOGO和NOGO-R；TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL1bR、MYD88、TICAM、TIRAP、或HSP47。
在一些优选的实施方案中，靶基因选自MAPK10、PDE4D、CYBA、C1QBP、MAPK8、MAPK14、P2RX7、CD38、STEAP4、TYROBP、ANXA2、RHOA、DUOX1、NOX4、NOX1、NOX2(gp91pho、CYBB)、NOX5、DUOX2、NOXO1、NOXO2(p47phox、NCF1)、NOXA1、NOXA2(p67phox、NCF2、KEAP1、SHC1、LGALS3、SOX9、NOGO、NOGO-R、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL1bR、MYD88、TICAM、TIRAP、或HSP47。
在一些优选的实施方案中，靶基因选自RhoA、TLR4、LGALS和P2RX7。
在优选的实施方案中，治疗寡核苷酸是双链RNA(dsRNA)化合物。在一些实施方案中，dsRNA是siRNA化合物，优选地根据本文提供的公开内容的化学修饰的siRNA。在优选的实施方案中，被治疗的受治疗者是温血动物，并且具体地哺乳动物，优选地人。在产生siRNA化合物中有用的序列使用用于选择siRNA的设计规则来鉴定，并可使用在线可用例如在万维网上可用的算法鉴定。
“治疗受治疗者”指向受治疗者施用有效缓解与疾病或病症有关的症状、延迟疾病的发作、减缓疾病的进展、减轻疾病的严重度或治愈疾病、或预防疾病发生的治疗物质。“治疗”指治疗性治疗和防止性或预防性措施，其中目标是预防疾患、减缓疾病的进展或减轻疾患的症状。需要治疗的那些包括已经历疾病或病症的那些、处于具有疾病或病症风险的或易于具有疾病或病症的那些、和其中要预防疾病或病症的那些。本发明的组合物在疾病或病症发作之前、过程中或随后施用。
另外，本发明提供与对照相比使靶基因的表达下调达至少30％、至少40％、至少50％的方法，包括使靶基因mRNA与本发明的药物组合物的一种或多种化学修饰的siRNA化合物接触。
在一些实施方案中，该方法包括向受治疗者施用寡核苷酸例如siRNA每天一次、两次、三次、或四次。在一些实施方案中，治疗寡核苷酸经1天至14天的时间段连续施用。在其他实施方案中，在CNS或PNS损伤48小时内、优选地损伤40小时、32小时内或24小时内通过腰椎注射施用一次治疗寡核苷酸。在其他实施方案中，在CNS或PNS损伤48小时内、优选地损伤40小时、32小时内或24小时内通过腰椎注射施用一次治疗寡核苷酸，然后每两周、或每月施用一次。治疗的示例性持续时间包括至少约3天、1天至1个月、1天至约两周、两周至1个月、高达约6个月、高达约12个月或甚至更长。在治疗方法的实施方案中，施用经有效造成疼痛消除或减轻的持续时间施用。
主治医师将在合理的医学判断范围内决定治疗化合物和组合物的使用。
实现治疗疼痛，诸如预防、减退、缓解或消除受治疗者中的疼痛的阳性治疗响应所必需的具体剂量水平和施用形式取决于多种因素，包括疾患或损伤的范围和严重度；使用的组合物；关于患者的某些信息，包括年龄、性别、体重、总体健康；采用的具体化合物的施用时间、施用路径、和排泄速率；治疗的持续时间；与采用的具体化合物联合使用的药物；和医学领域公知的因素。向受治疗者例如人受治疗者施用的化合物的总日剂量范围为约0.10ug/kg体重至约25mg/kg体重；或约0.10ug/kg体重至约10mg/kg体重、或约1.0ug/kg体重至约10mg/kg体重、或约10.0ug/kg体重至约10mg/kg体重。(“ug/kg”指每千克体重的微克治疗剂)。
在一方面，提供了用于治疗脊髓损伤的试剂盒，该试剂盒包含有效治疗脊髓损伤的本发明组合物中的任一种。在一方面，提供用于治疗或预防异常性疼痛的试剂盒，该试剂盒包含有效治疗或预防异常性疼痛的本发明组合物中的任一种。在一个实施方案中，试剂盒与药物递送泵一起使用。在一个实施方案中，试剂盒与用于鞘内或脊柱内递送的注射器一起使用。
向脊髓的递送
药物至硬膜内或鞘内间隙的递送旨在将药物递送至脊髓内的特定靶、并以用系统性递送不能实现的脊髓内浓度和使用比例如植入药物递送系统或手术创伤性更小的方法。药物还可被限制于其脊柱递送位点，由此避免剂量限制副作用或毒性。先前已显示递送至硬膜内或鞘内间隙的化学剂进入血浆并达到根据药物而不同的显著的系统浓度。脂质体或其他制剂的添加可大大增加递送至脊髓的药物的系统浓度。(SpinalDrugDelivery，Elsevier，May1999，T.L.Yaksh编)。
本发明的siRNA优选地是裸露的，即未制剂的，并因此在实质内或鞘内施用时易于被脊髓的细胞摄取。
实质内递送
实质是脊髓的神经组织，其沐浴在脑脊液中并被椎骨内的硬膜包围。在实质内递送中，将药物直接或经由穿过硬膜的导管注射到神经组织。药物可以团注形式注射或连续递送。
