冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方法.pdf

本发明公开了一种冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方法，培养基凝固剂该主要由以下重量份的原料制备而成：黄原胶、瓜尔豆胶的质量比为1∶0.5-1.5混合；聚丙烯酸钠和刺槐豆胶质量比，1∶7-10，混合；上述比例的黄原胶和瓜尔豆胶的混合物与聚丙烯酸钠和刺槐豆胶的混合物质量比为7-9∶1。本发明冷水可凝的培养基凝固剂能在冷水中溶解和凝固，吸水性能良好、反应时间短、凝胶强度和粘度高、适合大部分微生物的生长，能形成凝胶。该凝胶可作为微生物培养基的凝固剂，避免目前使用琼脂培养基需要加热、冷却需时、琼脂平板容易失水干裂的缺点。

1.  一种冷水可凝的培养基凝固剂，其特征是，主要由以下重量份的原料制备而成：
黄原胶、瓜尔豆胶的质量比为1∶0.5-1.5；
聚丙烯酸钠和刺槐豆胶质量比，1∶7-10；
上述比例的黄原胶和瓜尔豆胶的混合物与聚丙烯酸钠和刺槐豆胶的混合物质量比为7-9∶1。

2.  根据权利要求1所述的冷水可凝的培养基凝固剂，其特征是，所述黄原胶、瓜尔豆胶的质量比为1∶1。

3.  根据权利要求1所述的冷水可凝的培养基凝固剂，其特征是，所述聚丙烯酸钠和刺槐豆胶质量比为1∶8。

4.  根据权利要求1所述的冷水可凝的培养基凝固剂，其特征是，黄原胶和瓜尔豆胶的混合物与聚丙烯酸钠和刺槐豆胶的混合物质量比为8∶1。

5.  一种制备冷水可凝的凝固剂的方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)分别粉碎黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶，过筛；
(2)将粉碎过筛后的黄原胶和瓜尔豆胶以1∶0.5-1.5的质量比混合均匀；
(3)将粉碎过筛后的聚丙烯酸钠和刺槐豆胶以1∶7-10的质量比混合均匀；
(4)把步骤(2)的混合物和步骤(3)的混合物按7-9∶1的质量比例混合均匀，即得所述冷水可凝的凝固剂。

