抑制人bFGF基因表达增殖的siRNA序列及其表达载体和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101575602 B (45)授权公告日 2011.06.22 CN 101575602 B *CN101575602B* (21)申请号 200810053006.X (22)申请日 2008.05.06 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) A61K 31/713(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 天津市第一中心医院 地址 300192 天津市南开区复康路 24 号 (72)发明人 王金环 王淑杰 冯学泉 张飚 徐新女 (74)专利代理机构。

2、 天津市宗欣专利商标代理有 限公司 12103 代理人 董光仁 CN 1654664 A,2005.08.17, CN 1150944 C,2004.05.26, 王金环等 . 碱性成纤维细胞生长因子反义寡 核普酸抑制胶质瘤细胞增殖的体外试验 .中华 实验外科杂志 .1998, 第 15 卷 ( 第 6 期 ), 秦艳芳等 . 不同作用靶点的 bFGF 反义脱 氧寡核苷酸对胶质瘤 SWO - 38 细胞效应的观 察 .中国病理生理杂志 .2003, 第 19 卷 ( 第 6 期 ), (54) 发明名称 抑制人bFGF基因表达增殖的siRNA序列及其 表达载体和应用 (57) 摘要 本发明公开。

3、了一种抑制人 bFGF 基因表达的 siRNA 序列及其表达载体和应用， 属于生物工程 技术。本发明是将 bFGF-siRNA 导入肿瘤细胞后， 可以靶向作用于 bFGF 基因的 mRNA， 从而阻断其 翻译过程， 有效地沉默 bFGF 基因， 能够有效抑制 bFGF 的基因表达， 能有效抑制肿瘤细胞的增殖活 性， 还可诱导细胞凋亡， 从而抑制肿瘤细胞的生 长。本发明可用于制备高效、 快速、 特异性强的抗 肿瘤药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吕健 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 3 页 CN 1015。

4、75602 B1/1 页 2 1. 一种抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA， 其具有特异性抑制肿瘤细胞的作用， 其 碱基序列如下 ： 5 -CGAACUGGGCAGUAUAAACdtdt-3 5 -GUUUAUACUGCCCAGUUCGdtdt-3。 2. 一种抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 表达载体， 其特征在于包含如权利要求 1 所述的 siRNA， 具有特异性抑制人 bFGF 基因表达， 特异性抑制人胶质瘤细胞的作用。 3. 根据权利要求 2 所述抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 表达载体， 其特征在于 ： DNA 序列中真核质粒载体是 pGPU。

5、6/GFP/Neo-shbFGF。 4. 权利要求 1 所述抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 在制备抑制胶质瘤药物中的 应用。 5. 权利要求 2 所述抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 表达载体在制备抑制胶质瘤 药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101575602 B1/10 页 3 抑制人bFGF基因表达增殖的siRNA序列及其表达载体和应 用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术， 特别是一种抑制人bFGF基因表达和增殖的siRNA序列 及其表达载体和应用。 背景技术 0002 多肽生长因子也称细胞生长调节因子， 是生物机体内调节细胞生长、 增殖、。

6、 分化等 具有多种功能的信号因子， 很多肿瘤可以分泌生长因子， 通过自分泌和旁分泌的方式刺激 肿瘤细胞生长， 所以从某种意义上讲， 细胞的癌变是以某种方式干扰或破坏了生长因子的 正常信号通路， 使细胞的生长、 增殖、 分化从有序状态变为失控状态。而这些多肽生长因子 均具备癌基因的生物学特性， 可以称为前癌基因。生长因子类基因中碱性成纤维细胞生长 因子 (bFGF) 的生物学作用显著， 它是成纤维细胞生长因子家族中的代表成员， 其作用较其 它成员强十倍或数十倍。现已探明该基因与胶质瘤的血管生成， 与胶质瘤的细胞增殖关系 密切， 并有可能抑制了胶质瘤细胞的凋亡， 在胶质瘤的发生发展中起重要作用。 。

