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一种微生物生产葡萄糖胺的方法
    【技术领域】

    本发明涉及一种以低成本的新颖培养基培养微生物生产葡萄糖胺的方法。

    背景技术

    葡萄糖胺为关节软骨的组成成份之一，可提供关节组织的营养，增加滑液恢复润滑功能，促进退化关节再生，进而有效减轻骨头磨擦产生的痛苦，阻止关节炎症状的恶化。人体可自行合成葡萄糖胺，但随年龄增加，人体内合成葡萄糖胺的速度不及分解葡萄糖胺的速度，于是容易产生体内及关节缺乏葡萄糖胺的现象，并影响关节内细胞的代谢。

    葡萄糖胺的特点为(1)刺激软骨母细胞的新生，促进其新陈代谢，供给骨骼营养，使发炎减少，疼痛消失。(2)保护软骨细胞不受药物、外力的伤害，防止骨关节的退化。(3)增加滑液量及其黏性，促进关节润滑作用，改善骨关节机能。(4)改善腰酸背痛效果。且在欧洲，葡萄糖胺业已被广泛用于治疗骨关节炎；人体经食用葡萄糖胺后，可将它快速吸收并运送到体内各组织加以利用经大鼠急性毒性测试以及微生物变异原性试验证实，葡萄糖胺为一安全无毒的健康食品，及早补充葡萄糖胺更可达到预防关节炎的效果。

    葡萄糖胺有来自天然海中虾蟹甲壳几丁质的提炼出和化学合成的来源，在目前工业上生产葡萄糖胺仍是使用虾蟹壳于盐酸溶液中进行水解，生产葡萄糖胺(glucosamine)的方法是以酸或酵素水解几丁质而来，但不同来源的虾蟹壳是否会影响葡萄糖胺的纯度，以及当被污染的虾蟹壳其制造出的葡萄糖胺是否不具有毒性，再者，进行虾壳、蟹壳水解作用之前，需费工冲洗该虾壳、蟹壳以避免恶臭；而葡萄糖胺也并非水解虾蟹壳作用中唯一的产物，仍须进行纯化以分离葡萄糖胺与其它副产物。

    葡萄糖胺有来自天然海中虾蟹甲壳几丁质的提炼出和化学合成的来源，在目前工业上生产葡萄糖胺仍是使用虾蟹壳于盐酸溶液中进行水解，但不同来源的虾蟹壳是否会影响葡萄糖胺的纯度，以及当被污染的虾蟹壳其制造出的葡萄糖胺是否不具有毒性，况且水解反应前须将虾蟹壳进行前处理冲洗以免发臭，为了减少前处理繁琐的步骤以及减少人体服用后的过敏副作用后遗症考虑，本发明选择利用微生物生产方式代替传统的化学法。

    除了上述水解方法外，目前亦有两种使用微生物来生产葡萄糖胺的方法，其一为利用真菌的胞内或胞外酵素来分解几丁质；另一为将微生物的初级代谢培养基转换为二级代谢培养基，以该培养基生产葡萄糖胺。

    根据Deng等人于2005年的研究指出，目前也有使用基因转殖技术制造可生产葡萄糖胺的大肠杆菌(Escherichia coli)，由于该调节机制太过复杂，使得大肠杆菌培养基中葡萄糖胺的侦测量极低，每公升约为几毫克；以基因转殖技术制得的大肠杆菌，可以使胺基醣的产量增加，该基因转殖策略是启动与葡萄糖胺运转及分解代谢(catabolism)有关的基因，以及使葡萄糖胺合成酶(glucosaminesynthase)的基因过度表现(overexpression)；该方法可增加15倍葡萄糖胺的产量，但其浓度(titer)仍维持在毫克的程度；glucosamine synthase的回馈抑制(Feedbackinhibition)被确认为该途径关键性的因素，酵素的筛选可增加葡萄糖胺的生产，并可使其浓度增加至数克；然而，在寄主细胞内的葡萄糖胺的快速降解、葡萄糖胺的抑制效果以及其降解产物，皆会阻碍葡萄糖胺浓度的增加[Deng，Ming‑de，K.D.Severson，D.A.Grund，S.L.Wassink，R.P.Burlingame，A.Berry，J.A.Running，C.A.Kunesh，L.Song，T.A.Jerrell and R.A.Rosson，From ConcepttoProcess：Metabolic Engineering for Production of Glucosamine andN‑Acetylglucosamine，Metabolic Engineering，7(3)，201‑214(2005)]。

