含凝血酶的溶液中的Α凝血酶的稳定化方法.pdf

本发明提供一种凝血酶溶液中不稳定的α-凝血酶的稳定化方法、含有稳定化α-凝血酶的溶液和含有这种溶液的液状纤维蛋白原测定用试剂。含凝血酶溶液中的α-凝血酶的稳定化方法，其特征在于，α-凝血酶含量相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶至少为70％以上。

1、  一种含凝血酶溶液中的α-凝血酶的稳定化方法，其特征在于，α-凝血酶含量相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶至少为70％以上。

2、  根据权利要求1所述的稳定化方法，其中，β-和/或γ-凝血酶含量相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶小于30％。

3、  根据权利要求1或2所述的稳定化方法，其中，含凝血酶溶液的pH为4～9。

4、  一种含凝血酶溶液，其特征在于，相对于总凝血酶含有α-凝血酶70％以上。

5、  根据权利要求4所述的溶液，其中，β-和/或γ-凝血酶的含有比率相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶小于30％。

6、  根据权利要求4或5所述的溶液，其中，pH为4～9。

7、  一种液状纤维蛋白原测定用试剂，其中，含有权利要求4～6中任一项所述的含凝血酶溶液。

含凝血酶的溶液中的α-凝血酶的稳定化方法
技术领域
本发明涉及含凝血酶溶液中的不稳定的α-凝血酶的稳定化方法、含有稳定化α-凝血酶的含凝血酶溶液、以及含有该溶液的液状纤维蛋白原测定用试剂。
背景技术
纤维蛋白原是作为血凝块的主要蛋白质的纤维蛋白的前体物质，由肝实质细胞产生。生物体中的纤维蛋白原的约80％分布于血浆中(正常成年人中约为200～400mg/dL)，其余分布于组织中。纤维蛋白原是含有经二硫键结合的3对多肽(Aα，Bβ和γ)链的糖蛋白质，Aα，Bβ链通过凝血酶被分解而形成纤维蛋白，从而起到血栓生成、止血血栓的主要作用。在临床上，在炎症中增加，在高度的肝功能障碍、DIC等中减少。
作为纤维蛋白原的测定法，有Clauss法(凝血酶添加法)、PT演算法(凝固时间法)、TIA(免疫比浊法)、乳胶法等，一般采用凝血酶添加法，即在加入柠檬酸钠的血浆试样中添加凝血酶和氯化钙，测定凝固的时间，根据用已知浓度的纤维蛋白原制成的校正曲线，通过计算求出试样的纤维蛋白原浓度(mg/dL)的方法。
可以在纤维蛋白原测定时使用的凝血酶，从作为其前体的凝血酶原中切下肽而形成具有凝固活性的α-凝血酶。已知这种α-凝血酶会自分解成低分子量的不具有凝固活性的β-凝血酶，进而分解成γ-凝血酶，长期保存时，通常进行冷冻干燥。
因此，进行了在溶液中进行稳定化的一些尝试，例如，已知有在凝血酶中(1)添加高浓度甘油、多元醇(蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)的方法(专利文献1)；(2)添加糖、氨基酸等的方法(专利文献2)等。
但是，这些方法作为液状纤维蛋白原测定用试剂中的凝血酶的稳定化方法，效果并不充分。
作为纤维蛋白原测定用试剂中的凝血酶的稳定化方法，已知有在含凝血酶溶液中添加凝血酶拮抗抑制剂的方法(专利文献3)。
但是，该方法的机理在于抑制凝血酶的活性。因此，使用该方法时，对于纤维蛋白原测定检查中具有重要测定意义的纤维蛋白原低浓度试样，凝固时间极度延迟，因此有时无法进行测定。这一情况不仅会造成单位时间的试样处理数降低，而且还会导致因无法测定纤维蛋白原低浓度试样所致的再检测的增加，因此该方法不适于紧急检查。
因此，希望开发出含α-凝血酶溶液中的α-凝血酶的稳定化方法，该方法能够适用于即使在低浓度的纤维蛋白原试样中也不会无法进行测定、测定时间的极度延迟少、而且对低浓度试样的测定值的影响少的液状纤维蛋白原测定用试剂。
专利文献1：特开昭62-106028
专利文献2：特开昭64-040433
专利文献3：特开2004-191367
发明内容
本发明的目的在于提供一种含凝血酶溶液中不稳定的α-凝血酶的稳定化方法、含有稳定化α-凝血酶的含凝血酶溶液以及含有这种溶液的液状纤维蛋白原测定用试剂。
本发明人等反复进行了积极的研究，结果发现，尽管以往只认为β-凝血酶、γ-凝血酶仅仅是α-凝血酶的自分解产物，但β-和γ-凝血酶作用于α-凝血酶的分解活性却比α-凝血酶作用于α-凝血酶的自分解的活性要强。而且还发现，通过将β-和/或γ-凝血酶相对于总凝血酶的含量抑制到较低的一定范围内，出乎意料的是，能够实现以往认为由于发生自分解而不稳定的α-凝血酶溶液中的稳定化，从而完成了本发明。
也就是说，本发明提供一种含凝血酶溶液中的α-凝血酶的稳定化方法，其特征在于，α-凝血酶含量相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶至少为70％以上。
根据本发明，可以抑制含凝血酶溶液中α-凝血酶残留率的降低、活性的降低，提高含凝血酶溶液的保存稳定性、品质。而且，还可以提高适于紧急检查的液状纤维蛋白原测定用试剂的保存稳定性、品质。
附图说明
图1：纯化凝血酶的10-20％SDS-PAGE图像。图的左侧为纯化α-凝血酶的图像，图的右侧为纯化β-和γ-凝血酶的混合物的图像。而且，A相当于α-凝血酶，B相当于β-和γ-凝血酶。
图2：37℃加速试验后的α-凝血酶含量残留率。以第0周的凝固时间作为100％。
图3：37℃加速试验后的凝血酶活性。以第0周的凝固时间作为100％。
图4：37℃加速试验后的试样1的凝固时间延迟。以第0周的凝固时间作为100％。
图5：37℃加速试验后的试样2的凝固时间延迟。以第0周的凝固时间作为100％。
具体实施方式
本发明中，α-凝血酶含量相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶为70％，优选80％以上，更优选90％以上。此外，更优选相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶，α-凝血酶含量在70％以上且β-和/或γ-凝血酶含量小于30％，进一步优选α-凝血酶含量在80％以上且β-和/或γ-凝血酶含量小于20％，特别优选α-凝血酶含量在90％以上且β-和/或γ-凝血酶含量小于10％。
