通过细胞同步化的杂交瘤融合效率的增强 【发明背景】
【1】发明领域
【2】本发明涉及通过融合配偶体的细胞同步化来增强杂交瘤融合效率的方法，其目的在于辅助抗体的生产。
【3】相关技术
【4】单克隆抗体(mAbs)作为治疗试剂在多种疾病的治疗中已经成为了一种有效的方法。此外，单克隆抗体也是更好地了解多种疾病的免疫病理的有力工具。
【5】单克隆抗体的产生过程首先由Kohler和Milstein报道(Kohler和Milstein，Nature 256：495-497(1975))，他们通过杂交瘤技术产生单克隆抗体，从此这种方法成为实验室的标准程序。杂交瘤产生的一般方案包括：(i)用纯化的蛋白抗原免疫动物(例如：小鼠、大鼠或兔子)；(ii)收集生产抗体的B细胞，一般是从脾中；(iii)将B细胞同次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷的非分泌的骨髓瘤细胞系(例如，x63-Ag 8.653，来源于BALB/c小鼠株)融合；(iv)在含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)的选择培养基中培养杂交瘤细胞；并且(v)筛选能够生产期望的抗体的细胞；并且(vi)极限稀释克隆以获得分泌该抗体的均一细胞系。
【6】在这个耗时的多步过程中，最重要的步骤之一为细胞融合，即分泌抗体的B细胞和骨髓瘤细胞融合。鼠科的HGPRT阴性B细胞骨髓瘤细胞系，FO，倍增时间8-12小时，在杂交瘤方法中已经成为一种标准的融合配偶体。当与来自正产生强烈体液免疫反应的小鼠的脾细胞融合时，分泌目的mAb的源自FO的杂交瘤能够快速地生成。
【7】但是，这种细胞融合方法的效率非常低。即使在已知最好的条件下，例如试剂纯度，温度，和细胞存活率，仅有大约0.08％的脾抗体分泌细胞能够融合。这种效率低下归结于许多因素。例如，两个脾细胞融合产生的杂交瘤不是永生的，不会生长；两个骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤不分泌抗体，并且将在选择培养基中死亡。此外，多于两个细胞的融合产生不稳定的合胞体并且多核体将无法生存。
【8】由于所有这些变数的存在，最初的杂交瘤往往都不稳定，而且在选择过程中无法存活，而存活的那些通常分泌低水平的抗体。因此，需要产生杂交瘤及生产单克隆抗体的改进的方法。
【9】发明概述
【10】本发明提供了一种提高杂交瘤融合效率的方法，包括同步化融合配偶体细胞。一方面，本发明提供了生产抗体的B细胞的同步化。另一方面，本发明提供了小鼠骨髓瘤细胞的同步化。
【11】在一个实施方案中，同步化是通过血清饥饿实现的。本发明提供了一种产生抗体的更有效的方法。相应地，另一方面，本发明提供了利用本发明改进的方法生产的抗体。利用本发明生产的抗体可用于治疗、诊断、和/或研究目的。
【12】发明详述
【13】引证：本文引证的所有的出版物或专利当显示本发明时的技术状态和/或提供了本发明的描述和实现时，全文通过援引并入本文。出版物是指任何科学或专利的出版物，或以任何媒体形式，包括所有地记录，电子或印刷形式，可获得的任何其他信息。以下参考文献全文通过援引并入本文：Ausubel，等，ed.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，NY(1987-2006)；Sambrook，等Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan，等，eds.，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2006)；Colligan等，Current Protocols in ProteinScience，John Wiley & Sons，NY，NY，(1997-2006)。
【14】术语“免疫原”在本文中是指潜在地可诱发受试者中的免疫反应的分子。由于一些免疫原在不含佐剂的情况下给予时，不引起免疫反应，术语“免疫原”包括当与佐剂共施用才能引起免疫反应的分子。
【15】术语“单克隆抗体”在本文中是指单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。单克隆抗体包括鼠、人、人化和嵌合单克隆抗体。
【16】一般来说，抗体是对特定免疫原表现出结合特异性的蛋白质或者多肽。完整的抗体是异源四聚糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。通常每个轻链通过一个共价二硫键连接到重链，而不同免疫球蛋白同种型重链之间的二硫键的数目是不同的。每个重链和轻链中也存在规则间隔的链内二硫键。每个重链的一端有一个可变区(VH)，紧接着多个恒定区。每个轻链在其一端有一个可变区(VL)而在另一端有一个恒定区。轻链的恒定区同重链的第一个恒定区是对准的(aligned)，而轻链的可变区同重链的可变区是对准的。任何脊椎动物种抗体的轻链都可以根据他们恒定区氨基酸序列分成命名为κ和λ的明显不同的两种类型之一。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为五种主要类，即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgA和IgG进一步可亚分类为同种型：IgA1，IgA2，IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
