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1、(10)申请公布号 CN 102154505 A (43)申请公布日 2011.08.17 CN 102154505 A *CN102154505A* (21)申请号 201110101438.5 (22)申请日 2011.04.20 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 苟德明 地址 518060 广东省深圳市南山区南海大道 3688 号深圳大学实验楼 S409 申请人 康康 (72)发明人 苟德明 康康 (54) 发明名称 一种检测 miRNA 的方法及引物及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种检测 miRNA 的方法及引 物及其。
2、应用， 使用由特异碱基和 Oligo(dT) 组成 的反转录引物对样品中 miRNA 进行反转录， 然后 用特异上游引物、 通用下游引物和通用探针对 miRNA 进行 real-time PCR 定量检测。本发明的 特点是灵敏性和特异性显著高于传统方法， 可高 通量分析， 操作简单、 快速， 成本低， 可广泛应用于 肿瘤等重大疾病的早期诊断和预启。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 4 页 CN 102154506 A1/2 页 2 1.一种用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)。
3、引物， 其特征在于， 所述S-Oligo(dT)引物 从 5 端开始由 PCR 通用引物序列、 通用探针序列、 Oligo(dT) 及与目的 miRNA 分子的 3 端 核苷酸互补配对的特异性序列 4 部分组成。 2. 根据权利要求 1 所述的用于定量检测 miRNA 的 S-Oligo(dT) 引物， 其特征在于， 所 述 S-Oligo(dT) 引物从 5 端开始依次是 14 20 个碱基的 PCR 通用引物序列， 14 20 个 碱基的通用探针序列， 8 30 个 dT 及与目的 miRNA 分子的 3 端 3 8 个核苷酸互补配对 的特异性序列。 3.根据权利要求1所述的用于定量检测m。
4、iRNA的S-Oligo(dT)引物， 其特征在于， 所述 引物从 5 端开始依次是 16 个碱基的 PCR 通用引物序列， 17 个碱基的通用探针序列， 11 个 dT 及与目的 miRNA 分子的 3 端 6 个核苷酸互补配对的特异性序列。 4. 一种使用权利要求 1 所述的用于定量检测 miRNA 的引物定量检测特定 miRNA 的方 法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： S100、 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物的设计 ： 根据目的 miRNA 的序列信 息， 设计 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物 ； S200、 总 RNA 提取。
5、 ： 将细胞裂解， 提取总 RNA， 并鉴定 RNA 纯度和完整性、 测定 RNA 的浓 度 ； S300、 RNA 加尾 ： 用 PolyA polymerase 对总 RNA 进行加尾， 得到 RNA-PolyA ； S400、 第一链 cDNA 的合成 ： 以 RNA-PolyA 为模板， 用 S-Oligo(dT) 引物进行 miRNA 的反 转录 ； S500、 miRNA 的 real-time PCR 定量检测 ： 以 miRNA 的第一链 cDNA 为模板， 用 miRNA 特 异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测， 然后对PCR结果进行数据分析。 5。