如后述实施例所示，由于随着β-和γ-凝血酶相对于总凝血酶的含量提高，β-和γ-凝血酶使溶液中的α-凝血酶的残留率降低、活性降低，因此本发明通过提高α-凝血酶相对于总凝血酶的含量、另一方面抑制β-和γ-凝血酶相对于总凝血酶的含量，从而可以提高溶液中的α-凝血酶保存稳定性、品质。
本发明中的所谓凝血酶，是指含有α-凝血酶的凝血酶，所谓总凝血酶，是指所有α-凝血酶、β-凝血酶和γ-凝血酶。
本发明中α-凝血酶相对于总凝血酶的含量，可以采用能够定量测定凝血酶的公知方法求出α-凝血酶，β-凝血酶和γ-凝血酶的各测定值，用下式(1)求出。
α-凝血酶相对于总凝血酶的含量(％)＝(α-凝血酶测定值/总凝血酶测定值的总和)×100…式(1)
而且，同样地，可以用下式(2)求出β-和/或γ-凝血酶相对于总凝血酶的含量。
β-和/或γ-凝血酶相对于总凝血酶的含量(％)＝(β和/或γ-凝血酶测定值/总凝血酶测定值的总和)×100…式(2)
作为定量测定凝血酶的方法，可以例举例如通过活性测定法、光密度分析法进行的蛋白定量等，可以是任意的测定方法。而且，还可以适当地在测定前用公知的方法分离并纯化α-凝血酶及其分解物。
更具体来说，在通过使用合成底物S-2238(第一化学药品制)的活性测定法(合成底物法)求出α-凝血酶含量时，可以用公知的离子交换树脂分离α-，β-和γ-凝血酶后，分别测定各成分对S-2238的分解活性，求出α-凝血酶活性相对于总凝血酶活性的活性比率(％)。
此外，使用光密度分析法时，可以通过公知的蛋白质分析用电泳分离成α-，β-和γ-凝血酶这三种成分，通过光密度分析法求出各蛋白质含量后，求出α-凝血酶的蛋白质含量相对于总凝血酶的蛋白质含量的比率(％)。
在本发明中使用的凝血酶可以是人等动物来源的凝血酶、通过基因工程法制备的凝血酶、或市售的药品。
作为本发明中使用的凝血酶的制备方法，可以例举公知的蛋白质的分离和纯化法，例如过滤、清洗、干燥、重结晶、各种柱色谱、HPLC、液液分配等。更具体来说，可以例举阳离子交换树脂等离子交换树脂、苄脒树脂等亲合树脂、超滤膜、凝胶过滤等。
此外，通过将这些方法适当组合以调整提高α-凝血酶相对于总凝血酶的含量。
本发明的含凝血酶溶液是使凝血酶悬浮或溶解于水和/或有机溶剂中而成的水溶液、有机溶剂溶液或者水和有机溶剂的混合溶液，优选为水溶液或者水和有机溶剂混合溶液。作为该有机溶剂，只要不会造成α-凝血酶的分解和活性抑制等、且对纤维蛋白原测定没有影响，就没有特别限定，例如，可以例举例如二甲基亚砜、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇等。还可以将这些物质中的一种或两种以上组合使用。
本发明的含凝血酶溶液的pH可以不做特别调整，但为了抑制α-凝血酶的分解和活性抑制，优选在4～9，更优选5.5～7，进一步优选6～6.5。
为了将该pH调整到4～9，可以适当选择在pH4～9的范围具有缓冲能力的缓冲剂进行使用。例如可以将选自于柠檬酸、磷酸、乙酸、咪唑、HEPES、MOPS、BIS-TRIS、TRIS、MOPSO、ADA、MES等中的一种或两种以上适当组合。
而且，在将该pH调整到5.5～7时、调整到6～6.5时，例如可以将选自于柠檬酸、磷酸、咪唑、BIS-TRIS、MOPSO、ADA、MES等中的一种或两种以上适当组合。
这些缓冲剂的添加量只要是具有缓冲能力的量就没有特别限定，但优选例如含凝血酶溶液中的缓冲剂的浓度在5～1000mM，特别是20～300mM。
而且，本发明的含凝血酶溶液中的α-凝血酶活性量可以根据α-凝血酶相对于上述总凝血酶的含量，调整到目标活性值，并没有特别限制。例如，在纤维蛋白原测定用试剂中使用时，α-凝血酶活性以公知的合成底物法计为20～1000单位/mL，更优选为50～500单位/mL，特别优选为100～300单位/mL。
本发明的含凝血酶溶液可以在对纤维蛋白原测定没有影响的范围内适当配合如下的公知化合物，用公知的制备方法制造。
在该含凝血酶溶液中，可以在对纤维蛋白原测定没有影响的范围内适当配合用于稳定α-凝血酶、提高保存稳定性等的公知化合物，例如，可以例举钙离子、有机酸、表面活性剂、蛋白质等。
作为前述钙离子的具体例子，优选水溶性的钙化合物，可以例举例如氯化钙、乳酸钙、葡糖酸钙、葡糖醛酸钙、酒石酸钙等。这些钙化合物还可以使用一种或组合使用2种以上。该钙化合物对于α-凝血酶的稳定化有效量只要是使稳定性提高的量即可，没有特别限定，例如含凝血酶溶液中的钙浓度优选在5mM～100mM，更优选在10mM～50mM。
作为前述有机酸的具体例子，可以例举甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、葡糖酸、乳酸、葡糖醛酸、乙醇酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、戊二酸、氨基乙酸、氨基己酸等，可以使用游离酸或其盐中的任一者。而且，这些有机酸可以使用一种或组合使用两种以上。
该有机酸的添加量只要是使含α-凝血酶溶液的稳定性提高的量即可，没有特别限定，例如含凝血酶溶液中的该有机酸的浓度优选在10mM～500mM，更优选在50mM～200mM。
作为前述表面活性剂，可以是阴离子性表面活性剂、阳离子性表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子性表面活性剂中的任一种，作为其具体例子，可例举如下的表面活性剂。
作为阴离子表面活性剂，可以例举例如十二烷基硫酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基-N-肌氨酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠等。
作为阳离子表面活性剂，可以例举例如十六烷基三甲基溴化铵、四癸基溴化铵、十二烷基吡啶鎓氯化物等。
作为两性离子表面活性剂，可以例举例如3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐(CHAPS，3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propanesulfonate)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)、棕榈酰溶血卵磷脂、十二烷基-N-甜菜碱、十二烷基-β-丙氨酸等。