7、国内外研究 证实， bFGF 反义寡核苷酸可以在体外抑制胶质瘤细胞的增殖， 但该技术也存在转染效率低， 作用时间短的不足， 使其抑瘤作用受到限制， 另外， 人工合成寡核苷酸的费用昂贵， 也使该 技术的应用遇到技术困难。 0003 近年的研究发现， 一些小的双链 RNA(double-stranded RNA， dsRNA) 可以高效、 特 异地促使体内特定基因 mRNA 降解， 诱使细胞出现特定基因缺失的表型， 这种技术即 RNAi。 在 RNAi 作用的起始阶段中外源性或内源性的双链 RNA 被 Dicer 酶切割为 19 21bp 的小 分子干扰 RNA 片段 (smallinterfer。

8、ing RNAs， siRNAs) ； 随后 siRNA 与核酶复合物结合后形 成RNA诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex， RISC) ； RISC激活后通过碱基配 对定位到同源 mRNA 转录本上并切割 mRNA， 从而部分或完全抑制目的基因的表达。另一方 面， 细胞在 RNA 依赖性 RNA 聚合酶作用下， 可以 siRNA 为引物、 以 mRNA 为模板， 合成出 mRNA 的互补链， 从而使 mRNA 也变成了 dsRNA， 然后在 Dicer 酶的作用下再次被裂解成 siRNA。这 些新生成的 siRNA 也具有诱发 RNAi 的作用， 通过。

9、这个链式反应， 细胞内 . 的 siRNA 大大增 加， 显著增加了对基因表达的抑制。 0004 从 RNAi 的作用机制中可见， 这种基因表达调控方法属于转录后的调节并具有明 显优势 ： RNAi 基因抑制效果确切， 应用微量的 siRNA 即可使其编码致病基因产物的含量下 降 90以上、 甚至可以达到基因敲除的效果 ； 其次， RNAi 抑制具有严格的序列特异性， 治 疗的针对性强， 因而应用此项技术能够同时抑制同一基因的多个靶点或多个不同基因而不 致相互干扰 ； 同时， RNAi 的作用具有级联式放大效应和高穿透性更适合恶性肿瘤的实验研 究 ； 此外， RNAi 序列识别的特异性即或对由。

10、野生型点突变形成的癌基因也能够产生准确有 效的封闭效果而对野生型基因没有影响。在对多种肿瘤细胞系实验中也证实 ： 肿瘤细胞中 均存在着 RNAi 的机制， 化学合成、 质粒 / 病毒或其他方式介导的 RNAi 可以有效地抑制内源 性 RNA 的表达。 说 明 书 CN 101575602 B2/10 页 4 发明内容 0005 本发明就是为了解决胶质瘤等肿瘤基因治疗问题， 以 RNA 干扰机制为基础， 通过 人工合成或表达质粒序列转录形成的 bFGF 小双链 RNA(siRNA) 可以靶向作用于 bFGF 基因 的 mRNA， 从而阻断其翻译过程， 达到使 bFGF 基因表达降低的结果， 而提。

11、供一种抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 序列和表达载体及其应用。 0006 本发明以 RNA 干扰技术为基础， 从 GenBank 中获得 bFGFmRNA 的全长序列， 根据 siRNA 靶序列选择的基本原则， 针对 bFGF 基因设计了 4 条长度为 19 个核苷酸的 siRNA( 见 表 1)( 由上海吉玛公司合成 )。通过一系列体外实验证实 ( 实施例 1)， 4 条 siRNA 中 bFGF-siRNA-4的抑制效果最好。 将bFGF-siRNA-4序列设计shRNA正义链和反义链， 以loop 环相连， 称为 shRNA。合成每条 shRNA 的 DNA 模板的两条单。

