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1、(10)授权公告号 CN 102643755 B (45)授权公告日 2013.03.27 CN 102643755 B *CN102643755B* (21)申请号 201210126265.7 (22)申请日 2012.04.26 CCTCC No: M 2012047 2012.02.29 C12N 1/14(2006.01) C12R 1/82(2006.01) (73)专利权人 黑龙江大学 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府 路 74 号 (72)发明人 郑春英 孙雅北 白长胜 孔德崴 谭佳音 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 金永。
2、焕 CN 102154114 A,2011.08.17, 全文 . CN 1796537 A,2006.07.05, 全文 . (54) 发明名称 一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生 真菌 (57) 摘要 一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内 生真菌， 它涉及一株内生真菌。通过发酵甘草 提高甘草次酸含量的内生真菌， 它为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 已在中国典 型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2012047， 保藏地址为武汉市武汉大学， 保藏日 期为 2012 年 2 月 29 日。本发明中通过发酵甘草 提高甘草次酸含。
3、量的内生真菌， 能够以甘草为底 物对其进行发酵可使甘草中的甘草次酸含量显著 升高 ； 甘草次酸是经典的抗炎药物目前在医药化 妆品等领域中广泛应用， 还具有防癌和抗癌作用 ； 本发明对采用甘草内生真菌 RE11 发酵甘草生产 甘草次酸具有指导意义。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张鑫蕊 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌， 其特征在于它为产。
4、黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 已在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为 CCTCC No ： M 2012047， 保藏地址为武汉市武汉大学， 保藏日期为 2012 年 2 月 29 日。 权 利 要 求 书 CN 102643755 B 2 1/4 页 3 一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌 技术领域 0001 本发明涉及一株内生真菌。 背景技术 0002 甘 草 为 豆 科 (Leguminosae) 甘 草 属 (Glycyrrhiza Linn) 属 乌 拉 尔 甘 草 (G.uralensis Fisch)， 胀果甘草(G.infl。
5、ate Bat)和光果甘草(G.glabra L)的干燥根和根 茎， 广泛分布于我国东北、 西北及华北等地。甘草性味甘平， 为补气类中药， 具有补中益气、 清热解毒、 润肺止咳、 缓急止痛、 调和药性等功效。中医处方离不开甘草， 自古至今， 广为药 用， 兼有 “国老” 的尊号。近年来， 野生甘草因过度采挖强度而濒临灭绝， 甘草已被列入 野 生药材资源保护条例 的国家二级保护植物。 0003 甘草的主要成分为甘草次酸， 具有防癌、 抑癌的作用， 是医药、 化妆品、 食品的生产 原料。甘草次酸的来源主要有两个途径 ： 一是化学合成， 二是从甘草中提取。上述两种途径 均需要利用甘草资源， 因此如何。
6、高效利用甘草资源是人们的研究热点。 发明内容 0004 本发明提供了一株通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌。 0005 本发明通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌， 它为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 已在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为 CCTCC No ： M2012047， 保藏地址为武汉市武汉大学， 保藏日期为 2012 年 2 月 29 日 ； 它在 PDA 固体培养基上培养 7d后， 菌落直径为68cm， 菌落为绿色， 基质为黄色， 菌丝较密集， 菌落边缘整齐， 紧贴培养 基， 产分生孢子， 分生孢子头呈圆柱状， 分生孢子单生，。
7、 单细胞。 0006 本发明通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌， 它为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 其 ITS 序列提交至 NCBI 网页， 通过 Blast 搜索与所得到的序列相似 性高的序列， 并通过 MEGA5.03 软件构建系统进化树， RE11 菌株的 ITS 序列与青霉属菌 (Penicillium chrysogenum， 编号 GQ161752.1) 菌株的相似性都达到了 99以上， 结合形 态学观察结果， 确定内生真菌 RE11 为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)。 0007 本发明通过发酵甘草提高甘草。