作为非离子性表面活性剂，可以例举例如辛基葡糖苷、庚基硫代葡糖苷、癸酰基-N-甲基葡糖胺、聚氧乙烯十二烷基醚、聚氧乙烯七甲基己基醚、聚氧乙烯异辛基苯基醚(Triton(注册商标)X系列)、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、聚环氧乙烷山梨糖醇酯(Tween(注册商标)系列)等。
这些表面活性剂中，特别优选使用的是非离子性表面活性剂。而且，这些表面活性剂可以使用1种或组合使用2种以上。
该表面活性剂的添加量只要是使含α-凝血酶溶液的稳定性提高的量即可，没有特别限定，例如含α-凝血酶溶液中的该表面活性剂的浓度优选在0.001～1w/v％，更优选0.005～0.1w/v％。
作为前述蛋白质的具体例子，可以例举白蛋白、明胶、球蛋白等，这些蛋白质可以使用1种或组合使用2种以上。
该蛋白质的添加量只要是使含α-凝血酶溶液的稳定性提高的量即可，没有特别限定，例如含α-凝血酶溶液中的该蛋白质的浓度优选在0.05～10w/v％，更优选0.1～5w/v％。
而且，本发明的含α-凝血酶溶液中，除上述之外，为了提高测定再现性，还可以在对纤维蛋白原测定没有影响的范围内配合高分子多糖类和/或合成高分子类。
作为该高分子多糖类的具体例子，可以例举葡聚糖40、葡聚糖70、葡聚糖200,000、葡聚糖500,000、菲可(Ficoll)等。这些高分子多糖类可以使用1种或组合使用2种以上。
该高分子多糖类的添加量只要是使再现性提高的量就没有特别限定，例如含凝血酶溶液中的高分子多糖类的浓度优选在0.1-10w/v％，更优选0.3-3w/v％。
作为所述合成高分子类的具体例子，可以例举聚乙烯醇500、聚乙烯醇1500、聚乙烯醇2000、聚乙二醇1500、聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇20000和聚乙烯吡咯烷酮等。这些合成高分子类可以使用1种或组合使用2种以上。
该合成高分子类的添加量只要是使再现性提高的量就没有特别限定，例如含凝血酶溶液中的合成高分子类的浓度优选在0.1～10w/v％，更优选0.3～3w/v％。
而且，在本发明的含凝血酶溶液中，还可以在对纤维蛋白原测定没有影响的范围内添加适当的防腐剂。作为该防腐剂，可以例举例如叠氮化钠、Proclin(注册商标)300、环丙沙星、丙酸或苯甲酸钠等，还可以从这些中使用1种或将2种以上组合使用。而且，根据需要，也可含有氯化钠等盐、氨基酸、糖等一般的稳定化剂等。
所述防腐剂的添加量只要在规定范围内就没有特别限定，例如，含血凝酶溶液中的Proclin(注册商标)300的浓度在0.001～1w/v％，优选为0.01～0.1w/v％。而且，上述记载的浓度记载了将市售的Proclin(注册商标)300制成100w/v％时的浓度。
本发明的液状纤维蛋白原测定用试剂含有上述含α-凝血酶溶液，而且还可以在不影响纤维蛋白原测定的范围内适当配合用于测定纤维蛋白原而通常使用的化合物。
所述液状纤维蛋白原测定用试剂可以作为凝固能力检查试剂、尤其是纤维蛋白原的定量用试剂使用。具体而言，用试样稀释用缓冲液将纤维蛋白原标准液稀释到规定浓度后，添加稀释纤维蛋白原标准液和液状纤维蛋白原测定用试剂，于37℃测定凝固时间。基于该纤维蛋白原浓度和凝固时间的测定值制成校正曲线，根据该校正曲线换算被检试样的凝固时间的测定值，可以求出被检试样中的纤维蛋白原浓度。
此外，本发明的含有含α-凝血酶溶液的液状纤维蛋白原测定用试剂可以测定凝血酶活性抑制物质的活性，例如，抗凝血酶活性、水蛭素活性、化学合成抑制剂的活性。
而且，本发明的液状纤维蛋白原测定用试剂可以制成测定用试剂盒，这种情况下还可以含有用于稀释试样和标准液的试样稀释用缓冲液。
作为试样稀释用缓冲液，可以例举MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、CAPS等Good′s缓冲液、巴比妥缓冲液。该试样稀释用缓冲液可以按在加入上述含凝血酶溶液中时达到上述含凝血酶溶液的pH、浓度范围的方式来使用。
实施例
例举以下实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限于这些实施例。
(制造例1)α-凝血酶和β·γ-凝血酶的分离、纯化
使以50mM磷酸缓冲液pH7.0溶解的5万单位的凝血酶溶液吸附于S-琼脂糖凝胶(2.5×11cm，Pharmacia)，用同样的缓冲液清洗后，通过采用含有0.4M NaCl的相同缓冲液的0～0.4M NaCl(各300mL)线性梯度进行洗脱。用合成底物法测定凝血酶活性，回收在低离子强度下洗脱的β-和γ-凝血酶混合物(以下称为β·γ-凝血酶)部分和在高离子强度下洗脱的α-凝血酶部分。
进而，使各部分的凝血酶溶液吸附于苄脒-琼脂糖凝胶(2.1×6cm，Pharmacia)，用含有0.5M NaCl的相同缓冲液清洗后，通过采用含0.1M苄脒、0.5M NaCl的相同缓冲液的0-0.1M苄脒(各100mL)线性梯度进行洗脱，得到纯化的α-凝血酶(约3万单位)和纯化的β·γ-凝血酶(约1万单位)。而且，对于回收的各纯化凝血酶溶液，用0.1M NaCl、20mMTris-HCl pH7.4进行透析后，在后述的研究中使用。而且，通过合成底物法进行的凝血酶活性测定，加入用试剂1(100mM Tris，50mM柠檬酸三钠，0.05％BSA，pH7.4)稀释500倍而成的的各含凝血酶溶液200μL和试剂2(S-2283：1mg/mL)200μL，于37℃反应10分钟后，添加1mL的2％柠檬酸，在405nm的波长下进行测定。而且，根据合成底物法测定值向凝血酶活性的换算基于凝血酶标准品(日本药典)进行，纯化α-凝血酶为1238单位/mL，纯化β·γ-凝血酶为677单位/mL。
(制造例2)各凝血酶的纯度测定(光密度分析法)
用Laemmli法通过非还原下的10-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将纯化α-凝血酶和纯化β·γ-凝血酶分离。通过CBB进行蛋白染色后，充分脱色后，通过光密度分析法(柯达IS440CF)测定各条带的染色度程度(强度，Intensity)。
其结果是，如表1、图1所示，纯化α-凝血酶的纯度为约95％(约5％含β-和γ-凝血酶)，纯化β·γ-凝血酶的纯度为约80％(约20％含α-凝血酶)。而且，A相当于α-凝血酶，B相当于β-和γ-凝血酶。
表1

