一种天然骨胶原的制备方法.pdf

本发明提供一种天然骨胶原的制备方法，其采用从畜禽骨中提取和纯化，包括如下步骤：清洗；粉碎；脱脂、脱无机物；酸浸泡；酶水解；分离纯化；冷冻干燥。采用本发明方法制得的天然骨胶原，能保持完整的胶原三螺旋结构，从而保留了生物活性，并且纯度能达到90％以上，具有较高的提取率，可以广泛应用于食品、化妆品、生物医学等领域。

1、  一种天然骨胶原的制备方法，其特征在于，采用低温处理工艺，其包括如下步骤：
1)清洗：将新鲜畜禽骨进行水清洗；
2)粉碎：将清洗后的畜禽骨进行粉碎至粒度80～120目的骨泥；
3)脱脂、脱无机物：将骨泥与NaOH溶液或NaHCO₃溶液进行混合，搅拌后分层，取底层，并用水进行洗涤，分离得蛋白质，再将其用石油醚或者丙酮浸提，浸提分离后的蛋白质中加入EDTA，搅拌均匀后，静置，然后用蒸馏水反复洗涤、过滤，得过滤物；再用盐酸胍-Tris-HCl混合搅拌，静置，然后用蒸馏水反复洗涤、过滤，得过滤物；
4)酸浸泡：将过滤物用酸浸泡；
5)酶水解：再加入蛋白酶进行酶解；
6)分离、纯化：然后离心分离，取上清液进行盐析，盐析的沉淀物用乙酸溶液溶解，再经盐析、膜透析处理得透析物；
7)冷冻干燥：最后将透析物离心处理，并经冷冻干燥而成。

2、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂、脱无机物、酸浸泡、酶水解、分离纯化均在0～10℃下进行。

3、  如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述粉碎经过强力破骨、细粉碎两次粉碎处理。

4、  如权利要求1-3任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中NaOH溶液的质量百分浓度为0.4～0.8％，NaHCO₃溶液的质量百分浓度0.8～1.6％，pH控制为9～12，石油醚或者丙酮的浸提次数为1～3次。

5、  如权利要求1-4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA溶液的浓度为0.01～3mol/l，用量为蛋白质重量的2～15倍；所述的盐酸胍-Tris-HCl浓度为0.5～5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl，用量为1～20倍蛋白质重量。

6、  如权利要求1-5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中所述酸浸泡的pH值控制在1.5～5之间，优选采用5～15倍所述过滤物重量的0.05～3mol/l的醋酸溶液、0.01～2mol/l的柠檬酸或0.01～0.1mol/l的盐酸溶液进行浸泡，时间为12～72hr。

7、  如权利要求1-6任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中所述蛋白酶为pH1.5～5的胃蛋白酶、pH6～8的木瓜蛋白酶或pH8～10的胰蛋白酶，用量为蛋白质量的0.1～5％，时间为24～96hr。

8、  如权利要求1-7任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤6)中在离心分离时先加入EDTA溶液，浓度为0.001～0.04mol/l，用量为分离液重量的0.1～15倍。

9、  如权利要求1-8任意一项所述的制备方法，其特征在于，取上清液进行盐析时，采用氯化钠，浓度为0.5～3mol/l，静置12～48hr，所述乙酸溶液的浓度为0.1～3mol/l。

10、  如权利要求1-9任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸溶解后经1～6次盐析处理，所述膜透析处理1～3次。