8、次酸含量的内生真菌， 它为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 已在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号为 CCTCC No ： M2012047， 保藏地址为武汉市武汉大学， 保藏日期为 2012 年 2 月 29 日。 0008 本发明利用微生物制药手段提取分离甘草健康植株的内生真菌 RE11， 以其发酵 甘草， 以 HPLC 法为分析手段测定经甘草内生真菌 RE11 发酵甘草后甘草次酸的含量， 结果 甘草发酵后甘草次酸含量显著高于生药。将获得的内生真菌 RE11 菌株通过形态学观察和 18SrDNA 序列分析鉴定其种属。 0009 本发明通过发酵甘草提。
9、高甘草次酸含量的内生真菌， 它为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 能够以甘草为底物对其进行发酵可使甘草中的甘草次酸含量显著升 高 ； 甘草次酸是经典的抗炎药物目前在医药化妆品等领域中广泛应用， 还具有防癌和抗癌 说 明 书 CN 102643755 B 3 2/4 页 4 作用 ； 本发明对采用甘草内生真菌 RE11 发酵甘草生产甘草次酸具有指导意义。 附图说明 0010 图1为具体实施方式一中产黄青霉(Penicillium chrysogenum)RE11的孢子显微 结构图 ； 0011 图 2 为具体实施方式一中产黄青霉 (Penicillium c。
10、hrysogenum)RE11 的 PCR 扩增 的电泳图， 其中 M 泳道表示 Marker， 1 泳道表示 RE11 ； 0012 图3为具体实施方式一中产黄青霉(Penicillium chrysogenum)RE11的系统进化 树图 ； 0013 图 4 为具体实施方式一中甘草次酸对照品的 HPLC 色谱图， 其中 1 表示甘草次酸 ； 0014 图 5 为具体实施方式一中甘草的 HPLC 色谱图， 其中 1 表示甘草次酸 ； 0015 图 6 为具体实施方式一中甘草加入对照品后甘草次酸的 HPLC 色谱图， 其中 1 表示 加对照品后甘草次酸 ； 0016 图 7 为具体实施方式一中。
11、 RE11 发酵甘草后甘草次酸的 HPLC 色谱图， 其中 1 表示 甘草次酸。 具体实施方式 0017 具体实施方式一 ： 本实施方式通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌， 它为 产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 已在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏编号 为 CCTCC No ： M 2012047， 保藏地址为武汉市武汉大学， 保藏日期为 2012 年 2 月 29 日。 0018 本实施方式中产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 它在 PDA 固体培养基 上培养7d后， 菌落直径为68cm， 菌落为绿色， 基质为。
12、黄色， 菌丝较密集， 菌落边缘整齐， 紧 贴培养基， 产分生孢子， 分生孢子头呈圆柱状， 分生孢子单生， 单细胞。 0019 本实施方式中产黄青霉(Penicillium chrysogenum)RE11， 其生长温度为28， 生 长 pH 值自然。 0020 本实施方式中通过发酵甘草提高甘草次酸含量的内生真菌， 它为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 该菌株分离自健康的野生甘草的根茎， 采自大庆地区， 植株年龄 3 年， 植株健壮， 无病虫害， 其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业 实验室 ； 它按以下步骤进行分离培养 ： 0021 选取健康的野。
13、生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分， 切成 1cm 小段于无菌超净台内将甘草的根茎按下述方法进行表面消毒 ： 75酒精浸泡 1min-2次 氯酸钠浸泡 15min- 无菌水冲洗 3 次 ； 用无菌手术刀将野生甘草的根茎从中间切开， 分别置 于 5甘草提取液马铃薯固体分离培养基和 5甘草提取液马铃薯液体分离培养基中， 于 28恒温水浴摇床和恒温培养箱中， 培养 3 5d， 待实验材料周围长出菌体， 挑取菌体转入 平板 (5甘草提取液马铃薯固体分离培养基 ) 多次划线分离纯化， 将纯化后的菌株置于斜 面固体培养基中， 4保存备用 ； 0022 其中 5甘草提取液马铃薯固体分离培养基每。
14、 L 由 200g 的马铃薯、 20g 的葡萄糖、 20g 的琼脂和余量的 5甘草提取液组成， pH 值为 7.0 7.2， 121下高压灭菌 30min ； 0023 5甘草提取液马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、 20g的葡萄糖和余量 说 明 书 CN 102643755 B 4 3/4 页 5 的 5甘草提取液组成， pH 值为 7.0 7.2， 121下高压灭菌 30min ； 0024 斜面固体培养基为取 5mL5甘草提取液马铃薯固体分离培养基装于试管中， 121高压灭菌 30min 后， 铺成斜面冷却， 以备保存菌种。 0025 结果 ： 从野生甘草的根茎中分离出内生真菌。