12、链， 两条单链 DNA 退火即为 DNA 双链模板 (shDNA Sense ： 0007 5 -CACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTG-3 Antisense ： 5 -GATCCAAAAAACGAACTGGGCAGTATAAACTCTCTTGAAGTTTATACTGCCCAGTTCGC- 3 ) ； 0008 再克隆至含 U6 启动子的 pGenesil-1 质粒中， 构建质粒表达载体 pGPU6/GFP/ Neo-shbFGF， 并进行酶切鉴定和测序。酶切结果证明构建的 shRNA 已插入载体， 经测序证明 。

13、与设计的序列相同 ( 实施例 2)。然后采用脂质体介导的方法将 pGPU6/GFP/Neo-shbFGF 转 染入高表达 bFGF 的胶质瘤细胞系 U251 中。根据绿色荧光蛋白表达情况检测转染效率， 同 时应用 MTT 法观察转染细胞的增殖活性的变化。应用 RT-PCR 法检测转染细胞 mRNA 表达的 变化。用 Annexin V-FITC/PI 双色标记的流式细胞仪法检测转染细胞的凋亡状态。 0009 因此， 本发明提供一种抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 序列， 其具有特异性 抑制肿瘤细胞的作用， 其碱基序列及作用部位如下 ： 0010 5 -CGAACUGGGCAGUA。

14、UAAACdtdt-3 0011 5 -GUUUAUACUGCCCAGUUCGdtdt-3 0012 作用于人 bFGFmRNA 的第 857 至 868 位。 0013 所述抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 序列， 其是采用合成的方式形成 3端 有 2-4 个 dt 修饰的 siRNA。 0014 本发明提供了一种抑制人bFGF基因表达和增殖的siRNA表达载体， 其具有特异性 抑制人 bFGF 基因表达， 特异性抑制人肿瘤细胞的作用。 0015 所述抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 s iRNA 表达载体， 其 DNA 序列中真核质粒载 体是 pGenesil-1， 或 p。

15、cDNA3.0， 或 pcDNA3.1， 或 pRK5， 或 pLuescript SK。 0016 所述抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 表达载体， 该表达载体是腺病毒， 或腺 相关病毒。 0017 本发明提供了一种抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 序列在制备抑制肿瘤药 物中的应用。 0018 本发明提供了一种抑制人 bFGF 基因表达和增殖的 siRNA 表达载体在制备抑制肿 瘤药物中的应用。 0019 结果表明 ： pGPU6/GFP/Neo-shbFGF 可通过脂质体介导作用成功转染入胶质瘤细 说 明 书 CN 101575602 B3/10 页 5 胞内。。

16、转染 pGPU6/GFP/Neo-shbFGF 后的细胞代谢受抑制， 细胞生长减慢。MTT 吸收值在转 染后 48 小时和 72 小时下降， 与正常对照组和阴性对照组相比都具有统计学意义。RT-PCR 结果显示 ： 转染了不同浓度 pGPU6/GFP/Neo-shbFGF 的细胞 mRNA 表达均受抑制。流式细胞 分析实验表明 ： bFGF-siRNA 组在 24 小时和 48 小时早期凋亡与晚期凋亡都较正常对照组和 阴性对照组明显增多。 0020 这样， 本发明设计出针对 bFGF 的 siRNA 和其质粒表达载体， 能够有效抑制 bFGF 的 基因表达， 能有效抑制肿瘤细胞的增殖活性， 还。

17、可诱导细胞凋亡。 0021 本发明提供的 bFGF-siRNA 及其质粒表达载体可以特异性、 高效地抑制人 bFGF 基 因表达， 从而达到抑制肿瘤发生和生长的目的。该 siRNA 及其质粒表达载体可用于制备高 效、 快速、 特异性强的抗肿瘤药物。 附图说明 0022 图 1A 是 bFGF-siRNA 转染 U251 细胞后 48 小时 PCR 扩增 bFGF 基因电泳图 ； 0023 图 1B 是 bFGF-siRNA 转染 U251 细胞后 48 小时 PCR 扩增 -actin 基因电泳图 ； 0024 图 2A 是 bFGF-siRNA 转染 U251 细胞后 72 小时 PCR 扩。