一种天然骨胶原的制备方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体地说，涉及一种从畜禽骨中提取和纯化天然骨胶原的方法。
背景技术
我国是世界第一肉类生产大国，畜禽骨约占动物体重的20％-30％，每年能产生约近2000万吨的畜禽骨，多以初级形式加工为主，利用率不足10％，造成一定环境污染。目前，骨的深加工逐渐受到行业的重视，如何充分利用畜禽骨骼资源，是迫切需要解决的问题。
骨的营养价值丰富，骨中的粗蛋白、脂肪含量与肉十分接近，骨髓中的磷蛋白、磷脂质、胆碱、软骨素、骨胶原等，亦是无法从其他物质中获取。此外，骨中钙和磷的比例为2∶1，最适宜人体对钙磷的吸收。
在种类繁多的蛋白质中，胶原是一类重要的蛋白质，它是细胞外基质的一种结构蛋白质，含有一个或几个由α-链组成的三螺旋结构的区域。它广泛存在于从低等脊椎动物到哺乳动物机体的一切组织中，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质，占体内蛋白质总量的25-30％，其中90％存在于皮肤和骨骼中。胶原亦是骨骼中含量最多的蛋白质，占骨骼中蛋白质总量的80％以上，胶原在骨质中呈网状结构，能够使骨的硬度和韧性增强。通常胶原蛋白是指具有的三螺旋结构没有改变，且保留生物活性的蛋白质；明胶则指三螺旋结构发生改变，且不具有生物活性的蛋白质。若它们被水解成小分子，则称为胶原多肽。胶原含有多种类型，不同类型提供的功能不同，主要有改善骨质疏松、保持皮肤弹性与湿润，防止老化、为骨骼、腱、角膜、皮肤、血管提供支架等重要功能。胶原蛋白可以成为重要的生物医学材料和工业材料，在美容、保健、食品和饲料工业也能发挥重要作用，如在手术缝合线、止血海绵、人工血管角膜、神经修复等的临床应用中。
涉及骨胶原方面的专利有一些，比如专利文献CN 1334302(发明名称为骨胶原的制备方法)、CN 1334026(发明名称为骨胶原复合调味料的制备方法)、CN 1033481(发明名称为从猪牛羊骨中提取骨胶原蛋白的制备工艺)、CN 1028379(发明名称为鹿骨胶原软胶囊及其制造方法)等，均公开的方法是采用将破碎后的骨块加热蒸煮，加入蛋白酶进行酶解等步骤进行生产，骨胶原进行了深度水解，转变成为骨胶原多肽。
专利文献CN 1385489(发明名称为从动物软骨中提取复合骨胶原的加工工艺)，公开了一种从动物软骨中提取复合骨胶原的加工工艺，该工艺包括如下步骤：选料清洗→碱性水溶液水解→冷却加酸→过滤→浓缩→酒精沉淀→脱水→烘干包装。改变了原有物质的分子结构，胶原蛋白不存在生物活性。
专利文献CN 1473901(发明名称为酶降解骨胶原制备明胶的方法)，公开的是一种获取明胶的制备方法。
专利文献CN 1763135(发明名称为一种骨胶原凝胶液的制备方法)涉及生物医学工程领域，是一种为进行双相接种法构建组织工程骨而制备骨胶原的方法，特别是一种骨胶原凝胶液的制备方法，偏重于骨架的构建。
本发明提供的天然骨胶原的制备方法，可以使胶原保持完整的三螺旋结构，从而保留了生物活性，并且通过提取，纯度可达到90％以上，具有较高的提取率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作相对简单、提取率高的从畜禽骨中提取和纯化天然骨胶原的方法。
本发明的天然骨胶原的制备方法，其采用低温处理工艺，包括如下步骤：
1)清洗：将新鲜畜禽骨进行水清洗；
2)粉碎：将清洗后的畜禽骨进行粉碎至粒度80～120目的骨泥；
3)脱脂、脱无机物：将骨泥与NaOH溶液或NaHCO₃溶液进行混合，搅拌后分层，取底层，并用水进行洗涤，分离得蛋白质，再将其用石油醚或者丙酮浸提，浸提分离后的蛋白质中加入EDTA，搅拌均匀后，静置，然后用蒸馏水反复洗涤、过滤，得过滤物；再用盐酸胍-Tris-HCl混合搅拌，静置，然后用蒸馏水反复洗涤、过滤，得过滤物；
4)酸浸泡：将过滤物用酸浸泡；
5)酶水解：再加入蛋白酶进行酶解；
6)分离、纯化：然后离心分离，取上清液进行盐析，盐析的沉淀物用乙酸溶液溶解，再经盐析、膜透析处理得透析物；
7)冷冻干燥：最后将透析物离心处理，并经冷冻干燥而成。
其中，所述的畜禽骨为牛骨、猪骨、羊骨、鸡骨等畜禽骨。