鞘内递送
脊柱鞘内间隙是脊椎管中围绕脊髓的间隙。在鞘内递送中，将药物直接注射到脑脊液中。
实质内递送和鞘内递送之间的差异包括：
仅小量体积可被注射到实质中，而鞘内间隙在腰椎扩大处是很大的，这允许大得多的注射体积。
实质内递送需要椎板切除术，而鞘内递送可在腰椎扩大处通过在腰椎椎骨之间注射进行而无需破坏它们。
本申请提供了将siRNA递送至受损伤的脊髓的两种方法，并显示这些剂被摄取到损伤位点中和其周围的许多不同类型的细胞。此外，将siRNA注射到受损伤的脊髓在使用两种方法时都改善了行走行为并在至少一种方法中降低了疼痛敏感性。这些结果对于哺乳动物受治疗者(包括人和动物患者)具有治疗意义，并提供多种递送方法用于脊髓损伤或疾病患者中的改善功能。这些方法的组合可以是甚至更有益的。此外，未观察到非特异性副作用指示针对不同靶的不同siRNA的组合作为同时针对多种靶的组合治疗是可行的。
贯穿说明书引用了许多出版物和专利文件，包括公开的申请和授权的专利，以描述本发明所述领域的现有技术。这些引用的每一个通过引用并入本文，如同将其完整列出。
本发明还通过参考详细描述本发明的实施例定义。将对本领域技术人员明显的是：可以实施对材料和方法二者的许多修饰而不偏离本发明的目的和兴趣。列出以下实施例以帮助理解本发明，并且其不应解读为具体限制本文所描述和要求保护的发明。本发明的此类变化，包括现在已知的或将在本领域技术人员视界内的以后开发的所有等同物的替代，和制剂的变化或实验设计的小的变化视为落入本文包括的发明的范围内。
实施例
分子生物学一般方法
本领域已知的和未具体描述的标准分子生物学技术一般是按照Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1989)，和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWileyandSons，Baltimore，Maryland(1989)，和Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning，JohnWiley&Sons，NewYork(1988)，和Watson等，RecombinantDNA，ScientificAmericanBooks，NewYork，和Birren等(编)GenomeAnalysis：ALaboratoryManualSeries，Vols.1-4ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork(1998)，和美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中描述的方法，并通过引用并入本文。聚合酶链式反应(PCR)一般按照PCRProtocols：AGuideToMethodsAndApplications，AcademicPress，SanDiego，CA(1990)进行。原位(细胞内)PCR联合流式细胞术可用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等，1996，Blood87：3822.)。进行RT-PCR的方法也是本领域公知的。
寡核苷酸序列
产生dsRNA化合物(包括siRNA化合物)中有用的寡核苷酸序列使用用于选择siRNA的设计规则来鉴定，并可使用网上例如在万维网上可用的算法鉴定。在非限制性实例中，以下网站提供了可用的免费在线siRNA服务的列表：http://www.rnaiweb.com/RNAi/RNAi_Web_Resources/RNAi_Tools_Software/Online_si_RNA_Design_Tools/index.html。产生dsRNA特别是siRNA中有用的寡核苷酸序列可选自转让给本发明的申请人并通过引用整体并入本文的PCT专利公布WO2008/050329、WO2008/152636、和WO2009/044392中公开的序列。随本文电子提交的序列表通过引用并入本文(文件名：210_PCT1_ST25.txt；创建日期：2010年11月8日；文件大小：26.00Kb.)
siRNA合成、修饰、活性和核酸酶稳定性
本研究中使用的所有siRNA分子通过交替的2’O-甲基化稳定。具体地，2’O-甲基基团存在于反义链的所有奇数核苷酸和有义链的所有偶数核苷酸(BioSpring，FrankfurtGermany)。用于成像研究的Cy3.5-标记的siRNA具有序列5’-GUGCCAACCUGAUGCAGCU-3’(SEQIDNO：9，有义链)。针对GFP的siRNA(siGFP)如先前所述(Hamar等，2004)。体内研究中使用的针对RhoA的活性siRNA(siRhoA)具有序列5’-GCCACUUAAUGUAUGUUAC-3’(SEQIDNO：5；有义链)。体内研究中使用的针对TLR4的活性siRNA(siTLR4)具有序列5’GAGUUCAGGUUAACAUAUA3’(SEQIDNO：7，有义链)。通过根据生产商的说明使用LipofectamineTM2000(Invitrogen，CA)转染siRNA在人HeLa和大鼠REF52细胞中检验siRhoA和siTLR4的敲低效力。靶基因敲低通过定量实时-PCR(q-RT-PCR)测定。