(实施例1)条件1～5的含凝血酶溶液的制备
条件1～5的含凝血酶溶液是由100单位/mLα-凝血酶、150mM氯化钠、0.05％Proclin(注册商标)300、以下述活性比率含有β·γ-凝血酶的50mM MES缓冲液构成的pH6.3的溶液，使用纯化α-凝血酶和纯化β·γ-凝血酶进行制备。
条件1：β·γ-凝血酶相对于总凝血酶活性的活性比率：5％
条件2：β·γ-凝血酶相对于总凝血酶活性的活性比率：10％
条件3：β·γ-凝血酶相对于总凝血酶活性的活性比率：15％
条件4：β·γ-凝血酶相对于总凝血酶活性的活性比率：20％
条件5：β·γ-凝血酶相对于总凝血酶活性的活性比率：50％
(实施例2)α-凝血酶含量的稳定性
测定了条件1～5的含凝血酶溶液于37℃保存0、1、2周时的α-凝血酶含量的残留率。而且，α-凝血酶含量的测定用制造例2的纯度测定进行。
其结果是，如表2和图2所示，37℃加速试验后的α-凝血酶含量残留率随β·γ-凝血酶活性比率增加而降低。对于β·γ-凝血酶活性比率为50％(条件5)的含凝血酶溶液，于37℃保存2周时α-凝血酶含量残留率为50％，与之相对，条件4的β·γ-凝血酶活性比率为20％的含凝血酶溶液，于37℃保存2周时获得了α-凝血酶含量残留率为81％的良好结果，共存的β·γ-凝血酶少者(即α-凝血酶的活性比率高者)，α-凝血酶的残留率高。
[表2]
加速试验后的α-凝血酶含量残留率