所述低温为0～10℃，即脱脂、脱无机物、酸浸泡、酶水解、分离纯化均在0～10℃下进行，保持了胶原的生物活性。
步骤2)中所述粉碎可经过强力破骨、细粉碎两次粉碎处理。
所述强力破骨采用破骨机进行处理，粗粉碎后的粒度≤1mm。为了保证鲜骨的顺利出料，在粉碎时添加适量的冰水，冰水的添加量为鲜骨重量的30～40％。
所述细粉碎采用骨泥磨进行两道磨碎，第一道骨泥磨转子和定子的间隙大，第二道骨泥磨转子和定子的间隙小，细粉碎后得到80～120目的骨泥。
磨碎之前将冰屑与物料混合均匀，控制物料出口温度≤10℃，冰屑的添加量为鲜骨重量的30～40％。
步骤3)中NaOH溶液的质量百分浓度为0.4～0.8％，NaHCO₃溶液的质量百分浓度0.8～1.6％，pH控制为9～12。
搅拌的速度为60～90rpm/min，时间为6～10小时，直至液面上没有脂肪凝聚。
搅拌脱脂后，脂肪聚集成团浮在液面，蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪，用热水洗涤，去除残留的碱，直至脂肪呈中性，得到骨油和脱脂骨泥，其进一步处理可得骨粉。
底层的蛋白质和无机物采用冷水搅拌洗涤，由于密度不同将其进行初步分离，初步分离的蛋白质再加入3～5倍重量份的石油醚或丙酮，浸提4～24小时，可采用多次浸提，优选浸提1～3次。
所述的EDTA溶液的浓度为0.01～3mol/l，用量为蛋白质重量的2～15倍。所述的盐酸胍-Tris-HCl浓度为0.5～5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl，用量为1～20倍蛋白质重量。
静置温度为10℃以下，时间为4～24hr。
蒸馏水反复洗涤的次数为3～6次。
步骤4)中所述酸浸泡的pH值控制在1.5～5之间，优选采用5～15倍所述过滤物重量的0.05～3mol/l的醋酸溶液、0.01～2mol/l的柠檬酸或0.01～0.1mol/l的盐酸溶液进行浸泡，时间为12～72hr。
步骤5)中所述蛋白酶为pH1.5～5的胃蛋白酶、pH6～8的木瓜蛋白酶或pH8～10的胰蛋白酶，用量为蛋白质量的0.1～5％，时间为24～96hr。
步骤6)中在离心分离时还可加入EDTA溶液，浓度为0.001～0.04mol/l，用量为分离液重量的0.1～15倍。
离心分离在离心机中进行，转速为5000～15000rpm，离心时间为10～50分钟。
取上清液进行盐析时，可采用氯化钠，浓度为0.5～3mol/l，一般静置12～48hr。然后用转速为7000～15000rpm离心机离心10～50分钟分离。
沉淀物用乙酸溶液(浓度为0.1～3mol/l)完全溶解，溶解后再加入氯化钠盐析，可进行1～6次。
所述膜透析处理是以蒸馏水为透析液，经过透析膜(MW＞1000)透析24～96hr。可进行1～3次。
步骤7)中在0～10℃下，将透析物用转速为7000～15000rpm离心机，离心10～50分钟。不溶物置于冻干机，冷冻干燥12～48hr。
本发明从畜禽骨中提纯天然骨胶原的方法，采用于畜禽骨中低温提取胶原，得到的胶原具有完整的三螺旋结构，从而保留了生物活性，并且纯度能达到90％以上，具有较高的提取率，可以广泛应用于食品、化妆品、生物医学等领域。
附图说明
图1为紫外分光光度计测定本发明的天然牛骨胶原在228nm处的吸收图；
图2为傅立叶变换红外光谱仪测定的天然骨胶原的吸收图；
图3为SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1从牛骨中提纯天然牛骨胶原粉
天然胶原从动物皮中提取比较多见，但是从骨中提取很少见，它涉及到脂肪和无机物含量高，提取率和提纯率难等特点，尤其牛骨，
本实施例从牛棒骨中提纯天然牛骨胶原粉，由下述步骤制得：
(1)清洗：采用鲜牛棒骨1000g作为原料，经水清洗，确保原料骨符合卫生要求。
(2)强力破骨：将清洗后的牛棒骨用破骨机进行强力破骨。为了保证鲜骨的顺利出料，在粉碎时添力300g的冰水，粗粉碎后的粒度≤1mm。
(3)细粉碎：将强力破骨后的物料用骨泥磨进行两道磨碎，第一道间隙大，第二道间隙小，在磨碎之前将冰屑与物料混合均匀，控制物料出口温度≤10℃，冰屑的添加量为鲜骨重量的40％。细粉碎后得到粒度120目的骨泥。