    现有技术及文献中，针对以微生物二级代谢产物来生产葡萄糖胺的研究并不多也不完整，只有下列少数几种真菌(fungi)被提到其二级代谢产物中含有葡萄糖胺：

    1.红曲菌属(Monasus)：苏远志等人于1970年发表的文献中指出，红曲菌(Monascus anka)的二级代谢物包含了γ‑aminobutyric acid(GABA)、monacolinK、γ‑aminobutyric acid以及葡萄糖胺(glucosamine)[苏远志，陈文亮，方鸿源，翁浩庆，王文祥，红曲菌(Monascus anka)的菌学研究，中国农业化学会志，8，45‑58(1970)]；然而，绝大多数的注意力都集中在monacolin K以及GABA的含量上，鲜少人注意到红曲菌属含有葡萄糖胺的现象；Hsieh等人在2007年的研究指出，在培养基为20g/L Rice bran(米糠)、25g/L B‑grade white crystalsugar(二级白砂糖)、15g/L Ammonium chloride(NH₄Cl)可使红曲菌属菌株Monascus pilosus产生0.72g/L葡萄糖胺，其最佳化条件为：pH 5，30℃[Hsieh，J.W.，H.S.Wu，Y.H.Wei，and S.S.Wang，Determination and kinetics of producingglucosamine using fungi，Biotechnol.Prog.，23，1009‑1016(2007)]。

    2.曲菌属(Aspergillus)：曲菌属为一群广泛存在自然界的丝状真菌，许多曲菌属的真菌会产生对人体有害的二级代谢产物，其中最著名的为Aspergillusflavus及Aspergillus parasiticus所产生的黄曲毒素(Aflatoxin)，黄曲毒素被认为是一种具有致癌效果的物质；然而，Hsieh等人在2007年的研究指出，在培养基为可使曲菌属菌株Aspergillus sp.产生3.43g/L葡萄糖胺，其最佳化条件为：pH 7，30℃[Hsieh，J.W.，H.S.Wu，Y.H.Wei，and S.S.Wang，Determination andkinetics of producing glucosamine using fungi，Biotechnol.Prog.，23，1009‑1016(2007)]。

    由此可知，上述现有生产葡萄糖胺的方法仍有诸多缺失，然而以微生物法进行葡萄糖胺的产量无法大幅提升且培养基成本无法降低，实非一良好的设计，而亟待加以改良。

    【发明内容】

    本发明的目的即在于提供一种低成本的培养基培养微生物生产葡萄糖胺的方法，是开发一低成本的新颖培养基用以培养微生物，经发酵以生产葡萄糖胺的生产方法，以取代现有培养基，并降低培养基的成本。

    本发明的次一目的是在于提供一种低成本的培养基培养微生物生产葡萄糖胺的方法，先以摇瓶培养方式，进行生产葡萄糖胺的产量最佳化研究，再推出发酵模式；进而以发酵槽发酵生产葡萄糖胺，以提升微生物生产葡萄糖胺的产量。

    可达成上述发明目的的一种低成本的培养基培养微生物生产葡萄糖胺的方法，是以台糖、黄豆、米糠作为培养基以培养微生物生产葡萄糖胺的方法，是于一适当条件下发酵培养一适用的微生物，以使其生产葡萄糖胺。

    其中该适用的微生物为可产生葡萄糖胺的微生物，包含但不限于红曲菌(Monascus pilosus)以及曲菌属菌(Aspergillus sp.)。

    其中红曲菌(Monascus pilosus)为一常用菌种易于市售取得，也可购于财团法人食品工业发展研究所(台湾，新竹)，如寄存编号为：BCRC 31527、或可于美国菌种保存中心ATCC取得，如寄存编号为：ATCC 22080；其中曲菌属菌(Aspergillus sp.)也为一常用菌种可市售取得，也可购于财团法人食品工业发展研究所(台湾，新竹)，如寄存编号为：BCRC 31742、或菲律宾大学(The Universityof the Philippines Concert Chorus，UPCC)，如寄存编号为：UPCC 3868。上述菌种的来源及种类并非用以限制本发明的可实施方式。在本发明中选用Monascuspilosus BCRC 31527及Aspergillus sp.BCRC 31742培养在本发明提供的新颖低成本培养基，以生产葡萄糖胺。