这里，根据图2，由β·γ-凝血酶相对于总凝血酶的活性比率与α-凝血酶的含量残留率成反比可以预想，β·γ-凝血酶的活性比率为30％(即，α-凝血酶相对于总凝血酶活性的活性比率为70％)时，37℃保存2周后的α-凝血酶含量的残留率在70％以上。而且，根据该结果可知，相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶，α-凝血酶含量为70％以上，优选在80％以上，更优选在90％以上。而且，还可知，更优选相对于含凝血酶溶液中的总凝血酶，α-凝血酶含量在70％以上且β-和/或γ-凝血酶含量小于30％，进一步优选α-凝血酶含量在80％以上且β-和/或γ-凝血酶含量小于20％，特别优选α-凝血酶含量在90％以上且β-和/或γ-凝血酶含量小于10％。
(实施例3)凝血酶活性的稳定性
与实施例1同样地制备条件1～5的各含凝血酶溶液，根据在37℃保存0、1、2周时通过合成底物法获得的测定值求出凝血酶活性的残留率。
通过合成底物法进行的活性测定采用记载于前述制造例1中的方法。
其结果是，如表3和图3所示，对于条件5的β·γ-凝血酶活性比率为50％的含凝血酶溶液，于37℃保存2周后的凝血酶活性残留率为20％以下，与之相对，对于条件4的β·γ-凝血酶活性比率为20％的含凝血酶溶液，于37℃保存2周后的凝血酶活性残留率良好，为约60％，初期的β·γ-凝血酶活性比率越小(即α-凝血酶的活性比率越高)，于37℃保存2周后的凝血酶活性残留率增大。
[表3]
37℃加速试验后的凝血酶活性残留率