(4)脱脂、脱无机物：采用化学方法进行脱脂。在室温下，选择0.4％的NaOH溶液，骨泥混合均匀，使pH达到10，在80rpm/min的搅拌速度下，脱脂10小时。脱脂后，脂肪聚集成团浮在液面，蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪，用热水洗涤，去除残留的碱，直至脂肪呈中性，得到骨油和脱脂骨泥；用冷水搅拌洗涤剩下的蛋白质和无机物，由于密度不同将其进行初步分离，初步分离的蛋白质再加入3倍重量份的石油醚，浸泡12小时，倒出浸提液，这样用石油醚浸提2次，分离出来的蛋白质加入10倍重量份的0.5mol/l的EDTA，搅拌均匀后，置于冰箱(4℃)静置24hr，用蒸馏水反复进行洗涤3次，过滤、去除滤液。分离出来的蛋白质加入1倍重量份的5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl，搅拌均匀后，置于冰箱(4℃)静置8hr，用蒸馏水反复进行洗涤6次，过滤、去除滤液。
(5)酸浸泡：在4℃下，加入5倍重量份的0.1mol/l的盐酸溶液，控制pH值为2.5，静置36hr。
(6)酶水解：在10℃下，加入蛋白质量2％的胃蛋白酶(pH值2.5)，搅拌24hr。
(7)分离：加入5倍重量份的0.04mol/l的EDTA溶液，搅拌均匀，在4℃下，将混合液用转速为10000rpm的离心机，离心30分钟。
(8)纯化：取上清液进行盐析，氯化钠浓度为1.0mol/l，4℃下，静置24hr，将混合液用转速为10000rpm离心机，离心20分钟。沉淀物用200倍量的0.1mol/l的乙酸溶液，完全溶解，溶解后再加入氯化钠，浓度为1.0mol/l，如此反复进行盐析3次。再以蒸馏水为透析液，经过透析膜透析32hr，反复2次。
(9)冷冻干燥：在4℃下，将透析物用转速为7000rpm离心机，离心10分钟。不溶物置于冻干机，至其水分含量小于3％，制得天然、未变性的骨胶原粉。
经本实施例的方法提纯天然牛棒骨胶原粉颜色呈白色、无异味、无杂质，胶原含量达94％以上。
分别采用紫外分光光度计、傅立叶变换红外光谱仪、SDS-PAGE电泳图进行鉴别，结果见图1和2、3。
图1显示此天然牛棒骨胶原最大紫外光吸收波长在228nm处，形成一个较陡峭的峰，符合胶原蛋白特殊吸收峰波长位置，与文献报道(Nagal T，Food Chemistry，2002，76)的I型胶原特征相符。
图2中3327cm^-1附近是N-H伸缩振动，1658cm^-1附近是酰胺I带的C＝O伸缩振动，1547cm^-1附近是酰胺II带的N-H弯曲振动，1450cm^-1～1230cm^-1附近的吸收峰表明了胶原蛋白3股螺旋结构的完整性(Plepis A M G，International Symposium onElectrets，1999，10)。
图3是SDS-PAGE电泳图，从图中可以看出，两条分子量在130kDa处左右的链，以及一条分子量在120kDa处左右的链，从图看是胶原I型典型的电泳图，符合胶原I中3条肽链的结构类型，2条α₁-肽链及1条α₂-肽链(陆璐，I型胶原的提取及其组装和表征，东南大学学位论文，2006)。图中α-肽链以下没有多余的电泳带，说明所提取的胶原中没有小分子的水解胶原和多肽。
实施例2
本实施例从猪骨中提纯天然骨胶原粉，由下述步骤制得：
(1)清洗：采用鲜猪骨1000g作为原料，经水清洗，确保原料骨符合卫生要求。
(2)强力破骨：将清洗后的猪骨用破骨机进行强力破骨。为了保证鲜骨的顺利出料，在粉碎时添加400g的冰水，粗粉碎后的粒度≤1mm。
(3)细粉碎：将强力破骨后的物料用骨泥磨进行两道磨碎，第一道间隙大，第二道间隙小，在磨碎之前将冰屑与物料混合均匀，控制物料出口温度≤10℃，冰屑的添加量为鲜骨重量的30％。细粉碎后得到粒度80目的骨泥。