18、增 bFGF 基因电泳图 ； 0025 图 2B 是 bFGF-siRNA 转染 U251 细胞后 72 小时 PCR 扩增 -actin 基因电泳图 ； 0026 图 3A 是正常对照组转染 U251 细胞 48 小时后 bFGF 的表达 (200) ； 0027 图 3B 是 siRNA-4 组转染 U251 细胞 48 小时后 bFGF 的表达 (200) ； 0028 图 4 是质粒重组载体的酶切鉴定 ； 0029 图 5A 是 siRNA-4 转染 U251 细胞后 24 小时绿色荧光蛋白表达情况 ； 0030 图 5B 是 siRNA-4 转染 U251 细胞后 48 小时绿色荧光。

19、蛋白表达情况 ； 0031 图 6 是 bFGF-siRNA 转染后各时间点 MTT 吸收值 ； 0032 图 7A 是 48 小时实验组 Annexin-V/PI 双染 bFGF-siRNA 转染后流式测定细胞凋亡 情况 ； 0033 图 7B 是 48 小时阴性对照组 Annexin-V/PI 双染 bFGF-siRNA 转染后流式测定细胞 凋亡情况 ； 0034 图 8 是 pGPU6/GFP/Neo 质粒载体图谱 ； 0035 图 9 是 bFGF-siRNA 碱基序列图。 0036 图中 ： 图 1A M ： Marker ； lane1 ： 正常对照组 ； lane2 ： 阴性对照。

20、组 ； lane3 ： siRNA-1 ； lane4 ： siRNA-2 ； lane5 ： siRNA-3 ； lane6 ： siRNA-4 ； 0037 图 1B 显示 M ： Marker ； lane1 ： 正常对照组 ； lane2 ： 阴性对照组 ； lane3 ： siRNA-1 ； lane4 ： siRNA-2 ； lane5 ： siRNA-3 ； lane6 ： siRNA-4 ； 0038 图 2A 显示 M ： Marker ； lane1 ： 正常对照组 ； lane2 ： 阴性对照组 ； lane3 ： siRNA-1 ； lane4 ： siRNA-2 ； 。

21、lane5 ： siRNA-3 ； lane6 ： siRNA-4 ； 0039 图 2B 显示 M ： Marker ； lane1 ： 正常对照组 ； lane2 ： 阴性对照组 ； lane3 ： siRNA-1 ； lane4 ： siRNA-2 ； lane5 ： siRNA-3 ； lane6 ： siRNA-4 ； 0040 图 4 中显示 M ： Lamda/Eco130I ； 1-6 ： EcoR I 酶切 ； 8-13 ： BamH I 酶切。 说 明 书 CN 101575602 B4/10 页 6 具体实施方式 0041 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。 00。

22、42 实施例一 ： 干扰人 bFGF 基因表达的 siRNA 序列设计和筛选 0043 1.siRNA 序列设计 0044 利用 NCBI Genbank 检索 bFGFmRNA 的全长序列， 参照 siRNA 设计原则， 并运用 RNA structure 软件模拟靶 mRNA 的二级结构， 尽量避免自身结合的茎区， 选择配对区域较 少的序列， 如线区和环区。筛选出 4 个 19 个核苷酸的序列， 并将它们带入 BLAST 基因组 数据库进行比对， 排除了和其他编码序列 /EST 同源。并将其分别命名为 bFGF-siRNA-1、 bFGF-siRNA-2、 bFGF-siRNA-3、 bF。