6.  根据权利要求5所述的冷水可凝的培养基凝固剂的制备方法，其特征是，所述黄原胶、瓜尔豆胶的质量比为1∶1。

7.  根据权利要求5所述的冷水可凝的培养基凝固剂的制备方法，其特征是，所述聚丙烯酸钠和刺槐豆胶质量比为1∶8。

8.  根据权利要求5所述的冷水可凝的培养基凝固剂的制备方法，其特征是，步骤(2)的混合物和步骤(3)的混合物按8∶1的质量比例混合。

冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种用于微生物生长培养的冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方法，属于高分子材料领域。
背景技术
自德国细菌学家柯霍首次用明胶作为固体培养基凝固剂进行细菌划线开始，凝固剂在细菌培养、分离、鉴定中担当重要的作用。随后各亲水性凝固剂相继被发现，溶于水后膨胀形成粘稠溶液或凝胶，并用于微生物培养基。目前琼脂是应用最广泛的凝固剂，但其仍存在问题：1)过分开采导致价格昂贵、2)凝胶水分容易挥发、3)凝结水积聚在培养皿壁容易造成菌落间污染、4)冰冻易产生结晶或裂开，不利于菌种传代和长期保藏。另外，因为琼脂不能在冷水凝固，在制备微生物培养基时，需要先加热、冷却后才能倒平板使用，大大影响了检测效率。
应用冷水可凝凝固剂剂作为培养基的载体，在微生物快速测试片或测试平板工具中使用，不需要预加热处理，能缩短检测的时间，直接滴加样品液几分钟就能凝固，之后能像使用琼脂一样进行培养、计数和转接菌落等操作；而且携带方便，适合户外操作。微生物快速测试片和测试平板以冷水可凝凝固剂、以滤纸或无纺布代替需要加热才能溶解的琼脂为载体，固定选择性培养基和检测目标微生物特异性酶的显色底物，当样品中存在目标微生物时，其特异性酶能使其菌落产生颜色并计数。其中载体的性能影响着快速测试片和测试平板的检测效果，滤纸和无纺布为载体，材料便宜，但滤孔较大，且不透明，容易双面有菌落生长而无法准确计数，也不能双面数菌和挑菌作进一步实验；而以冷水可凝凝固剂为载体能形成透明胶体，并能作挑菌鉴定。因此，研发一种无毒、透明、稳定、不易被分解、胶强度和保水性好、性质优良的的冷水可凝凝固剂用于微生物分离培养上，对快速测试片的开发和利用具有重要意义。
发明内容
为了解决琼脂使用前需要加热、熔化和冷水不溶的问题，本发明的目的之一是提供一种冷水可以凝固的培养基凝固剂，该冷水可凝的培养基凝固剂凝胶强度高、吸水性能和保水性能优良，应用于微生物检测产品上，如微生物快速测试片和测试平板，可获得节省时间，操作方便的快速检测效果。
本发明采用的技术方案如下：
一种冷水可凝的培养基凝固剂，主要由以下重量份的原料制备而成：
黄原胶、瓜尔豆胶的质量比为1∶0.5-1.5；
聚丙烯酸钠和刺槐豆胶质量比，1∶7-10；
上述黄原胶和瓜尔豆胶的混合物与聚丙烯酸钠和刺槐豆胶的混合物质量比为7-9∶1。
优选地，所述黄原胶、瓜尔豆胶的质量比为1∶1；
所述聚丙烯酸钠和刺槐豆胶质量比为1∶8；
黄原胶和瓜尔豆胶的混合物与聚丙烯酸钠和刺槐豆胶的混合物质量比为8∶1
本发明的另一目的是提供上述冷水可凝的培养基凝固剂的制备方法。
具体技术方案如下：
一种制备冷水可凝的凝固剂的方法，包括以下步骤：
(1)分别粉碎黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶，过筛；
(2)将粉碎过筛后的黄原胶和瓜尔豆胶以1∶0.5-1.5的质量比混合均匀；
(3)将粉碎过筛后的聚丙烯酸钠和刺槐豆胶以1∶7-10的质量比混合均匀；
(4)把步骤(2)混合物和(3)的混合物按7-9∶1的质量比例混合均匀。
本发明以黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶为原料，用筛过滤使粉末颗粒大小均匀，按一定比例、浓度和温度下共混，能得出良好的凝固胶体。
本发明所述的冷水可凝的培养基凝固剂可以直接使用一定量粉末形成凝胶或加热处理成膜后形成凝胶。
本发明所述的冷水可凝的培养基凝固剂无毒、透明、稳定、不易被分解、胶强度和保水性好、pH值为7±0.2，属中性；吸水量为40～130g/g，凝固剂强度为200～400g/cm²，适用于微生物分离培养上。
具体实施方式
本发明所述的培养基凝固剂的直接法是使用粉末于微生物快速测试片工具的上层；或加热法是制成凝胶膜后用于微生物快速测试平板工具中，作为培养基凝固剂载体。
直接法：取0.06g～0.1g粉末，60℃～80℃干燥4h～8h室温冷却后使用，1ml～2ml冷水即可使凝固(胶体总浓度为6％～10％)。
加热法：取0.02g～0.05g粉末，加入10ml去离子水，加热到100℃～130℃后，10min～20min，60℃～80℃干燥4h～8h放至室温使用，1ml～2.5ml冷水即可使凝固(胶体总浓度为0.5％～2％)。
现有的微生物快速测试片包括底板、中间镂空的胶片和塑料膜，胶片中间镂空部分有显色培养基；塑料膜的底面粘合有冷水可凝的凝胶剂。
现有的微生物快速测试平板为玻璃或塑料的培养皿，包括上盖和盛载冷水可凝凝固剂的下层组成。
实施例1：
本实施例所述的冷水可凝的培养基凝固剂，由以下的黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶配比制备而成，其制备方法步骤如下：
(1)分别粉碎黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶，过160目筛；
(2)把过筛后的黄原胶和瓜尔豆胶以1∶1.5的质量比混合均匀；
(3)把过筛后的聚丙烯酸钠和刺槐豆胶以1∶9的质量比混合均匀；
(4)把步骤(2)混合物和(3)的混合物按8∶1的质量比例混合均匀，即得到冷水可凝的培养基凝固剂；
(5)取0.5g粉末，加入100ml去离子水，于三角烧瓶中110℃10min灭菌；
(6)吸取10ml，滴加于直径7cm平板，70℃干燥5h，制成快速测试平板，备用；
(7)凝固剂吸水量为82g/g，pH值为7，强度为340.3g/cm²。
实施例2：
本实施例述的冷水可凝的培养基凝固剂，由以下的黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶配比制备而成，其制备方法步骤如下：
(1)分别粉碎黄原胶和瓜尔豆胶，过160目筛；
(2)把过筛后的黄原胶和瓜尔豆胶以1∶1的质量比混合均匀；
(3)把过筛后的聚丙烯酸钠和刺槐豆胶以1∶8的质量比混合均匀；
(4)把步骤(2)混合物和(3)混合物按9∶1的质量比例混合均匀，即得到冷水可凝的培养基凝固剂；
(5)70℃6h干燥后，取0.2g黏于快速测试片上层的塑料膜；
(6)把粘有显色培养基的下层胶片、底板和粘有凝固剂的塑料膜组装，制成快速测试片，备用。
(7)凝固剂吸水量为44g/g，pH值为7，强度为195.4g/cm²。
实施例3：
本实施例所述的冷水可凝的培养基凝固剂，由以下的黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶配比制备而成，其制备方法步骤如下：
(1)分别粉碎黄原胶、瓜尔豆胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆胶，过160目筛；
(2)把过筛后的黄原胶和瓜尔豆胶以1∶1.2的质量比混合均匀；
(3)把过筛后的聚丙烯酸钠和刺槐豆胶以1∶8的质量比混合均匀；
(4)把步骤(2)混合物和(3)混合物按8∶1的质量比例混合均匀，即得到冷水可凝的培养基凝固剂；
(5)取0.8g粉末，加入100ml去离子水，于三角烧瓶中110℃10min灭菌；
(6)吸取10ml，滴加于直径7cm平板，70℃干燥5h，制成快速测试平板，备用；
(7)凝固剂吸水量为85g/g，pH值为7，强度为350.3g/cm²。
实施例4：
将凝固剂应用于快速测试平板，对大肠杆菌进行检测计数：
1)按实施例1的凝固剂制备方法应用于快速测试平板；
2)把大肠菌群显色培养基粉末4.0g(没有琼脂)，加无菌水35ml配成培养液，110℃10min灭菌，备用。
2)制备菌液：挑取大肠杆菌(Escherichia coli 8099)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC26922)菌苔分别接种到5ml营养肉汤中，37℃培养18～24h后，各取1mL菌液用生理盐水10倍梯度稀释至10¹cfu/ml，每株菌设置2个平行，重复3次，备用。
3)翻开测试平板上盖，滴加步骤2)菌液1ml于平板中央，并加入步骤1)培养液1.5ml，盖上上盖，摇晃使样液均匀分散于测试平板，静置1-2min，待凝胶固化后，37℃培养24h，计数；另以1ml菌液倾注大肠菌群显色琼脂平板，37℃培养24h，作为对照并进行操作计数。
4)计数绿色的菌落为阳性菌落，进行计数和均值t检验。结果表明，两种培养方法的检测结果无显著差异(t＝-2.185P＝0.051＞0.05)。
2种方法测定2株大肠杆菌菌落数(x±S，n＝6)