6、. 根据权利要求 4 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其特征在于， 所述 miRNA 特异上 游引物是不含 3 端 3 8 个碱基的 miRNA 特异序列， 所述 miRNA 的下游通用引物来自于 S-Oligo(dT) 引物的 14 20 个碱基的通用引物序列。 6. 根据权利要求 4 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其特征在于， 步骤 S500 中进行 real-time PCR 定量检测采用的是探针法或 SYBR 荧光染料法 ； 所述探针法所用探针为通用 探针， 其序列来自于 S-Oligo(dT) 引物上的 14 20 个碱基的通用探针序列。 7.一种使用权利要求1所述的用。
7、于定量检测miRNA的引物定量检测不同的miRNA的方 法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： S100、 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物的设计 ： 根据不同的目的 miRNA 的序 列信息， 设计不同的 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物 ； S200、 总 RNA 提取 ： 将细胞裂解， 提取总 RNA， 并鉴定 RNA 纯度和完整性鉴定和测定 RNA 的浓度 ； S300、 RNA 加尾 ： 用 PolyA polymerase 对总 RNA 进行加尾， 得到 RNA-PolyA ； S400、 第一链cDNA的合成 ： 以RNA-Pol。
8、yA为模板， 将不同的S-Oligo(dT)引物组合起来 进行 miRNA 的反转录 ； S500、 miRNA的real-time PCR定量检测 ： 以miRNA的第一链eDNA为模板， 用各个miRNA 特异上游引物和下游通用引物进行 real-time PCR 定量检测， 然后对 PCR 结果进行数据分 析。 权 利 要 求 书 CN 102154505 A CN 102154506 A2/2 页 3 8. 根据权利要求 7 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其特征在于， 所述 miRNA 特异上 游引物是不含 3 端 3 8 个碱基的 miRNA 特异序列， 所述 miRNA 的。
9、下游通用引物来自于 S-Oligo(dT) 引物的 14 20 个碱基的通用引物序列。 9. 根据权利要求 7 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其特征在于， 步骤 S500 中进行 real-time PCR 定量检测采用的是探针法或 SYBR 荧光染料法 ； 所述探针法所用探针为通用 探针， 其序列来自于 S-Oligo(dT) 引物上的 14 20 个碱基的通用探针序列。 10. 一种权利要求 4 或 7 所述的定量检测 miRNA 的方法的应用， 其特征在于， 将所述的 定量检测 miRNA 的方法应用在肿瘤等重大疾病的早期诊断和预后中。 权 利 要 求 书 CN 10215450。
10、5 A CN 102154506 A1/7 页 4 一种检测 miRNA 的方法及引物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医学领域， 特别涉及一种检测 miRNA 的方法及引物及其在肿瘤等 重大疾病早期诊断和预后中的应用。 背景技术 0002 microRNA(miRNA) 是一类长约 22 个核苷酸的非编码单链小分子 RNA， 广泛存在于 动物， 植物， 线虫等真核生物中。miRNA 通过与靶 mRNA3 非编码区 (3 UTR) 的特异性结合， 降解靶mRNA或阻遏其转录后翻译， 最终导致靶基因的蛋白质合成减少。 miRNAs参与了生命 活动各个层次的调节， 包括胚胎发育， 器官形。
11、成， 细胞增殖， 细胞凋亡， 细胞应激应答， 干细 胞分化， 内分泌调控， 免疫调节和疾病的发生与发展。大量的研究结果表明， 恶性肿瘤等重 大疾病的发生和发展与人体内 miRNAs 的异常表达有密切关系， 这就意味着 miRNAs 将有巨 大的潜力成为新的生物标志物用于癌症等重大疾病的早期诊断并可作为新的基因药物作 用靶点。显然， 要想把 miRNA 用于癌症等疾病的早期诊断， 需要一种能够快速、 灵敏、 特异地 定量检测 miRNAs 表达的方法。 0003 成熟 miRNA 由于片段小， 没有 poly(A) 尾巴， 不同 miRNA 之间序列差异小 ( 有些只 有 1 个核苷酸的差别 )。