23、GF-siRNA-4( 见表 1)( 由上海吉玛公司合成 )。参见图 9。 0045 表 1 干扰人 bFGF 基因表达的 siRNA 序列 0046 0047 2. 筛选出抑制效果最好的 siRNA 序列 0048 2.1 材料与方法 0049 2.1.1 转染 ： 根据 LipofectaminTM2000 说明书的实验步骤， 利用脂质体将 siRNA 转染于 U251 细胞中。实验分为六组， 分别为 siRNA-1、 siRNA-2、 siRNA-3 和 siRNA-4、 阴性 对照 siRNA 和正常对照组。siRNA 转染的终浓度为 4g/L。 0050 2.1.2 采用 RT-PC。

24、R 方法检测 bFGF mRNA 表达水平 ： 采用 TRIZOL 试剂提取细胞总 RNA， -70保存， 备用。细胞转染后48小时和72小时， 提取总RNA并定量， 各实验组取同等量 的 RNA 反转录为 cDNA， 然后 PCR 扩增 bFGF 基因及 -actin 基因， bFGF 引物为 ： 上游序列为 0051 5 -CACCATGGCAGCCGGCAGCATCA-3， 下游序列为 0052 5 -TCAGCTCTTAGCAGACATTGG-3 ， 扩 增 的 产 物 大 小 为 485bp。 -actin 引 物 为 ：上 游 序 列 为 5 -CCTCGCCTTTGCCGATC-。

25、3 ，下 游 序 列 为 5 -GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3， 扩增产物长度为 626bp( 引物由北京赛百盛合 成 )。PCR 反应体系为 20l， 包括 CDNA 5l， 10Buffer 2l， 25mmol/L MgCl21.2l， 2.5mmol/L dNTP 2l， Taq DNA 聚合酶 0.2l， 上下游引物 (5mol/L) 各 1l， 三蒸水加 至 20l 混均。扩增反应由 DNA thermal cycler(Geneam PCR System 2400) 完成， bFGF 的扩增条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 45s、 60退火 6。

26、0s、 72延伸 60s， 循环 32 次 ； 终延伸 72 10min。-actin 的扩增条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s、 57退火 30s、 72延伸 90s， 循环 25 次 ； 终延伸 72 10min。PCR 产物用 1TBE 电泳缓冲液的 2 说 明 书 CN 101575602 B5/10 页 7 (w/v) 琼脂糖凝胶 ( 含 0.5g/ml 的溴化乙锭 ) 电泳。运用 Gel-pro Analyzer version 4.5 软件分析电泳结果， 各基因条带的含量以 IOD 值来表示， IOD( 峰面积 ) OD( 光密度 值 )PIX( 面积 )， 。

27、根据 bFGF 基因与 -actin 基因 PCR 扩增产物 IOD 的比值估算目的基因 的相对含量。 0053 2.1.3免疫组化检测bFGF的蛋白表达 ： 将对数生长期U251细胞以2.0105/mL的 密度接种于载玻片上， 接种 24h 后， 转染 siRNA。转染后 48 小时按照免疫组化染色 ABC 法按 说明书操作步骤进行， 进行免疫组化染色。染色强度与阳性细胞百分比的乘积即为免疫组 化的结果。 0054 2.1.4MTT 法测定细胞增殖活性 ： 选用对数生长期的 U251 细胞， 以 5104/ml 的细 胞密度接种于 96 孔板中， 实验组、 脂质体组和正常对照组在接种 24h。

28、 后， 转染并继续培养。 在培养 24、 48、 72 小时后， 进行 MTT 检测， ， 酶标仪测定 550nm 波长下的 OD 值。 0055 2.1.5Annexin V-FITC 法检测细胞凋亡 ： 将对数生长期 U251 细胞按 4105/ml 的 量接种于 6 孔平底细胞培养板， 24h 后， 进行转染， siRNA 每种处理重复三次。转染 48h 和 72h后， 收集细胞， 并按常规处理细胞。 加入5lAnnexin V-FITC和/或5l PI， 混匀， 4 避光孵育 15 分钟， 1 小时内用流式细胞仪 (BD 公司 ) 测定。 0056 3. 结果 0057 3.1RT-P。