(4)脱脂、脱无机物：采用化学方法进行脱脂。在室温下，选择0.8％的NaOH溶液与骨泥混合均匀，使pH达到12，在90rpm/min的搅拌速度下，脱脂6小时。脱脂后，脂肪聚集成团浮在液面，蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪，用热水洗涤，去除残留的碱，直至脂肪呈中性，得到骨油和脱脂骨泥；用冷水搅拌洗涤剩下的蛋白质和无机物，由于密度不同将其进行初步分离，初步分离的蛋白质再加入4倍重量份的丙酮，浸泡12小时，倒出浸提液，这样用丙酮浸提1次，分离出来的蛋白质加入3倍重量份的3mol/l的EDTA，搅拌均匀后，置于冰箱(4℃)静置4hr，用蒸馏水反复进行洗涤4次，过滤、去除滤液。分离出来的蛋白质加入20倍重量份的0.5mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl，搅拌均匀后，置于冰箱(4℃)静置4hr，用蒸馏水反复进行洗涤3次，过滤、去除滤液。
(5)酸浸泡：在1℃下，加入15倍重量份的0.1mol/l的醋酸溶液，控制pH值为1.5，静置12hr。
(6)酶水解：在1℃下，加入蛋白质量0.1％的木瓜蛋白酶(pH8)，搅拌36hr。
(7)分离：加入15倍重量份的0.001mol/l的EDTA溶液，搅拌均匀，在8℃下，将混合液用转速为15000rpm的离心机，离心10分钟。
(8)纯化：取上清液进行盐析，氯化钠浓度为1.5mol/l，1℃下，静置12hr，将混合液用转速为7000rpm离心机，离心50分钟。沉淀物用200倍量的0.5mol/l的乙酸溶液，完全溶解，溶解后再加入氯化钠，浓度为1.5mol/l，如此反复进行盐析4次。再以蒸馏水为透析液，经过透析膜透析24hr，反复3次。
(9)冷冻干燥：在4℃下，将透析物用转速为10000rpm离心机，离心50分钟。不溶物置于冻干机，至其水分含量小于3％，制得天然、未变性的骨胶原粉。
经本实施例的方法提纯天然骨胶原粉颜色呈白色、无异味、无杂质，胶原含量达94％以上。
实施例3
本实施例从鸡骨中提纯天然骨胶原粉，由下述步骤制得：
(1)清洗：采用鸡骨1000g作为原料，经水清洗，确保原料骨符合卫生要求。
(2)强力破骨：将清洗后的鸡骨用破骨机进行强力破骨。为了保证鲜骨的顺利出料，在粉碎时添加350g的冰水，粗粉碎后的粒度≤1mm。
(3)细粉碎：将强力破骨后的物料用骨泥磨进行两道磨碎，第一道间隙大，第二道间隙小，在磨碎之前将冰屑与物料混合均匀，控制物料出口温度≤10℃，冰屑的添加量为鲜骨重量的35％。细粉碎后得到粒度100目的骨泥。
(4)脱脂、脱无机物：采用化学方法进行脱脂。在室温下，选择1.0％NaHCO₃溶液，与骨泥混合均匀，使pH达到9，在60rpm/min的搅拌速度下，脱脂8小时。脱脂后，脂肪聚集成团浮在液面，蛋白质和无机物则在底层。收集所得脂肪，用热水洗涤，去除残留的碱，直至脂肪呈中性，得到骨油和脱脂骨泥；用冷水搅拌洗涤剩下的蛋白质和无机物，由于密度不同将其进行初步分离，初步分离的蛋白质再加入5倍重量份的石油醚，浸泡12小时，倒出浸提液，这样用石油醚浸提3次，分离出来的蛋白质加入15倍重量份的0.01mol/l的EDTA，搅拌均匀后，置于冰箱(4℃)静置12hr，用蒸馏水反复进行洗涤6次，过滤、去除滤液。分离出来的蛋白质加入10倍重量份的1mol/l盐酸胍-0.05mol/lTris-HCl，搅拌均匀后，置于冰箱(4℃)静置12hr，用蒸馏水反复进行洗涤4次，过滤、去除滤液。
(5)酸浸泡：在10℃下，加入10倍重量份的1mol/l的柠檬酸溶液，静置72hr。
(6)酶水解：在4℃下，加入蛋白质量的5％的胰蛋白酶(pH10)，搅拌96hr。
(7)分离：加入10倍重量份的0.01mol/l的EDTA溶液，搅拌均匀，在0℃下，将混合液用转速为15000rpm的离心机，离心20分钟。
(8)纯化：取上清液进行盐析，氯化钠浓度为2.0mol/l，10℃下，静置48hr，将混合液用转速为10000rpm离心机，离心20分钟。沉淀物用100倍量的3mol/l的乙酸溶液，完全溶解，溶解后再加入氯化钠，浓度为2.0mol/l，如此反复进行盐析2次。再以蒸馏水为透析液，经过透析膜透析96hr。
(9)冷冻干燥：在10℃下，将透析物用转速为15000rpm离心机，离心15分钟。不溶物置于冻干机，至其水分含量小于3％，制得天然、未变性的骨胶原粉。
经本实施例的方法提纯天然骨胶原粉颜色呈白色、无异味、无杂质，胶原含量达94％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。