实施例1：脊髓损伤和实质内递送后siRNA在大鼠脊髓中的细胞定位
为了开发脊髓损伤(SCI)的siRNA疗法，鉴定掺入标记的siRNA的细胞。与Cy3轭合的siRNA以及与Cy3.5轭合的特异性序列(REDD14/Cy3.5)展示掺入相似的细胞群，包括运动神经元、巨噬细胞、白质轴突、以及背根中的神经元和内皮细胞，如图1A-1F所示。因此，siRNA被其中暗示RhoA作用参与SCI的细胞中的许多细胞摄取，包括神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和内皮细胞(D’Alessandri等，1995；Dubreuil等，2003.JCellBiol162(2)：233-43；Erschbamer等，2005.JCompNeurol484(2)：224-33；Yune等，2007.JNeurosci.2007Jul18；27(29)：7751-61；Fu等，2007；Pixley等，2005.JCellSci.2005May1；118(Pt9)：1873-83.；Schreibelt等，2007.FASEBJ.2007Nov；21(13)：3666-76.；Schwab等，2004.Science295(5557)：1029-31)。
图2显示设计和在体外使用细胞评估的验证其对RhoA的敲低的siRNA化合物。然后将经验证的RHOA_4化合物体内用于其预期的神经保护、抗炎和神经再生能力，如图3A所示。运动器BBB分析持续进行6周，并在SCI和脊柱内注射siRhoA后观察到与作为对照的siGFP相比显著的运动器改善，如图3B所示。指示BBB评分行走改善的效应在测试的最早期观察到。不希望受理论束缚，这可能暗示siRNA效应是由于促进再生之外的保护机制，轴突生长可能需要更长的时间。
为了分析siRNA改变RhoA蛋白水平的能力，从5mm节段的脊髓组织提取蛋白并测量免疫印迹后的相对RhoA蛋白水平。在用siRhoA治疗的注射的挫伤位点中的RhoA蛋白水平与GFP对照相比较低，如图4所示，表明对挫伤后一周RhoA蛋白诱导的抑制。通过酶联免疫吸附测定进行的分析证实siRhoA治疗的样品中较低的RhoA免疫反应性水平(图5)。
为了比较实质内与鞘内递送，在挫伤后一天将Cy3.5标记的siRNA(REDD14/Cy3.5)使用团注施用应用至腰椎扩大处。图6A-6G中的结果显示染料广泛掺入到损伤中央以及邻近的嘴侧和尾侧区域但不是在远端颈位点的脊髓。siRNA穿透进入白质以及灰质。因此，腰椎区域的鞘内递送产生siRNA在脊髓胸廓区域的损伤位点中和其周围的优先摄取。
siRNA抑制RhoAmRNA的SCI诱导增加的能力通过定量RTPCR测量。挫伤后一天，siRNA经由腰椎穿刺注射，三天后，分析脊髓组织的相对RhoAmRNA水平。图7A和7B中的结果显示当注射30和100μg时，siRhoA治疗降低平均强度。“T1”指脊柱的T1水平，而”I”指损伤位点。
挫伤损伤后一天施用的siRhoA腰椎穿刺注射与siGFP对照相比的治疗效应使用BBB评分测量。前4周的观察未显示BBB评分的差异，但是第5-8周，siRhoA治疗产生比GFP对照更高的评分，在第8周观察到最大差异，如图8所示。此外，在用vonFrye纤维丝的爪压力测试中，用siRhoA治疗的大鼠与siGFP对照相比具有降低的疼痛敏感性(图9A和9B)。杀死这些大鼠后，通过固蓝染色测量的白质节约对于siRhoA治疗比GFP对照中更大(图10)。
实质内递送和SCI后siRNA的细胞定位
RhoAmRNA表达在挫伤后～1周逐渐升至峰水平，暗示这一时期代表引入特异性siRNA来抑制RhoA蛋白表达的机会窗口(Sung等，2003BrainRes959(1)：29-38；Conrad等，2005JCompNeurol487(2)：166-75；Erschbamer等，2005JCompNeurol484(2)：224-33)。为了确定可以掺入siRNA的细胞类型，将通过椎板切除术的T9-10的大鼠脊髓暴露、注射Cy3.5-标记的核酸酶稳定的siRNA，然后使用MASCIS冲击器以12.5mm重物坠落挫伤脊髓。不同的存活时间后固定的脊髓的共聚焦显微镜分析揭示广泛的Cy3.5荧光标记某些形态可辨的细胞，包括运动神经元、巨噬细胞、白质轴突和内皮细胞(图1A-1E)。运动神经元中的大细胞体和内皮细胞中的标记在多达2周的所有时间发现，但是白质的轴突特征中的标记仅在多达第3天检测(图1F)。在将1μg的siRNA注射到脊髓中后6周，至少一些siRNA仍然存在，至通过茎-和-环qPCR在0.5cm节段中检测到～8pg的程度。荧光和生物化学结果表明siRNA在注射后可在挫伤的脊髓中存活数天至数周。结果表明，当在挫伤性损伤时存在时，siRNA可被其中暗示RhoA作用参与SCI的细胞中的许多细胞(包括神经元、小胶质细胞、巨噬细胞和内皮细胞)摄取。