29、CR检测siRNA对bFGF mRNA表达的抑制 ： 由电泳图可看出48小时和72小 时正常对照组、 阴性对照组以及 siRNA 各组的 bFGF mRNA 表达量不同， 见图 1 和图 2。图像 扫描分析结果， 见表 2。 0058 表 2bFGF RT-PCR 产物琼脂糖电泳图像扫描分析结果 0059 0060 3.2 免疫组织化学检测 siRNA 对 bFGF 蛋白表达的抑制情况 ： 检测转染后 48 小时 bFGF 在 U251 细胞中的蛋白表达情况， 见图 3。从图 3A 中可见 bFGF 蛋白表达阳性胞浆呈棕 色， bFGF-siRNA-4组(图3B)蛋白表达阴性胞浆呈无色。 免疫。

30、组化评分为 ： 正常对照组和阴 性对照组均为强阳性 (+)， bFGF-siRNA-1、 bFGF-siRNA-2、 bFGF-siRNA-3 和 bFGF-siRNA-4 分别为弱阳性 (+)、 强阳性 (+)、 阴性 (-) 和阴性 (-)。 0061 3.3 不同实验组对胶质瘤细胞增殖的影响 ： 转染 48 及 72 小时后， 进行 MTT 测定。 说 明 书 CN 101575602 B6/10 页 8 三个不同时段的 MTT 吸收值见表 2。经统计处理， 在 48 及 72 小时， 实验组 MTT 吸收值与正 常对照组和阴性对照组相比， 均具有统计学意义 (P 0.05)。 0062。

31、 表 3 转染 48 和 72 小时后 MTT 吸收值 0063 0064 注 ： * 与正常对照组、 阴性对照组相比， P 0.05。 0065 3.4bFGF-siRNA 转染后对细胞凋亡的影响 ： bFGF siRNA-4 转染胶质瘤细胞 U25148 小时后， 采用流式细胞仪测定细胞的凋亡状况。正常对照组、 脂质体组及实验组 (bFGF-siRNA-4) 的早期凋亡细胞占总细胞比例平均为 0.78、 6.83、 14.85， 晚期凋亡 所占总细胞比例平均为 0.11、 1.39、 8.12。 0066 上述实验结果表明 bFGF-siRNA-4 是理想的 bFGF 小分子干扰 RNA 。

32、序列， 将其导入 肿瘤细胞能够抑制该基因的 mRNA 和蛋白的表达并能抑制肿瘤细胞的增殖活性。 0067 实施例二 ： bFGFsiRNA 质粒表达载体的构建 0068 1. 寡核苷酸的合成 ： 将实施例 1 筛选出的 bFGF-siRNA-4 序列设计 shRNA 正义链 和反义链， shRNA 模板中的 loop 结构选用了 TTCAAGAGA 以避免形成终止信号， shRNA 的转 录终止序列采用 T6 结构。正义链模板的 5 . 端添加了 CACC， 与 BbsI 酶切后形成的粘端互 补 ； 反义链模板的 5 端添加了 GATC， 与 BamHI 酶切后形成的粘端互补 ； 如果 siR。

33、NA 的第一 个碱基不是 G， 则在 CACC 后补加一个 G。 0069 ShDNA sequence ： 0070 Sense ： 0071 CACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAGTTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTG 0072 Antisense ： 0073 GATCCAAAAAACGAACTGGGCAGTATAAACTCTCTTGAAGTTTATACTGCCCAGTTCGC 0074 TRANSCRIPTS 0075 GCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGA GTTTATACTGCCCAGTTCGTT 0076 2.shRN。