12、， 并且在细胞中的表达水平普遍较低， 这些都给 miRNA 的定量检测工 作带来了困难和挑战。尽管如此， 科学家还是研究出了多种 miRNA 检测方法， 大体可以归为 两类 ： 一类是不需要样本扩增的探针直接杂交法 ； 另一类是基于 PCR 扩增的 miRNA 检测方 法。 0004 基于探针杂交技术的 miRNA 检测方法是一种直接检测法， 不需要对样本 RNA 进行 预扩增， 主要有如下几种 ： Northern blot技术、 生物芯片技术和基于微球的流式细胞术。 这 些技术的基本原理是将探针与RNA样品进行杂交， 然后进行信号检测。 Northern blot技术 作为检测 RNA 的。
13、经典方法， 常用来评价其它方法的可靠性 ； 但这种技术对样品要求量大， 操 作相对费时费力， 不适合高通量分析。生物芯片技术能实现 miRNA 的高通量分析， 即在一块 芯片上同时检测多个 miRNA ； 但缺点是结果准确性低， 重复性差， 实验价格昂贵。基于微球 的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中， 更有利于捕获 miRNA 序列， 因此提 高了准确性 ； 但该技术须使用特殊的流式细胞仪和微球， 实验成本高， 同样不利于推广。 0005 相比探针直接杂交法而言， 基于 real-time RT-PCR 技术检测 miRNA 的表达是当 前 miRNA 研究中最为常用的技术手段之一。
14、， 几乎所有依据高通量芯片技术筛选出差异表达 的 miRNA 都需要用 real-time RT-PCR 做进一步的鉴定。基于 real-time RT-PCR 的 miRNA 检测方法， 主要包括 poly(A) 聚合酶加尾法 (Shi R， Chiang V.Biotechnique.2005， 39(4) ： 519-525) 和 茎 环 引 物 (Stem loop) 法 (Chen C， Ridzon D.Nucleic Acids Res.2005， 33(20) ： 1-9) 两种。poly(A) 聚合酶加尾法是先用 poly(A) 聚合酶使 miRNA 的 3 端带上一 段 p。
15、oly(A) 尾巴， 然后用 5 端含有接头序列的 Oligo(dT) 引物进行反转录， 使第一链 cDNA 加上一段接头， 为随后的PCR扩增提供反向通用引物序列， 然后再利用一条miRNA序列特异 的正向引物就可实现 PCR 扩增。该方法的优点是简便、 快速， 反转录引物对 miRNA 具有通用 说 明 书 CN 102154505 A CN 102154506 A2/7 页 5 性， 因此检测成本较低 ； 但通用反转录引物的使用降低了检测的特异性和灵敏性。 茎环引物 法使用 3， 端有 6 个碱基与 miRNA 互补配对的引物来进行 miRNA 的反转录， 同时反转录引物 的 5 端含有。
16、一个茎环结构， 能增强 miRNA 和 DNA 异质双链的亲合力， 并防止引物与 pri- 或 pre-miRNA 退火， 因此一般来讲茎环引物法的特异性比 poly(A) 聚合酶加尾法要好 ； 但由于 该法使用的是序列特异探针， 对于高通量的 miRNA 分析来说过于昂贵。 0006 因此， 现有技术还有待于改进和发展。 发明内容 0007 鉴于上述现有技术的不足， 本发明的目的在于提供一种检测 miRNA 的方法及引物 及其应用， 旨在解决现有技术中所存在的问题。 0008 本发明的技术方案如下 ： 0009 一种用于定量检测miRNA的S-Oligo(dT)引物， 其中， 所述S-Oli。
17、go(dT)引物从5 端开始由 PCR 通用引物序列、 通用探针序列、 Oligo(dT) 及与目的 miRNA 分子的 3 端核苷 酸互补配对的特异性序列 4 部分组成。 0010 所述的用于定量检测 miRNA 的 S-Oligo(dT) 引物， 其中， 所述 S-Oligo(dT) 引物从 5 端开始依次是 14 20 个碱基的 PCR 通用引物序列， 14 20 个碱基的通用探针序列， 8 30 个 dT 及与目的 miRNA 分子的 3 端 3 8 个核苷酸互补配对的特异性序列。 0011 所述的用于定量检测 miRNA 的 S-Oligo(dT) 引物， 其中， 所述引物从 5 端。