延迟腰椎注射后脊髓损伤位点中siRNA的摄取
本文描述的结果表明，在损伤时在脊髓中存在的siRNA可被摄取到多种细胞中，降低SCI诱导的对RhoA的上调，并对促进功能恢复具有长的持续效应。研究了可允许更大灵活性的其他施用路径(包括在不同时间点施用)。鼻内引入Cy3.5-标记的siRNA(Thorne等，2004)产生了至脑和脊髓的一些摄取。还鞘内进行siRNA到CSF的引入。将在40μl体积中的总共30μgCy3.5-标记的siRNA在12.5mm挫伤后的不同时间点(如24h)注射到腰椎扩大处，并分析24h后新鲜解剖的脊髓中荧光的分布。(脊髓的完整封固成像揭示在脊髓中在注射位点附近和嘴侧延伸至损伤位点的广泛Cy3.5标记，但是之外仅有微弱的Cy3.5标记(图6A)。在固定和低温切片后，观察到siRNA穿透进入白质，并且在灰质(尤其是损伤位点)中是最强的(图6D)。在更远端区域区域而不是在损伤位点近端观察到更弱的实质信号。还在挫伤后3天而不是1天注射的大鼠中观察到实质中可比较的荧光。更高剂量的Cy3.5-标记的siRNA(100μg)未在损伤位点产生更强的荧光但是低三倍的剂量(10μg)产生低得多的信号。结果表明，在SCI后1天递送后24h，大多数标记出现在脊髓周围，一些在实质中和沿着中央管。脊髓实质、特别是靠近损伤位点的强摄取可能是Cy3.5-标记的siRNA在受损伤的组织区域的增加的穿透造成的。当允许挫伤后24h注射的大鼠在注射后存活3天而不是1天时，发现荧光在接近损伤位点的实质中延伸～1cm。实质中的扩散暗示摄取可由于扩散以及由于脑脊液的循环而持续几天。因此，在SCI后一天腰椎区域中的鞘内递送产生与脊髓的其余部分相比siRNA在胸廓区域中损伤位点中和其周围的优先摄取。
实施例2：进一步的实验结果证实RhoA的siRNA抑制促进从SCI的功能恢复和预防异常性疼痛
材料和方法
动物和脊髓损伤：实验使用125只Sprague-Dawley雌性大鼠(10-11周龄)(Taconic，Germantown，NY)进行。对于SCI手术，用2％异氟烷(IsoFlo，AbbottLab，NorthChicago，IL)麻醉大鼠并通过椎板切除术在T9-10暴露脊髓，然后通过使10.0g杆从12.5或25mm高度坠落到暴露的T11脊髓上挫伤，如所述的(Constantini和Young，1994；Hasegawa等，2005)。在挫伤后和进行注射时，分别闭合肌肉和皮肤。向所有大鼠施用头孢唑林(25mg/kg)。
siRNA注射：损伤位点的注射在损伤前30分钟内进行；1μg在1μl中的siRNA注射到三个点中的每一个，包括损伤震中、和震中2mm嘴侧和尾侧(总共3μl)(Hasegawa等，2005)。每个注射使用无菌的5-μlHamilton注射器在～10min的时段内在～1mm的深度缓慢进行。对于腰椎穿刺，将麻醉的大鼠置于弯曲大鼠背部并提升腰椎区域的操作表面上。在L3-5脊柱突起上进行～1cm纵切，并收缩皮肤。使用100μlHamilton注射器使30-号针前进到脊椎管的L3-4或L4-5以将40μl施用到鞘内间隙。针在腰椎鞘内间隙的正确放置通过进入时“给出”的感觉和尾部轻拂指示(Lepore等，2005)。为了确定这一方法是否使脑脊液(CSF)流逆转至损伤位点区域，将40μlEvansBlue染料注射到腰椎扩大处，并且染料在注射后数秒钟内在暴露T9-10的椎板切除的大鼠中的出现证实流经损伤位点。
总细胞RNA制备和Q-RT-PCR：为了分离RNA，将动物注射100mg/kg戊巴比妥然后输注冷PBS。快速摘除脊柱并在干冰粉末上冷冻。切下中央在损伤(I)震中的5-mm脊髓节段以及邻近的5-mm近端和远端节段以及胸廓水平1(T1)的节段(Chang等，2009)。在一些实验中，将I节段在中线对切以产生脊髓的相同区域的两片组织，并且RNA和蛋白的分别提取使得能够比较来自配对组织的结果。对于RNA，用polytron匀浆器(KinematicaInc.)匀浆组织，并按照QiagenRNeasyPlusMini方案(Qiagen，Valencia、CA)制备RNA。使用Nanodrop分光光度计(ThermoScientificInc.)定量RNA，并且1μg总RNA用于第一链cDNA合成，使用SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以随机六聚体作为引物。PCR反应在40ngcDNA上使用1mM引物和SYBRGreen主混合物(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)使用AppliedBiosystems7500Fast机器在20μl反应中进行。将每个基因的表达值归一化为GAPDHcDNA的量以计算每个样品中存在的RNA的相对量。