34、A 模板的退火 ： 将 DNA oligo 分别用 TE(pH8.0) 溶解， 浓度为 100uM。取相 应的正义链和反义链 oligo 溶液， 按照如下配比配置退火反应体系。 0077 说 明 书 CN 101575602 B7/10 页 9 0078 在 PCR 仪上按照如下程序进行退火处理 ： 95C 5min ； (95-n)C20sec， n 为当前循环 数， 共 70 个循环。退火处理后得到浓度为 10M 的 shRNA 模板。将所得模板溶液稀释 500 倍， 终浓度为 20nM， 用于连接反应。 0079 3.pGPU6/GFP/Neo载体的线性化 ： 取2ug pGPU6/GF。

35、P/Neo载体(图8)， 按照如下体 系进行酶切处理 ： 0080 0081 37C 酶 切 1 小 时，琼 脂 糖 电 泳，使 用 Agarose Gel DNA Purification KitVer2.0(TaKaRa) 回收， 电泳检测估算浓度， 稀释浓度至 50ng/ul。 0082 4.pGPU6/GFP/Neo-shbFGF 质粒表达载体的构建 0083 4.1 按照如下体系进行载体的连接反应 ： 0084 0085 22 C 1hr， transform to JM 109 competent cells。 0086 4.2 挑取单菌落， 接种到含 50ug/ml Kanamy。

36、cin 的 LB 培养集中。 0087 4.3 使用碱裂解法抽提质粒， 所得质粒用 BamH I， EcoR I 分别酶切鉴定 ( 图 4)。 阳性重组载体应该可以被 BamH I 切开， 而不能被 EcoR I 切开。 0088 酶切结果表明， 所有质粒表达载体均为阳性重组载体， 选择克隆 shbFGF-a， 进行测 序鉴定。测序结果如下 ： 0089 shbFGF-a 序列正确。 0090 GGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAG 0091 AGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATAT。

37、TAGTACAAAATACGTG 0092 ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAA 0093 TGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATA 0094 TCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGAACTGGGCAGTATAAACTTCAAGAGAG 0095 TTTATACTGCCCAGTTCGTTTTTTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCG 说 明 书 CN 101575602 B8/10 页 10 0096 CGG。

38、TGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGTTAAGATA 0097 CATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTAT 0098 TTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAAC 0099 AAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGT 0100 GGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGA 0101。

39、 TCAGTTATCTAGATCCGGTGGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGCC 0102 GAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCT 0103 TCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGG 0104 GCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCG 0105 AGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATG 0106 。

40、CCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTGTAGTTGTACTC 0107 CAGCTTGTGCCCCAGGATGTGCCGTCCTCCTTGAGTCGATGCCCTTCAGCTCGA 0108 TGCGTCACAGGGTGTCGCCCTCGACTCACTCGGCGCGGTCTGTAGTGCGTCGTC 0109 TGGAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGCATGGCGGACCTGAGAGT 0110 CCTGCTGCTCATGTGGTCGGTAGCCGCCTGAAGACAT 0111 实施例三 ： bFGF-siRNA。

41、 质粒表达载体抑制胶质瘤的体外实验研究 0112 将实施例 2 构建的 bFGF-siRNA 质粒表达载体 pGPU6/GFP/Neo-shbFGF 转染胶质瘤 的 U251 细胞后进行如下实验 ： ( 转染、 RT-PCR、 免疫组化、 MTTAnnexin V-FITC 等实验方法 同实施例 1 略 ) 0113 1.bFGFsiRNA 质粒表达载体转染效率的测定 ： 转染后 24 小时及 48 小时， 观察细 胞荧光蛋白表达情况， 结果实验组中脂质体用量为 10l， 质粒用量为 4g 时， 转染效率最 高。( 见图 5) 0114 2.bFGFsiRNA质粒表达载体转染后细胞增殖活性的测。

42、定 ： 转染24小时、 48小时、 72 小时、 96 小时的 MTT 吸收值， 结果 ( 见表 4， 图 6) ： 0115 表 4pGPU6/GFP/Neo-shRNA 转染后各时间点 MTT 吸收值 0116 0117 注 ： a ： 与正常对照组相比， P 0.05， 具有显著性差异 ； 0118 b ： 与阴性对照组相比， P 0.05， 具有显著性差异。 0119 3.bFGFsiRNA 质粒表达载体转染后 bFGF 的 mRNA 表达 ： 由表 5 可见， 转染后 24 小 时和 48 小时， 正常对照组和阴性对照组 IODbFGF/IOD-actin值较大， 且数值相近， si。