18、开始依 次是 16 个碱基的 PCR 通用引物序列， 17 个碱基的通用探针序列， 11 个 dT 及与目的 miRNA 分子的 3 端 6 个核苷酸互补配对的特异性序列。 0012 一种使用上述的用于定量检测miRNA的引物定量检测特定miRNA的方法， 其中， 包 括以下步骤 ： 0013 S100、 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物的设计 ： 根据目的 miRNA 的序列 信息， 设计 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物 ； 0014 S200、 总RNA提取 ： 将细胞裂解， 提取总RNA， 并鉴定RNA纯度和完整性、 测定RNA的 浓。
19、度 ； 0015 S300、 RNA 加尾 ： 用 PolyA polymerase 对总 RNA 进行加尾， 得到 RNA-PolyA ； 0016 S400、 第一链 cDNA 的合成 ： 以 RNA-PolyA 为模板， 用 S-Oligo(dT) 引物进行 miRNA 的反转录 ； 0017 S500、 miRNA的real-time PCR定量检测 ： 以miRNA的第一链cDNA为模板， 用miRNA 特异上游引物和下游通用引物进行 real-time PCR 定量检测， 然后对 PCR 结果进行数据分 析。 0018 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其中， 所述 miRNA。
20、 特异上游引物是不含 3， 端 3 8 个碱基的miRNA特异序列， 所述miRNA的下游通用引物来自于S-Oligo(dT)引物的1420 个碱基的通用引物序列。 0019 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其中， 步骤 S500 中进行 real-time PCR 定量检 测采用的是探针法或 SYBR 荧光染料法 ； 所述探针法所用探针为通用探针， 其序列来自于 S-Oligo(dT) 引物上的 14 20 个碱基的通用探针序列。 0020 一种使用上述的用于定量检测miRNA的引物定量检测不同的miRNA的方法， 其中， 说 明 书 CN 102154505 A CN 1021545。
21、06 A3/7 页 6 包括以下步骤 ： 0021 S100、 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物的设计 ： 根据不同的目的 miRNA 的序列信息， 设计不同的 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物 ； 0022 S200、 总 RNA 提取 ： 将细胞裂解， 提取总 RNA， 并鉴定 RNA 纯度和完整性鉴定和测定 RNA 的浓度 ； 0023 S300、 RNA 加尾 ： 用 PolyA polymerase 对总 RNA 进行加尾， 得到 RNA-PolyA ； 0024 S400、 第一链cDNA的合成 ： 以RNA-PolyA为模板， 。
22、将不同的S-Oligo(dT)引物组合 起来进行 miRNA 的反转录 ； 0025 S500、 miRNA 的 real-time PCR 定量检测 ： 以 miRNA 的第一链 cDNA 为模板， 用各个 miRNA特异上游引物和下游通用引物进行real-time PCR定量检测， 然后对PCR结果进行数 据分析。 0026 所述的定量检测 miRNA 的方法， 其中， 所述 miRNA 特异上游引物是不含 3 端 3 8 个碱基的 miRNA 特异序列， 所述 miRNA 的下游通用引物来自于 S-Oligo(dT) 引物的 14 20 个碱基的通用引物序列。 0027 所述的定量检测 。
23、miRNA 的方法， 其中， 步骤 S500 中进行 real-time PCR 定量检 测采用的是探针法或 SYBR 荧光染料法 ； 所述探针法所用探针为通用探针， 其序列来自于 S-Oligo(dT) 引物上的 14 20 个碱基的通用探针序列。 0028 上述的定量检测miRNA的方法的应用， 其中， 将所述的定量检测miRNA的方法应用 在肿瘤等重大疾病的早期诊断和预后中。 0029 有益效果 ： 本方法的特点是灵敏性和特异性显著高于传统方法， 可高通量分析， 操 作简单、 快速， 成本低， 可广泛应用于肿瘤等重大疾病的早期诊断和预后。 附图说明 0030 图 1 为本发明用于 miR。