通过ELISA的RhoA蛋白检测和定量：使用Teflon研棒在含有3ul的50x完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的150ulRIPA缓冲液(SigmaR0278)中将脊髓节段(5mm)匀浆。蛋白浓度使用MicroBCAProteinAssayKit(Pierce)根据生产商建议的96-孔板方案进行。RhoA蛋白通过免疫印迹用抗-RhoA单克隆抗体ARH03(CytoskeletonInc.)使用20μg蛋白上样来检测。为了避免在使用许多样品时跨不同免疫印迹进行归一化时的问题，使用更灵敏和可容纳每个平板更多样品的ELISA。ELISA96-孔板(NuncMaxiSorp)使用含80μg/ml蛋白或稀释的RhoA作为标准(CytoskeletonInc.)的100μl碳酸盐碳酸氢盐缓冲液包被，在4℃孵育过夜，第二天，使用抗-RhoA单克隆抗体ARH03根据生产商在ExpressElisaKit(GenScript)中建议的方案检测RhoA。在Biotek微板阅读器中测量450nm的比色强度，并用Gen5软件(Biotek)分析以根据RhoA标准曲线确定每个实验样品中的RhoA浓度。
组织处理和染色：向麻醉的动物心内灌输盐水溶液然后是4％多聚甲醛。摘除脊髓并标出损伤震中，在相同的固定剂中后固定4-5h，低温保护，包埋以用于冷冻切片，在恒冷切片机(Hacker-Bright)上以20μm切片。用ZeissStemiSV11显微镜在新鲜分离的脊髓中检测Cy3.5标记的siRNA以确定总的分布。然后在4％多聚甲醛中固定脊髓并低温切片。LFB染色和其他程序如所述地进行(Hasegawa等，2005)。对于免疫染色，切片以PBS中的10％正常山羊血清/0.3％TritonX-100封闭2h并在4℃用一级抗体孵育过夜。在用蛋白酶K(Dako)回收抗原后，用兔蛋白激酶C-γ(PKCγ)(1∶200)和小鼠ED1(1∶300)(Serotec，Raleigh，NC)的染色在相同切片上在25℃进行4min。用PBS洗涤切片并用二级抗-兔Alexa488或抗-小鼠Alexa568以1∶400在室温孵育1h。洗涤后，用Aqua-Mount(LernerLab)封固切片。使用Zeiss510共聚焦激光扫描显微镜(LSM)或ZeissAutomatedCellscanSystemforAxiovert200M对在同一时间染色的切片组采集图像。用血清素兔5-HT(1∶1000)(ImmunoStar)的染色使用不含抗原回收的相同程序进行并用抗兔Alexa568(1∶200)作为二级抗体。
组织学定量：使用LFB染色定量来分析组织节约。用于分析的所有冠状切片在同一时间进行LFB染色以确保一致的显色，然后用FilmScannerLS-8000ED(Nikon，Japan)以4000dpi分辨率扫描。在Photoshop中将彩色图像转化为灰度，并对个体切片进行轮廓描绘，使用NIHImageJ获得每个切片的总像素面积。使用恒定阈值获得LFB染色的超阈值像素，并测量得到的面积。节约的组织定义为超阈值面积除以每个切片中轮廓描绘的总面积。在中央位于损伤震中的10mm脊髓上以1mm间隔测量来自每个脊髓的图像。在几乎所有情形中，具有最小节约的组织的位置对应于指定的损伤震中，并且当其不是时，将其重新定义为0位置。然后计算节约的组织的平均值，并绘制为位置的函数(图11)。对于ED1染色，从每个动物选择1mm间隔的11个冠状切片用于定量。涵盖每个位置的冠状切片的平铺图像用20x物镜(N.A.＝0.75)在Axiovert200M荧光显微镜(Zeiss)上拍摄，并用ZeissLSM直方图软件分析。对所有切片应用恒定的阈值，将每个切片的超阈值面积除以轮廓描绘的总面积以获得百分比ED1+。CST位于中央管上方的中线，并对此区域的PKCγ染色进行轮廓描绘(参见图12C)和提取以用于定量。在对应于板II和背CST的区域中，损伤位点8mm嘴侧的切片显示正常并表达可比较水平的PKCγ。因此，损伤8mm嘴侧的所有超阈值面积的平均值用于其他切片的归一化。每个CST提取区域的超阈值面积在排除由于巨噬细胞的自身荧光(参见图12C插图)后获得，然后归一化。所有定量分析由对治疗组为盲的研究者进行。