【17】一般地，制备和表征抗体的方法是本领域所公知的(例如，Ausubel，Harlow和Lane，以及Colligan，上文)。可根据免疫原的免疫方案施用免疫原。例如，可利用以足以诱发有效免疫反应的量的单次施用免疫原。或者，也可采用初次施用免疫原后一次或更多次强化的其他方案。施用可通过任何适合的途径，例如腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内、皮内或通过爪垫注射。一般使用啮齿类动物，如小鼠和大鼠。
【18】免疫接种之后，具有生产抗体潜能的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)，将被筛选出用于mAb的产生方案。这些细胞可从脾、扁桃体或淋巴结、或外周血样品获得。从免疫动物中得到的生产抗体的B细胞随后同永生的骨髓瘤细胞系的细胞融合。适合用于生产杂交瘤的融合方法的骨髓瘤细胞系优选是不生产抗体的，具有高融合效率，并且具有酶缺陷，该缺陷然后使得在仅仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择培养基中不能生长。例如，如果免疫动物是小鼠，那么可利用：P3-X63/Ag8，X63-Ag8.653，NS1/1.Ag41，Sp210-Ag14，FO，NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bu1。
【19】本领域中，产生生产抗体的脾细胞或淋巴结细胞以及骨髓瘤细胞的杂种的方法是众所周知的。一般地，体细胞与骨髓瘤细胞以2∶1的比例混合，然而当一种或复数种可促进细胞膜融合的试剂(化学的或电的)存在时，该比例分别可在约20∶1到约1∶1之间变化。用仙台病毒进行融合的方法已被Kohler& Milstein描述(1975；1976)，并且使用聚乙二醇(PEG)，如37％(v/v)的PEG的方法已被Gefter等描述(1977年)。使用电诱导融合方法也是可行的(Goding pp.71-74，1986)。
【20】尽管所有类型的细胞都能够融合，但是并非所有细胞都相同地融合，或都具有生存能力。例如，分裂活跃的母细胞样B细胞是最适用于与骨髓瘤细胞融合的细胞。如果B细胞没有进入母细胞样阶段，其细胞核与骨髓瘤细胞的细胞核没有同时进入有丝分裂，细胞融合将不会发生。并且，在内质网中过多的抗体翻译诱导非折叠蛋白质反应(UPR)，其可抑制翻译和诱导细胞调亡。换句话说，仅有为蛋白分泌而优化的细胞才能够分泌大量的抗体。因此，对于B淋巴母细胞同分裂活跃的骨髓瘤细胞并且每种仅仅一个之间的正确融合，细胞周期同步化对于杂交瘤融合效率是主要的贡献因素。
【21】本发明提供了一种改进的生产抗体的方法，其中可以操纵标准方法来提高抗体生产B细胞和骨髓瘤细胞之间的融合效率。在一个实施方式中，骨髓瘤细胞在与抗体生产B细胞融合之前被同步化。在另一个实施方式中，抗体生产B细胞在与骨髓瘤细胞融合之前被同步化。
【22】哺乳动物细胞细胞分裂周期有4个主要阶段。G0/G1期指的是分裂末期结束到DNA合成起始这段时间；S期对应于细胞倍增其DNA含量的这段时期；G2期指DNA合成结束到分裂前期开始的这段时期；并且M期指有丝分裂期。为了将一群细胞同步化，有一些方法能够将细胞可逆地阻滞在细胞周期的特定阶段。例如，诺考达唑(nocodazole)是抗有丝分裂试剂，它能够通过同β微管蛋白结合和防止两个链间二硫键之一的形成而破坏微管，从而抑制微管动力学，破坏有丝分裂纺锤体功能，断裂高尔基复合体。诺考达唑(nocodazole)使细胞周期停滞在G2/M期。其他例子包括含羞草素(mimosine)，一种植物氨基酸和铁螯合剂，其抑制DNA复制，并且使细胞周期停滞在G1/S期；以及蚜肠霉素(aphidocolin)，其通过干扰DNA聚合酶的活性防止有丝细胞分裂，也使细胞周期停滞在G1/S期。此外，对于大多数类型的细胞来说，在缺乏血清的培养基中细胞的生长诱导细胞周期停滞在G1期。
【23】培养中，大部分对数生长的细胞都处于细胞周期的G1期。但是，这一时期可能不是细胞融合的最佳时期。已经发现：以秋水仙碱，一种能够将细胞停滞于有丝分裂中期的有丝分裂纺锤体抑制剂，处理骨髓瘤细胞之后，杂交瘤细胞融合的集落数量提高26％-570％。根据本发明，使用一种或更多种细胞周期抑制剂之后洗涤和/或恢复正常培养基，能让细胞以同步化模式生长。此外，通过改变恢复时间，能够在融合之前选择B细胞或者骨髓瘤细胞处于的细胞周期的阶段。