24、NA 定量检测的 S-Oligo(dT) 法示意图。 0031 图 2 为本发明 S-Oligo(dT) 法对女性宫颈癌 Hela 细胞 hsa-miR-21miRNA 的扩增 曲线图。 0032 图 3 为本发明 S-Oligo(dT) 法对女性宫颈癌 Hela 细胞 hsa-miR-21miRNA 的扩增 的标准曲线图。 0033 图 4 为本发明实施例中不同 real-time RT-PCR 法扩增 hsa-miR-21 的灵敏性比较 曲线图。 具体实施方式 0034 本发明提供一种检测 miRNA 的方法及引物及其应用， 为使本发明的目的、 技术方 案及效果更加清楚、 明确， 以下对本。
25、发明进一步详细说明。应当理解， 此处所描述的具体实 施例仅仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。 0035 本发明所提供的用于检测 miRNA 的 miRNA 反转录引物S-Oligo(dT) 引物， 从 5 端开始由 PCR 通用引物序列 (Universal primer)、 通用探针序列 (Universal probe)、 Oligo(dT) 及与目的 miRNA 分子的 3 端核苷酸互补配对的特异性序列 (specific bases)4 部分组成。 说 明 书 CN 102154505 A CN 102154506 A4/7 页 7 0036 所述用于定量检测 miRNA 的 S。
26、-Oligo(dT) 引物， 从 5 端开始依次是 14 20 个碱 基的 PCR 通用引物序列， 14 20 个碱基的通用探针序列， 8 30 个 dT 及与目的 miRNA 分 子的 3 端 3 8 个核苷酸互补配对的特异性序列。 0037 本发明还提供 miRNA 定量检测的一种新方法S-Oligo(dT) 法。S-Oligo(dT) 法运用 S-Oligo(dT) 引物进行特定 miRNA 的反转录， 或者将不同 S-Oligo(dT) 引物组合起 来对不同的 miRNA 样品同时进行反转录， 然后用各个 miRNA 的特异上游引物和通用下游引 物对相应的 miRNA 进行 real-。
27、timePCR 定量检测。miRNA 特异上游引物是不含 3 端 3 8 个碱基的 miRNA 特异序列， miRNA 的下游通用引物来自于 S-Oligo(dT) 引物的 14 20 个 碱基的通用引物序列。PCR 产物的检测既可用荧光染料法也可用探针法。探针法使用通用 探针， 其序列来自于 S-Oligo(dT) 引物上 14 20 个碱基的通用探针序列。 0038 本发明实施例中所提供的 S-Oligo(dT) 引物， 其组成为 ： 从引物 5 端开始依次是 16 个碱基的 PCR 通用引物序列， 17 个碱基的通用探针序列， 11 个 dT(Oligo(dT) 及与目的 miRNA 分。
28、子的 3 端 6 个核苷酸互补配对的特异性序列。miRNA 特异上游引物是不含 3 端 6 个碱基的 miRNA 特异序列， miRNA 的下游通用引物来自于 S-Oligo(dT) 引物的 16 个碱基 的通用引物序列。所使用的通用探针， 其序列来自于 S-Oligo(dT) 引物上 17 个碱基的通用 探针序列。 0039 本发明所提供的 miRNA 定量检测方法S-Oligo(dT) 法可以应用在肿瘤等重大 疾病的早期诊断和预测。 0040 本发明 miRNA 定量检测方法的具体步骤为 ： 0041 S100、 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物的设计 ： 根据目。
29、的 miRNA 的序列 信息， 设计 S-Oligo(dT) 引物和 miRNA 的特异上游引物 ； 0042 S200、 总RNA提取 ： 将细胞裂解， 提取总RNA， 并鉴定RNA纯度和完整性、 测定RNA的 浓度 ； 0043 S300、 RNA 加尾 ： 用 PolyA polymerase 对总 RNA 进行加尾， 得到 RNA-PolyA ； 0044 S400、 第一链 cDNA 的合成 ： 以 RNA-PolyA 为模板， 用 S-Oligo(dT) 引物进行 miRNA 的反转录 ； 0045 S500、 miRNA的real-time PCR定量检测 ： 以miRNA的第一。