行为分析：使用21-点BBB评分(Basso等，1996.J.Neurotrauma12：1-21；Basso等，1996.ExpNeurol139(2)：244-56；Hasegawa等，2005.ExpNeurol193：394-410)由不知晓实验治疗的BBB评分团队每周对运动器恢复进行评估(Hasegawa等，2005.ExpNeurol193：394-410)。对于异常性疼痛，后肢回缩阈值使用一系列vonFrey纤维丝(Stoelting，IL)以范围在0.6至18g的校准的弯曲力测定(Dixon，1980.AnnuRevPharmacolToxicol20：441-62；Hains和Waxman，2006.JNeurosci26(16)：4308-17)。将大鼠个体地置于线网底的笼子中，在以升序力将vonFrey纤维丝应用至腹侧后肢跖面的中央区域之前，允许大鼠适应30min。仅当大鼠静止并以所有四只爪站立时进行测试。仅当后肢完全从网底抬起时缩回响应才被视为有效。当对于给定动物建立缩回响应时，使用具有下一个更低的力的vonFrey纤维丝进行重新测试，直至不发生响应。试验由向每个后肢应用vonFrey纤维丝五次组成。后肢回缩阈值定义为导致五次相连应用中至少三次缩回的最低力。首先确定左后肢的阈值，然后在5min后确定同一大鼠的右后肢的阈值，并计算平均阈值(Dixon，1980AnnRevPharmacolToxicol20：441-462；Hains和Waxman，2006JNeurosci26：4308-4317)。侧后肢测试也使用vonFrey纤维丝来探测侧后肢缩回，并如上计算阈值。
结果
siRhoA抑制SCI后的RhoA蛋白诱导并促进后肢行走恢复
通过qPCR测试设计为靶向大鼠RhoA序列的一组siRNA对RhoAmRNA的敲低。在大鼠REF52细胞中，最强的siRNA在5nM下降低RhoAmRNA水平达＞80％，并且其在人HeLa细胞中甚至更有效地敲低RhoA表达(图2A)。在大鼠脑脊液中在37℃孵育10h后，siRNA未显示降解迹象，暗示其应该在体内稳定至少数小时，或许数天(图2B)。为了分析此siRNA改变SCI后的RhoA蛋白水平的能力，将siRhoA或作为阴性对照的siGFP在挫伤前30分钟注射到损伤位点附近。在一周后，用RIPA缓冲液提取脊髓组织的5mm节段，并将等量蛋白在SDS凝胶上进行分辨，用针对RhoA的抗体免疫印迹。在注射siGFP的大鼠的中央位于损伤位点的5mm节段中或在未注射的脊髓中检测到最高水平的RhoA免疫反应性。在注射siRhoA的损伤最严重的脊髓中观察到较低的RhoA免疫反应性(图3A)。结果表明在损伤时siRhoA向脊髓的递送降低一周时RhoA蛋白的上调。为了测试SCI后的RhoA敲低是否影响功能恢复，进行在脊髓内注射siRhoA或作为对照的siGFP后持续6周的运动器BBB分析的相似实验。在胸廓水平T9-10的12.5挫伤后，注射siGFP的动物显示典型的恢复模式，BBB评分达到～12的平台(Basso等，1996)，而注射siRhoA的组达到～15的更高平台(图3B)。BBB行走评分的改进在测试的最早时间出现，暗示siRhoA效应可能涉及保护性机制。另两组大鼠注射相同剂量的siRNA并测试更严重的25mmMASCIS挫伤后的恢复。siGFP治疗组中的平均BBB评分在一定程度上低于预期的～8达到平台。不希望受理论束缚，更严重的挫伤前的注射可加重损伤。siRhoA治疗组的平均BBB评分更高，但是差异不是统计学上显著的(图3C)。结果暗示在临损伤前向脊髓中注射siRhoA显著改善了12.5mm挫伤后的恢复，并显示对于更严重的25mm挫伤的有益趋势。
腰椎注射siRNA后3天对SCI诱导的RhoA表达的抑制
30μg剂量的Cy3.5-标记的siRNA是在腰椎注射后产生损伤位点的强摄取的最低剂量，测试了这一剂量的敲低活性。siRNA抑制SCI后RhoAmRNA和蛋白水平的能力分别通过定量RT-PCR和ELISA测量。挫伤后一天，将siRNA经由腰椎穿刺注射，三天后，切下中央在SCI位点的5mm节段，然后沿中线对切。从对切的组织的一半提取的RNA通过RT-PCR进行RhoA分析。RhoAmRNA在T9-10损伤位点在12.5mm挫伤后4天的相对水平为仅SCI组中第一胸廓节段(T1)中发现的水平的1.96+/-0.08倍(图7A)。腰椎注射30μgsiRhoA降低SCI诱导的RhoAmRNA至T1水平的1.41+/-0.12倍，但是注射对照siGFP未显著抑制RhoAmRNA的相对水平(图7A)。更高剂量的100μgsiRhoA显著抑制RhoAmRNA至T1水平的1.2+/-0.10倍(图7A)。RhoA蛋白的相对水平通过使用对切脊髓后获得的另一半SCI样品从以上分析的相同大鼠制备的蛋白提取物的ELISA测量。100μg剂量的siRhoA与注射siGFP的对照损伤(0.96+/-0.06)或未注射(1.00+/-0.04)相比显著抑制RhoA蛋白的相对水平至0.65+/-0.04，而30μg剂量显示相似的趋势，降低相对水平至0.71+/-0.08(图7B)。结果表明，使用展示在受损伤的脊髓中的强摄取的siRNA剂量，SCI后一天腰椎注射siRhoA降低3天后的RhoAmRNA和蛋白水平。