【24】融合之后，杂交瘤群在选择培养基中培养，特定的杂交瘤被筛选出来。一般地，杂交瘤的筛选是通过下列步骤进行：通过在微量滴定板中单个克隆稀释培养细胞，随后(大约2周到3周之后)，测试各个克隆上清液的期望的反应性。该测定可以是放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、免疫斑点测定等。
【25】抗体生产细胞也可以从免疫了感兴趣的抗原的人或其他合适的动物的外周血或优选脾或者淋巴结中得到。任何合适的宿主细胞也能够用于表达编码本发明的抗体、其特异性片段或变体的异源或内源核酸。融合细胞(杂交瘤)或重组细胞可以使用选择性培养条件或其他适合的已知方法分离，并用极限稀释或细胞分选或其他已知的方法进行克隆。生产具有期望的特异性的抗体的细胞能够通过适合的方法筛选(例如：ELISA)。
【26】在本领域中，其他合适的生产或分离具有所需特异性的抗体的方法是众所周知的，例如，参见Colligan，Harlow和Lane，Ausubel，上文，其每篇均全文通过援引并入本文。工程化或者人化非人或人抗体的方法也是可利用的并且是本领域所熟知的。一般地，人化或工程化的抗体具有一个或更多个非人源，例如，但不限于：小鼠，大鼠，兔，非人类灵长类动物或其他哺乳动物，的氨基酸残基。这些人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其通常是取自已知的人类序列的“输入”的可变，恒定或其他区。已知的人类Ig序列是本领域公知的，且可使用任何已知的序列。参见，例如，但不限于，Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，U.S.Dept.Health(1983)和PCT公开WO 05/33029和US 10/872,932，其提交于2004年6月21日，全文通过援引并入本文。
【27】如本领域公知的，这种输入序列可以用来降低免疫原性，或降低，提高或修饰结合性、亲和性、结合速率(on-rate)、解离速率(off-rate)、抗体亲抗原性、特异性、半衰期或任何其他合适的特征。一般地，部分或全部非人类或人类CDR序列被保留，同时在可变区和恒定区的非人序列被人或其他氨基酸所取代。抗体还可以任选地进行人化，同时保留对于抗原的高亲和性和其他有利的生物学特性。为了实现这一目标，人化抗体任选可通过利用亲本序列和人化序列的三维模型对亲本序列和各种概念上的人化产品进行分析的方法而制备。三维免疫球蛋白的模型对本领域技术人员来说通常是可获得的并且是熟悉的。用来说明和显示选择的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能的作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合它的抗原的能力的残基。通过这种方法，FR的残基能够从一致和输入的序列选择出来并组合，以获得期望的抗体特性，如提高的对靶抗原的亲和性。一般的，CDR残基是直接的和最主要参与影响抗原结合的。本发明的抗体的人化或工程化可以用任何已知的方法实施，例如，但不限于描述于下文的那些，Winter(Jones等，Nature 321：522(1986)；Riechmann等，Nature 332：323(1988)；Verhoeyen等，Science 239：1534(1988))，Sims等，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia and Lesk，J.MoI.Biol.196：901(1987)，Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等，J.Immunol.151：2623(1993)，美国专利号：5723323，5976862，5824514，5817483，5814476，5763192，5723323，5,766886，5714352，6204023，6180370，5693762，5530101，5585089，5225539；4816567，PCT/：US98/16280，US96/18978，US91/09630，US91/05939，US94/01234，GB89/01334，GB91/01134，GB92/01755；WO90/14443，WO90/14424，WO90/14430，EP 229246，Colligan，Ausubel，Harlow and Lane，上文，每一篇全文通过援引并入本文，包括其引用的参考文献。
【28】如本文所述和/或本领域公知的，抗体还可以任选通过免疫能够生产人抗体的所有组成成分的转基因动物(例如，小鼠，大鼠，仓鼠，非人类灵长类动物等)而产生。生产期望的抗体的细胞可以由这些动物分离并利用适当的方法永生化，如本文所述的方法。