30、链cDNA为模板， 用miRNA 特异上游引物和下游通用引物进行 real-time PCR 定量检测， 然后对 PCR 结果进行数据分 析。 0046 使用本发明的检测 miRNA 的方法， 具有以下几大优点 ： 0047 1.S-Oligo(dT) 法检测 miRNA 的特异性显著提高 ： 0048 S-Oligo(dT) 引物与靶 miRNA 互补的碱基数为 17 个碱基 (6 个特异碱基和 11 个 dT)， 在与靶miRNA锚定力度上明显优于poly(A)聚合酶加尾法(只有Oligo(dT)和茎环引 物法 ( 只有 6 个特异碱基 )。同时， 只有包含 “6 个特异碱基 -11 个 。
31、dT” 序列的 miRNA 才能 与S-Oligo(dT)引物互补配对， 因此S-Oligo(dT)法能很好地区分成熟miRNA与pri-miRNA 和 pre-miRNA。 0049 2.S-Oligo(dT) 法检测 miRNA 的灵敏性高 ： 0050 S-Oligo(dT) 法扩增 miRNA 的最低模板量为 1pg 总 RNA ； 扩增线性范围宽， 能覆盖 6 个数量级 (1pg-100ng 总 RNA)， 相关系数 R 值高于 0.99。S-Oligo(dT) 法与茎环引物法和 说 明 书 CN 102154505 A CN 102154506 A5/7 页 8 poly(A) 聚。
32、合酶加尾法相比灵敏性能提高 6-10 倍。 0051 3. 操作简单， 能进行高通量分析 ： 0052 S-Oligo(dT) 法在 cDNA 合成过程中， 能同时将不同 miRNA 的反转录引物混合后进 行多个 miRNA 的 cDNA 合成， 这样不仅能有效降低因加样所导致的误差， 而且有利于高通量 分析。 0053 4. 检测成本低 ： 0054 S-Oligo(dT) 法使用通用探针， 大大降低了检测成本， 因此更加适合推广。 0055 实施例 1 女性宫颈癌 Hela 细胞 hsa-miR-21miRNA 的定量检测 0056 ( 一 ) 材料 0057 1. 材料 ： 0058 体。
33、外培养的女性宫颈癌 Hela 细胞。 0059 2. 试剂 ： 0060 RNAiso plus(TaKaRa)， PolyA Polymerase(EPICENTRE)， PrimeScript RTreagent Kit(TaKaRa)， SYBR Premix Ex Taq(Peffect Real Time)(TaKaRa)， Premix Ex Taq(Perfect Real Time)(TaKaRa)。 0061 3. 引物和探针 ： 0062 0063 4. 仪器 ： 0064 GeneQuant pro RNA/DNA 定量分析仪， ABI PCR 仪 (2720)， ABI。
34、real-time PCR 仪 (PRISM 7300)。 0065 ( 二 ) 方法 0066 1.RNA 提取 0067 将体外培养的 Hela 细胞， 用 RNAiso plus 试剂进行 RNA 提取。提取的 Hela 细胞 总 RNA 用分光光度计测定 OD260/280 及 RNA 浓度， 用琼脂糖凝胶电泳分析 RNA 的完整性。 0068 2.RNA 加尾反应 0069 用 PolyA Polymerase 对总 RNA 进行加尾反应， 加样如下 ： 说 明 书 CN 102154505 A CN 102154506 A6/7 页 9 0070 0071 加完样后， 37保温 3。
35、0min， 冰上保存。 0072 3. 第一链 cDNA 的合成 0073 用 PrimeScript RT reagent Kit 对 miRNA 进行反转录反应， 加样如下 ： 0074 0075 加完样后， 65保温 5min， 迅速置于冰上， 静置 2min。加入如下试剂 ： 0076 0077 然后， 42保温 15min， 85保温 5min， 冰上放置 ； 再加入纯水 34l， 混匀。 0078 4.Hsa-miR-21miRNA 的 real-time PCR 定量检测 0079 用 Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) 进行 hsa-miR-2。