腰椎注射siRhoA预防SCI大鼠中的异常性疼痛
12.5mmMASCIS挫伤损伤后一天施用的100μg剂量siRhoA的腰椎穿刺注射与siGFP对照相比的治疗效应使用每周BBB评分测量。在使用4只大鼠/组的第一实验中，BBB评分没有显著差异，但是使用siRhoA有轻微的改善趋势。使用vonFrey纤维丝(Hains和Waxman，2006.JNeurosci26(16)：4308-17)的后肢压力测试测量触觉超敏性，并发现在siRhoA组中在6-8周时下降。还进行了使用7只大鼠/治疗的更大组的第二实验，发现siRhoA和siGFP之间在异常性疼痛但不是在运动中的显著差异。未损伤的大鼠对于～3g的压力回缩阈值(PWT)是相对不敏感的，而脊柱挫伤的大鼠至2周时展示增加的敏感性(＜1g)并持续贯穿至第8周的剩余存活期(图9A)。未观察到siRhoA治疗与siGFP对照相比的增加的敏感性的迹象。相反，用siRhoA治疗的大鼠至第6周时具有降低的触觉敏感性，并继续改善至第8周时达到损伤前水平(图9A)。还使用侧爪测试观察到SCI后增加的敏感性的相似时程(图9B)，侧爪测试不受光洁爪测试时可发生的反射反应的复杂化。在两种测试中，8周时的回缩阈值在注射100μgsiRhoA后显著高于用对照siGFP治疗。合并的结果表明siRhoA抑制挫伤性SCI后通常发展的异常性疼痛。本文提供了预防受治疗者中的异常性疼痛的方法，包括以有效预防受治疗者中的异常性疼痛的量和时间段通过腰椎注射向受治疗者施用定向至与异常性疼痛有关的靶基因的siRNA化合物。
siRhoA治疗促进白质节约
在SCI研究中用RhoA功能的抑制剂观察到白质节约(Lord-Fontaine等，2008.JNeurotrauma25(11)：1309-22)。为了分析以上描述的挫伤的大鼠组中siRNA注射对白质保留的效应，将8-周存活期后的组织灌输固定，并用LFB对冠状脊髓切片染色。在几乎所有脊髓中，保留的白质在损伤位点的中央最低，在更嘴侧和尾侧区域具有增加的LFB染色(图10)。用siRhoA、从损伤位点中央向嘴侧和尾侧以1mm间隔节约的白质百分比的测量产生比在损伤位点中央和在周围区域用对照siGFP治疗更高的平均值。在损伤位点1mm嘴侧用siRhoA治疗的保留最强(图10)。结果表明降低RhoA水平改善脊髓挫伤后的白质节约。在一个实施方案中，提供了节约具有脊髓损伤的受治疗者的白质的方法，包括以有效节约受治疗者中的白质的量和时间段通过腰椎注射向受治疗者施用定向至靶基因的siRNA化合物。
siRhoA治疗降低ED1染色
脊髓损伤后髓磷脂的损失至少部分归因于活化的巨噬细胞的强烈和持续作用(Blight，1992；Kigerl等，2009)。对以上用于髓磷脂节约分析的相同组的大鼠的ED1免疫染色暗示siRhoA治疗的大鼠中比对照存在更少的活化的巨噬细胞(图12A)。在脊髓损伤后6周，对照siGFP治疗组中ED1-阳性面积的测量显示在损伤震中的峰值，信号在嘴侧和尾侧区域下降，如先前所述(Fleming等，2009.JNeurosurgSpine11(5)：575-87)。在siRhoA治疗组在损伤位点以及在嘴侧但不是在尾侧脊髓区域检测到较低水平的ED1-阳性面积(图12B)。其中siRhoA治疗最有效地降低ED1-阳性细胞水平的区域(0至+2mm)对应于其中白质节约最强的区域(图10)。该结果表明用针对RhoA的siRNA治疗降低8周后在损伤位点和在其中发生少突胶质细胞死亡和髓磷脂损失的嘴侧区域活化的巨噬细胞的水平。
siRhoA治疗增加PKCγ纤维
在脊髓挫伤后，许多纤维束受到损害，并且存活的轴突从延伸的损伤位点收缩。位于背-内脊髓的皮质脊髓束(CST)可通过PKCγ染色鉴定(Bradbury等，2002.Nature.2002Apr11；416(6881)：636-40)，并且其对SCI特别敏感，并显示挫伤后至损伤位点的极少再生(Demediuk等，1990；Hill等，2001；Steward等，2003)。挫伤后用对照siRNA治疗，PKCγ+CST在损伤位点8mm嘴侧是相对未受损的，但是染色在3mm嘴侧处剧烈减少(图12C)。冠状切片中的分析显示PKCγ染色在siGFP治疗组中在损伤位点2mm嘴侧的完全丧失，而在嘴侧更远区域远至距损伤位点8mm染色渐进增加(图12D)。相反，用siRhoA治疗的大鼠在损伤位点2mm嘴侧和在其中它们没有显著不同的嘴侧更远至+8mm的每个位置具有比对照siRNA显著更多的PKCγ染色(图12D)。结果暗示抑制SCI后的RhoA诱导产生更多的CST纤维。
siRhoA治疗促进血清素能纤维生长