43、RNA 组的 IODbFGF/IOD-actin值较小。 结果表明阴性对照质粒对bFGF基因mRNA的表达影响很小， siRNA 组抑制作用显著增强。 0120 表 5pGPU6/GFP/Neo-shRNA 转染后 24 小时和 48 小时 bFGF mRNA 表达的 IOD 值 0121 说 明 书 CN 101575602 B9/10 页 11 0122 注 ： 阴性对照组 ： 脂质体 / 阴性质粒为 10ul/4ug ； siRNA 组 ： 脂质体 /bFGF 质粒 为 10ul/4ug ； 0123 4.bFGFsiRNA 质粒表达载体转染后细胞凋亡的测定 ： 转染 24 小时和 48。

44、 小时后， 用 流式细胞仪测定细胞凋亡， Annexin-V/PI 双染法。结果显示， 转染后 24 小时， 正常对照组、 阴性对照组、 实验组的早期凋亡比例分别为 0.31、 0.26、 0.23， 晚期凋亡比例分别为 6.96、 3.01、 3.03， 表明质粒转染后 24 小时对细胞凋亡的影响不大 ； 转染后 48 小时， 正常对照组、 阴性对照组、 实验组的早期凋亡比例分别为 0.70、 4.32、 8.17( 见图 7)， 晚期凋亡比例分别 为 4.64、 4.05、 6.54， 表明实验组质粒转染后 48 小时可诱导细胞凋亡， 其中诱导早期凋亡效 果较显著， 对晚期凋亡也有一定的诱。

45、导作用。 0124 SEQUENCE LISTING 0125 天津市第一中心医院 0126 抑制人 bFGF 基因表达增殖的 siRNA 序列及其表达载体和应用 0127 1 0128 1 0129 PatentIn version 3.1 0130 1 0131 38 0132 RNA 0133 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 0134 0135 RNA 0136 (1).(38) 0137 0138 1 0139 cgaacugggc aguauaaacg uuuauacugc ccaguucg 38 0140 2 0141。

46、 1128 0142 DNA 0143 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 0144 0145 2 0146 (1).(1128) 说 明 书 CN 101575602 B10/10 页 12 0147 0148 1 0149 gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg ttagagagat 60 0150 aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa 120 0151 gtaataa。

47、ttt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat 180 0152 gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt ggaaaggacg 240 0153 aaacaccgcg aactgggcag tataaacttc aagagagttt atactgccca gttcgttttt 300 0154 tggatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag ctccagcttt tgttcccttt 360 0155 agtgagg。

48、gtt aattgcgcgt taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 420 0156 gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 480 0157 tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca 540 0158 gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtatggctga 600 0159 ttatgat。

49、cag ttatctagat ccggtggatc tgagtccgga cttgtacagc tcgtccatgc 660 0160 cgagagtgat cccggcggcg gtcacgaact ccagcaggac catgtgatcg cgcttctcgt 720 0161 tggggtcttt gctcagggcg gactgggtgc tcaggtagtg gttgtcgggc agcagcacgg 780 0162 ggccgtcgcc gatgggggtg ttctgctggt agtggtcggc gagctgcacg ctgccgtcct 840 0163 cgatgttgtg gcggatcttg aagttcacct tgatgccgtt cttctgcttg tcggccatga 900 0164 tatagacgtt gtggctgtgt agttgtactc cagcttgtgc cccaggatgt gccgtcctcc 960 0165 ttgagtcgat gcccttcagc tcgatgcgtc acagggtgtc gccctcgact cactcggcgc 1020 0166 。