36、1miRNA 的 real-time PCR 定量检测， 加样如下 ： 0080 0081 * 通用探针可以选择 TaqMan UnivP-1， 2， 3 三种中任意一种， TaqManUnivP-1， 2 为 LNA 修饰的探针引物。本例选用 TaqMan UnivP-3。 0082 将 PCR 样品置于 ABI PRISM 7300PCR 仪， 按如下条件进行 real-timePCR ： 95预 变性 30 秒 ； 95变性 5 秒， 60延伸 31 秒 ； 40 个循环。 0083 本方案采用通用探针进行 PCR 产物的检测， 其序列来自 S-Oligo(dT) 引物上 17 个碱基的。
37、通用探针序列 ； 也可以使用 SYBR 荧光染料法对进行 PCR 产物的检测， 即用 SYBR 说 明 书 CN 102154505 A CN 102154506 A7/7 页 10 Green I 荧光染料代替通用探针 (TaqMan universal probe)。使用 SYBR Green I 荧光染 料时， 可进行熔解曲线分析， 以鉴定 PCR 产物的特异性。 0084 ( 三 ) 结果 0085 1.S-Oligo(dT) 法对 hsa-miR-21miRNA 进行定量检测 0086 从女性宫颈癌 Hela 细胞提取的总 RNA 经琼脂糖凝胶电泳鉴定表明完整性良好 ； OD260/。
38、280 1.9， 表明 RNA 纯度较高。于是用 S-Oligo(dT) 法对 hsa-miR-21miRNA 进行定量 检测， S-Oligo(dT)法示意图如图1所示。 结果表明， hsa-miR-21miRNA在模板为1pg-100ng 的总RNA范围内都得到了较好的扩增， 如图2所示 ； 标准曲线的线性关系良好， 如图3所示。 0087 2. 不同 real-time RT-PCR 方法的灵敏性比较 0088 本实施例还比较了不同 real-time RT-PCR 方法 ( 包括 S-Oligo(dT) 法、 poly(A) 聚合酶加尾法和茎环引物法 ) 扩增 hsa-miR-21 的。
39、灵敏性。以 2ng 总 RNA 为模板， 用上述三 种方法进行 real-time RT-PCR 检测， 结果见图 4， S-dT 曲线表示 S-Oligo(dT) 法的结果曲 线， PolyA 表示 poly(A) 聚合酶加尾法的结果曲线， SL 表示茎环引物法的结果曲线。从图 4 荧光强度与 Ct 值关系曲线看， S-Oligo(dT) 法的平均 Ct 值为 21.8， poly(A) 聚合酶加尾法 的平均 Ct 值为 24.2， 茎环引物法的平均 Ct 值为 26.1， 因此 S-Oligo(dT) 法的灵敏性明显 高于 poly(A) 聚合酶加尾法和茎环引物法。 0089 应当理解的是。
40、， 本发明的应用不限于上述的举例， 对本领域普通技术人员来说， 可 以根据上述说明加以改进或变换， 所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保 护范围。 说 明 书 CN 102154505 A CN 102154506 A1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102154505 A CN 102154506 A2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 102154505 A CN 102154506 A3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 102154505 A CN 102154506 A4/4 页 14 序 列 表 CN 102154505 A CN 102154506 A1/4 页 15 图 1 说 明 书 附 图 CN 102154505 A CN 102154506 A2/4 页 16 图 2 说 明 书 附 图 CN 102154505 A CN 102154506 A3/4 页 17 图 3 说 明 书 附 图 CN 102154505 A CN 102154506 A4/4 页 18 图 4 说 明 书 附 图 CN 102154505 A 。