【29】可以生产结合人抗原的人抗体的所有组成成分的转基因小鼠可以用已知的方法产生(例如，但不限于，授予Lonberg等的美国专利号：5,770,428，5,569,825，5,545,806，5,625,126，5,625,825，5,633,425，5,661,016和5,789,650；Jakobovits等WO 98/50433，Jakobovits等WO 98/24893，Lonberg等WO98/24884，Lonberg等WO 97/13852，Lonberg等WO 94/25585，Kucherlapate等WO 96/34096，Kucherlapate等EP 0463 151 B1，Kucherlapate等EP 0710 719 A1，Surani等美国专利号5,545,807，Bruggemann等WO 90/04036，Bruggemann等EP 0438 474 B1，Lonberg等EP 0814 259 A2，Lonberg等GB 2 272 440A，Lonberg等Nature 368：856-859(1994)，Taylor等，Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Green等，Nature Genetics 7：13-21(1994)，Mendez等，Nature Genetics 15：146-156(1997)，Taylor等，Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)，Tuaillon等，Proc NatlAcad Sci USA 90(8)3720-3724(1993)，Lonberg等，Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)以及Fish wald等Nat Biotechnol 14(7)：845-851(1996)，每一篇全文通过援引并入本文)。一般地，这些小鼠包括至少一种转基因，所述转基因包含来自功能性重组的或可进行功能性重组的至少一种人免疫球蛋白基因座的DNA。在这种小鼠中内源性免疫球蛋白基因座可被破坏或缺失，以消除动物生产内源性基因编码的抗体的能力。
【30】因此，本发明的方法提供了更有效的产生抗体的途径。相应的，本发明还提供了使用本发明改进后的方法生产的抗体。利用本发明生产的抗体可用于治疗、诊断、和/或研究目的。
【31】已经一般性地描述了本发明之后，参考下面的实施例将更容易地理解其，所述实施例仅通过例示的方式提供并且不意图进行限制。
【32】实施例1FO骨髓瘤细胞血清饥饿提高杂交瘤细胞融合效率
【33】为了确定骨髓瘤细胞的细胞周期的阶段是否对杂交瘤融合效率有影响，在一段时间内通过血清剥夺(1％FBS)使FO细胞同步化。随后，同步化的FO细胞直接同脾B细胞融合，或在融合之前在完全培养基中恢复一段时间。简略的说，5只Balb/C小鼠用鸡蛋溶菌酶在Titermax中免疫，2周时强化，4周时收获。取脾，集中单细胞悬液，通过lympholyte M柱，并计数。另取首次用于实验的脾脏作为阴性对照。FO骨髓瘤细胞在DMEM+1％FBS中生长不同的时间，洗涤，并且然后在融合之前于DMEM+10％FBS培养基中恢复特定时间。每个样品以60×10^6脾细胞同60×10^6FO细胞混合(对于首次用于实验的对照以15×10^6脾与FO细胞混合)，用50％PEG融合，接种于96孔板于HAT培养基培养，浓度为4×10^6脾细胞/板。融合后7-11天评价细胞集落。结果表明，没有任何恢复期的血清剥夺不会提高融合效率。另一方面，血清剥夺后进行恢复会比与在完全培养基中孵育的FO细胞融合效率高。确定了对于FO骨髓瘤细胞而言，最佳的饥饿时间是13小时而最佳的恢复时间也是13小时。在融合之前进行这种处理，能够使融合效率提高45％。
【34】处理之前获得的骨髓瘤细胞，血清饥饿13小时后的骨髓瘤细胞，以及恢复13小时后的骨髓瘤细胞，以碘化丙啶(propidium iodide)染色，流式细胞仪分析DNA含量。未经处理的细胞中，49-52％的细胞处于G0/G1期，23-25％的细胞处于S期，而22％的细胞处于G2/M期。处理之后血清饥饿没有立即显著改变这一比例，但恢复之后，显著将处于S期的细胞群增加到38％。这与先前的报道相反，先前的报道暗示了当细胞同步处于M期时可提高杂交瘤融合效率。总之，本发明成功地增加了杂交瘤融合效率，其是高效的，并诱发最小副作用或没有副作用。
【35】本发明可以以与前面的描述和实施例所特别描述不同的方式实施。本发明的许多修饰和变化根据上面的教导是可能的，并且因此落在本发明的范围之内。
参考文献：
1.Kohler，G.，and C.Milstein.1975.Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity.Nature 256：495.