(实施例4)各含α-凝血酶溶液的凝固活性的稳定性
对于实施例2中制备的条件1～5的含α-凝血酶溶液，使用于37℃保存了0、1、2周的含凝血酶溶液，对人血浆(试样1和试样2)进行凝固时间的测定。本实验在用试样稀释液(TC缓冲液，Sysmex)稀释为10倍的血浆100μL中添加50μL各含凝血酶溶液，用COAGREX800(Sysmex)测定凝固时间。
与试样1相关的结果示于表4和图4中，与试样2相关的结果示于表5和图5中，在图4和5中，按以第0周的凝固时间作为100％时的相对％来表示。
[表4]
试样1：37℃加速试验后的试样1的凝固时间(秒)
(试样1：290mg/dL)

[表5]
试样2：37℃加速试验后的试样2的凝固时间(秒)
(试样2：145mg/dL)

根据图4和图5，对于β·γ-凝血酶活性比率为50％(条件5)的含凝血酶溶液，于37℃保存2周后的凝固时间相对于初期凝固时间的相对％超过120％，与之相对，对于β·γ-凝血酶活性比率在20％以下(条件1-4)的含凝血酶溶液，小于110％。根据上述内容，确认了本发明的含凝血酶溶液在溶液中稳定，作为液状的纤维蛋白原测定用试剂有用。