在先前的研究中，脊束的增加的染色与降低的异常性疼痛有关(Ramer等，2004.JNeurosci.2004.24(48)：10796-805.)，并且最近已证实血清素功能(Wei等2010.JNeurosci.30(25)：8624-36.)。因此，测量了挫伤位点尾侧血清素能纤维染色的程度。即使在低放大率下(图12)，siGFP对照和siRhoA注射的脊髓之间存在明显的差异，后者中具有更强的染色。在更高放大率的共聚焦图像上在八个区域进行的检测挫伤位点12mm尾侧的纤维的血清素定量分析+纤维免疫染色显示siRhoA治疗大鼠中与siGFP对照相比显著更长的长度(图12)。这些结果表明大鼠中SCI后用siRhoA治疗时血清素能纤维生长的显著改善。
实施例3：siRhoA和siTLR4可预防和治疗异常性疼痛
大鼠中定向至RhoAmRNA(SEQIDNO：1)或TLR4mRNA(SEQIDNO：2)的siRNA在脊柱神经连接模型(Chung)中的治疗活性
Chung(Kim和Chung，1992.Pain.1992Sep；50(3)：355-63.)大鼠模型复制了具有灼性神经痛、或由于周围神经损伤的灼伤性疼痛的人患者的症状。Chung程序产生对有害的热的长持续性痛觉过敏和受影响的足的机械性异常性疼痛。具有脊柱神经连接(SNL)的大鼠可用于鉴定用于缓解神经性疼痛的活性dsRNA化合物。
Chung模型大鼠中神经性疼痛的缓解
在重190至2100克的雄性Sprague-Dawley大鼠中进行由Kim和Chung，1992，先前描述的手术程序，以诱导痛觉超敏状态。使动物适应至少5天。在适应过程中和贯穿整个研究持续期间，动物圈养在限制访问的啮齿动物设施内，并以最多5只大鼠/笼的组保持。动物被提供有随意的啮齿动物饮食并可自由饮水。每日监测自动控制的环境条件。给予动物唯一的动物识别尾部标志。
在适应期期间，将动物随机指定到实验组。每个给药组将在分别的笼中保持，以避免可能通过消耗粪便物造成的交叉污染。每笼将圈养2-3只动物。108只大鼠根据下面的表B分成9个测试组。简单而言，将大鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪钠麻醉，随后，分离邻近脊柱的左侧L-5和L-6脊柱神经并连接。缝合肌肉，并用夹钳闭合皮肤。七天手术后恢复期，测试动物以包括在研究内。当满足以下标准中的一种或多种标准时，检测到疼痛：
用嘴舔手术爪，伴有轻度咬或牵拉尾部；将手术腿抬升到空中；以神经损伤对侧的一侧负重；后爪变形和异常行走；左后爪虚弱。动物能够移动它的腿以确保L4不受影响。
Alzet泵：在手术日将来自1M、5M、7M和9M组的动物皮下植入渗透泵。在脊髓的鞘内间隙中植入聚乙烯管，结束于水平L4，将插管连接到泵。泵速率为0.5ulhr(±0.1ul/hr)。
腰椎注射：来自2M、4M、6M和8M组的动物如下给予腰椎团注：将鞘内管插入到动物IT间隙的L4-L5水平，并缓慢给药测试剂。该方法中使用的日程表在图13A和13B中提供。图13A再现了自在SNL后第14天(d14)向动物施用测试siRNA起的异常性疼痛治疗。图13B再现了自在SNL后第1天(d1)向动物施用测试siRNA起的异常性疼痛预防。
表B：
*在不注射测试剂的日子经由鞘内泵植入给予动物盐水
**泵速率为0.5ul/hr(±0.1ul/hr)，持续14天
使用vonFrey装置(触觉测试)评估对触觉刺激的痛觉超敏反应。为估计爪缩回的50％机械阈值，向后足应用vonFrey毛，避开足垫。将被校准为以增加的对数力弯曲的每个vonFrey毛以足以引起持续大约六到八秒的轻微弯曲的力垂直地压到足上。如果足急剧缩回，记录阳性响应。
图14A显示与接受盐水(1M)或加巴喷丁(3M)的动物相比，来自1M、3M、5M、7M和9M组的动物，即来自从第0天至第14天(5M和9M)或从第14天至第28天(7M)连续地从植入的微泵接受siRhoA(5M和7M)或siTLR4(9M)的动物的结果。在用siRhoA和siTLR4治疗的动物中获得阳性效应。数据显示早至SNL后14天并持续至第28天的效力。siRhoA和siTLR4二者均有效治疗异常性疼痛。
图14B显示来自2M、4M、6M，和8M组的动物，即来自在SNL后一天和异常性疼痛迹象出现前或在SNL后14天(siRhoA，6M)接受siRhoA(4M)或siTLR4(8M)的单次腰椎注射的动物的结果。数据表明siRhoA和siTLR4二者均有效治疗和预防异常性疼痛。单次腰椎注射后28天记录的疼痛水平显示siTLR4和siRhoA二者均有效降低对疼痛的敏感性。
表C显示大鼠神经性疼痛的脊柱神经连接(SNL)模型中评估siRhoA和siTLR4的抗伤害和止痛活性的实验设置。在所有组中，经由单次腰椎团注向大鼠施用siRNA。4M和5M组设计为还与对照siRNA相比评估预防异常性疼痛中的siTLR4。6M和7M组设计为还与对照siRNA相比评估治疗异常性疼痛中的siRhoA。
以上描述以及表B和C中呈现的实验可用于测试针对表A中列出的靶基因中的任何一种的双链RNA化合物在治疗或预防神经性疼痛中的效应。
表C：
虽然已详细描述了本发明，但是应理解，可对其进行各种变化、取代和改变而不偏离所附权利要求书中定义的本发明的精神和范围。