15、 RE11， 并且阴性对照中对照平板和对 照液体培养基内均无任何菌长出， 多次重复均如此， 证明所分到的菌是植物内生真菌， 而不 是表面的附生菌。筛选出的内生真菌 RE11 根据 真菌分类学 、真菌鉴定手册 和 半知菌 属图解 进行形态学鉴定， 其菌落特征和孢子形态与青霉属菌特征极为相近， 孢子显微结构 如图 1 所示 ； 0026 分子鉴定 ： 内生真菌 RE11 发酵液抽滤得菌丝体用 25乙醇漂洗 2 次， 灭菌的去离 子水冲洗 2 次， 离心去上清液， 提取总 DNA 后进行目的片段的 PCR 扩增， 将含有目标条带的 PCR 产物全部进行再一次的点样， 用 2的琼脂糖凝胶电泳， 在紫外。
16、灯下用解剖刀将目的条 带切下， 用 DNA 胶回收试剂盒回收， 制备感受态大肠杆菌细胞， 将 PCR 产物与 pMD18-T 载体 进行连接后， 连接产物加入到感受态细胞中， 进行进行菌落 PCR 验证 ； 挑取单菌落进行大肠 杆菌转化子的 PCR 检测， 证明目的片段已成功转化进入感受态细胞中后， 将克隆阳性菌株 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序 ； 所测定的核苷酸序列在 NCBI 数据库中应用 BLAST 分析进行同源性比较， 并根据分子生物学研究的基本原理选择相应种属代表菌株的 18S rDNA序列应用软件CLUSTALX 1.83和MEGA5.03以近邻结合法(Neighbor-。
17、joining)构 建系统发育树， bootstrap 检验值 50 (1000 重复 )， 确定目标菌株的分类地位 ； 0027 内生真菌 RE11 基因组经尿素法提取后， 采用 PCR 扩增后凝胶成像结果如图 2 所 示， 在 500bp 附近得到一扩增片段 ( 碱基序列见 SEQ ID NO ： 1)， 证明已成功从内生真菌 RE11 菌株中提取出其基因组 DNA ； 0028 根据内生真菌 RE11 的 ITS 序列提交至 NCBI 网页， 通过 Blast 搜索与所得到的 序列相似性高的序列， 并通过 MEGA5.03 软件构建系统进化树 ( 见图 3)， RE11 菌株的 ITS 。
18、序列与青霉属菌 (Penicillium chrysogenum， 编号 GQ161752.1) 菌株的相似性都达到了 99以上， 结合形态学观察结果， 确定筛选出的内生真菌 RE11 为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)。 0029 本实施方式中产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 其发酵甘草提高甘草 次酸含量的实验结果如表1所示， 甘草内生真菌RE11发酵甘草提高甘草次酸含量的实验结 果表明， RE11 能够通过发酵甘草使其中的甘草次酸含量显著升高。 0030 表 1 0031 0032 注 ： 同生药组相比 *P 0.05， *。
19、P 0.01 ； 同阴性对照组相比 P 0.05， P 0.01 ； PDA 对照无甘草次酸产生。 说 明 书 CN 102643755 B 5 4/4 页 6 0033 本实施方式中产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 其发酵甘草提高甘草 次酸含量的检测如下 ： 0034 取干燥甘草根， 用粉碎机粉碎后过 40 目筛。精确称取 6g 甘草粉， 放入 100mL 三角 瓶中， 向其中加入 30mL 的蒸馏水， 密封后， 121高压灭菌 30min。取出， 作为底物。 0035 向已活化的 RE11 菌株试管中加入无菌水， 制成 1106CFU/mL 的菌悬液，。
20、 将此菌悬 液 5mL 加入到底物中， 另取甘草粉加等量的无菌水作为空白对照， 将制备好的样品于 28， 120r/min 摇床培养 14 天。取出， 冻干， 即为甘草发酵样品， 备用。每个样品做 6 个重复。 0036 精密称取甘草发酵样品 1g， 准确加入 10mL 的色谱甲醇， 称重， 超声提取 2h， 取出， 放冷， 以色谱甲醇补足重量， 过滤， 取续滤液 4mL， 于 10mL 容量瓶中定容， 待测。 0037 同时精密称取甘草生药 1g 加入 10mL 的色谱甲醇， 称重， 超声提取 2h， 取出， 放冷， 以色谱甲醇补足重量， 过滤， 取续滤液 4mL， 于 10mL 容量瓶中定。
21、容， 作为生药对照待测。 0038 甘草发酵前后甘草次酸含量的测定 ： 0039 色谱条件 0040 色谱柱 ： VenusiL XBP-C18柱 (4.6mm250mm， 5m) ； 0041 流动相 ： 甲醇 - 水 - 冰醋酸 (82 17 1) ； 0042 流速 ： 1mLmin-1； 0043 检测波长 ： 254nm ； 0044 柱温 ： 25 ； 0045 进样量 ： 10L 0046 在色谱条件下， 甘草内生真菌 RE11 发酵甘草所制备的供试品与甘草次酸对照品 相应位置的色谱峰一致， 而且色谱峰经过对照品加入法得到了较好的确认， 结果见图 4、 5、 6 和 7， 结论 。
22、： 内生真菌 RE11 为产黄青霉 (Penicillium chrysogenum)RE11， 其以甘草为底物 进行发酵能够使甘草中甘草次酸含量显著升高， 本实施方式对采用甘草内生真菌 RE11 生 产甘草次酸具有指导意义。 说 明 书 CN 102643755 B 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 102643755 B 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102643755 B 8 2/3 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102643755 B 9 3/3 页 10 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102643755 B 10 。