实施例5：
将凝固剂应用于快速测试平板，对沙门氏菌进行检测计数：
1)按实施例3的凝固剂制备方法应用于快速测试平板；
2)把沙门氏菌显色培养基粉末4.5g(没有琼脂)，加无菌水35ml配成培养液，煮沸灭菌，备用。
2)制备菌液：挑取沙门氏菌(Salmonella typhi)CMCC 50115、沙门氏菌(Salmonellatyphi)CMCC 50335、沙门氏菌(Salmonella typhi)CMCC 50071、沙门氏菌(Salmonellatyphi)CMCC 50023、沙门氏菌(Salmonella typhi)CMCC 50004菌苔分别接种到5ml营养肉汤中，37℃培养18～24h后，各取1mL菌液用生理盐水10倍梯度稀释至10¹cfu/ml，每株菌设置2个平行，重复3次，备用。
3)翻开测试平板上盖，滴加步骤2)菌液1ml于平板中央，并加入步骤1)培养液1.5ml，盖上上盖，摇晃使样液均匀分散于测试平板，，静置1-2min，待凝胶固化后，37℃培养24h，计数；另以1ml菌液倾注沙门氏菌显色琼脂平板，37℃培养24h，作为对照并进行操作计数。
4)计数紫色的菌落为阳性菌落，进行计数和均值t检验。结果表明，两种培养方法的检测结果无显著差异(t＝2.056P＝0.059＞0.05)。
2种方法测定5株沙门氏菌菌落数(x±S，n＝6)

实施例6：
将凝固剂应用于快速测试片，对各试验菌株进行菌落总数计数：
1)按实施例2的凝固剂制备方法应用于快速测试片，加上营养肉汤粉末和TTC显色剂，制成菌落总数测试片，备用。
2)制备菌液：挑取大肠杆菌(Escherichia coli 8099)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC 63501、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)CMCC 50115、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 9027菌苔分别接种到5ml营养肉汤中，37℃培养18～24h后，各取1ml用生理盐水10倍梯度稀释至试验菌菌液浓度为10²cfu/ml，重复2次，备用。
3)翻开测试片上层塑料膜，滴加步骤2)菌液1ml于下层镂空凹槽培养区位置，盖上塑料膜，观察样液是否已均匀分散于测试片中央，如未能均匀分散，可用手轻轻把样液推平，静置1-2min，待凝胶固化后，37℃培养24h，计数；另以1ml菌液倾注营养琼脂平板，37℃培养24h，作为对照并进行操作计数。
4)以红的菌落为阳性菌落，进行计数和均值t检验。结果表明，两种检验方法对6株试验菌的检验结果无显著差异(t＝0.804，P＝0.442＞0.05)。
2种方法测定试验菌株菌落总数(x±S，n＝2)