2.Reiner，S.L.，and R.M.Locksley.1995.The regulation of immunity to Leishmania major.Annu Rev Immunol 13：151.
3.Lonberg，N.，L.D.Taylor，F.A.Harding，M.Trounstine，K.M.Higgins，S.R.Schramm，C.C.Kuo，R.Mashayekh，K.Wymore，J.G.McCabe，and et al.1994.Antigen-specific humanantibodies from mice comprising four distinct genetic modifications.Nature 368：856.
4.Green，L.L.1999.Antibody engineering via genetic engineering of the mouse：XenoMousestrains are a vehicle for the facile generation of therapeutic human monoclonal antibodies.J ImmunolMethods 231：11.
5.de StGroth，S.F.，and D.Scheidegger.1980.Production of monoclonal antibodies：strategyand tactics.J Immunol Methods 35：1.
6.Panova，I.，and B.Gustafsson.1995.Increased human hybridoma formation by electrofusionof human B cells with heteromyeloma SPAM-8 cells.Hybridoma 14：265.
7.Kennett，R.H.1979.Cell fusion.Methods Enzymol 58：345.
8.Lane，R.D.，R.S.Crissman，and M.F.Lachman.1984.Comparison of polyethylene glycolsas fusogens for producing lymphocyte-myeloma hybrids.J Immunol Methods 72：71.
9.Campbell，A.M.1984.Monoclonal Antibody Technology.Elsevier，Glasgow.
10.Edgar G.Engleman，S.K.H.F.，James Larrick，and Andrew Raubitschek.1985.HumanHybridomas and Monoclonal Antibodies.Plenum Publishing Corporation，Stanford.
11.Lovborg，U.1982.Monoclonal Antibodies：Production and Maintenance.WilliamHeinemann Medical Books，London.
12.Gass，J.N.，K.E.Gunn，R.Sriburi，and J.W.Brewer.2004.Stressed-out B cells？Plasma-celldifferentiation and the unfolded protein response.Trends Immunol 25：17.
13.Hetz，C.，P.Bernasconi，J.Fisher，A.H.Lee，M.C.Bassik，B.Antonsson，G.S.Brandt，N.N.Iwakoshi，A.Schinzel，L.H.Glimcher，and S.J.Korsmeyer.2006.Proapoptotic BAX and BAKmodulate the unfolded protein response by a direct interaction with IRE1alpha.Science 312：572.
14.Cooper，G.M.1997.The Cell：A Molecular Approach.Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.
15.Golias，C.H.，A.Charalabopoulos，and K.Charalabopoulos.2004.Cell proliferation and cellcycle control：a mini review.Int J Clin Pract 58：1134.
16.Miyahara，M.，H.Nakamura，and Y.Hamaguchi.1984.Colcemid treatment of myeloma priorto cell fusion increases the yield of hybridomas between myeloma and splenocyte.Biochem BiophysRes Commun 124：903.
17.Moses，R.M.，D.Kline，and Y.Masui.1995.Maintenance of metaphase in colcemid-treatedmnouse eggs by distinct calcium-and 6-dimethylaminopurine(6-DMAP)-sensitive mechanisms.DevBiol 167：329.
18.Park，C.H.，H.R.Kim，J.Kim，S.H.Jang，K.Y.Lee，G.H.Chung，and Y.S.Jang.2004.Latent membrane protein 1 of Epstein-Barr virus plays an important role in the serum starvationresistance of Epstein-Barr virus-immortalized B lymphocytes.J Cell Biochem 91：777.
19.Stadler，J.K.，and E.A.Adelberg.1972.Cell cycle changes and the ability of cells to undergovirus-induced fusion.Proc Natl Acad Sci U S A 69：1929.