    该微生物Monascus pilosus BCRC 31527置于RBA液体培养基中发酵培养；该RBA液体培养基包含25g/L Rice bran(米糠)、25g/L B‑grade white crystal sugar(二级白砂糖)以及15g/LNH₄Cl。

    该微生物Monascus pilosus BCRC 31527置于150～300rpm的搅拌速度下发酵，较佳为150～250rpm，最佳为200rpm；该微生物置于pH 4～pH 6的环境下发酵，较佳为pH 4.5～pH 5.5，最佳为pH 5；该微生物置于24℃～37℃的环境下发酵，较佳为28℃～33℃，最佳为30℃。

    该微生物Aspergillus sp.BCRC 31742分别置于WP、WS或WPS液体培养基中发酵培养；其中该WP液体培养基包含适当浓度的Superior white finegranulated sugar(高级白砂糖)、适当浓度的Peptone(蛋白胨)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；较佳WP液体培养基(WP1)包含25g/L Superior white fine granulated sugar(高级白砂糖)、20g/L Peptone(蛋白胨)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；最佳WP液体培养基(WP2)包含33.9g/L Superior white fine granulated sugar(高级白砂糖)、40.6g/L Peptone(蛋白胨)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/LCaCl₂·2H₂O；其中该WS液体培养基包含适当浓度的Superior white finegranulated sugar(高级白砂糖)、适当浓度的Soy bean meal(大豆粕)或Soy bean(大豆)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；较佳WS液体培养基(WS1)包含25g/L Superior white fine granulated sugar(高级白砂糖)、50g/L Soy bean meal(大豆粕)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；较佳WS液体培养基(WS2)包含25g/L Superior white finegranulated sugar(高级白砂糖)、20g/L Soy bean(大豆)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/LMgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；其中该WPS液体培养基包含适当浓度的Superior white fine granulated sugar(高级白砂糖)、适当浓度的Peptone(蛋白胨)、适当浓度的Soy bean(大豆)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；较佳WPS液体培养基(WPS1)包含25g/L Superior white finegranulated sugar(高级白砂糖)、10g/L Peptone(蛋白胨)、23g/L Soy bean(大豆)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/L MgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O；较佳WPS液体培养基(WPS2)包含25g/L Superior white fine granulated sugar(高级白砂糖)、40g/L Peptone(蛋白胨)、46g/L Soy bean(大豆)、0.5g/L KH₂PO₄、0.5g/LMgSO₄·7H₂O以及0.1g/L CaCl₂·2H₂O。

    该微生物Aspergillus sp.BCRC 31742置于150～300rpm的搅拌速度下发酵，较佳为150～250rpm，最佳为200rpm；该微生物置于pH 6～pH 8的环境下发酵，较佳为pH 6.5～pH 7.5，最佳为pH 7；该微生物置于24℃～37℃的环境下发酵，较佳为28℃～33℃，最佳为30℃。

    该微生物经发酵培养后，并进一步将其发酵液抽气过滤取得该微生物菌体，并将该微生物菌体经过破细胞、盐酸化反应、中和反应及过滤等步骤，以取得该微生物所生产的葡萄糖胺；该盐酸化反应为1克湿菌量与6N HCl于100℃下进行4小时盐酸化反应，以取得趋于一平稳值的葡萄糖胺浓度；而该中和反应是以NaOH将反应液中和至pH 7。

    本发明所提供的以低成本培养基培养微生物生产葡萄糖胺的方法，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点：

    1.本发明的方法所生产的葡萄糖胺产量，与前人提出的文献报告比较，皆高于文献所报导的产量。

    2.本发明所提供的生产葡萄糖胺的培养基成本，与前人提出的文献报告比较，皆较文献所报导的成本更为低廉。

    3.本发明所提供的分析方法操作简单，步骤少，比文献报告所使用的分析方法简单。

    【具体实施方式】

    本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。

    实施例1试验培养基

    1.试验菌株

    本发明是利用未经过基因转殖的微生物改变培养基来进行发酵作用，以生产葡萄糖胺的方法，所用的微生物如下：红曲菌(Monascus pilosus BCRC31527)，以及曲菌属菌(Aspergillus sp.BCRC31742)；上述二菌株皆购自财团法人食品工业发展研究所(台湾，新竹)。

    2.培养基

    依照上述二菌株不同的特性来选择其适当的培养基，以进行葡萄糖胺的生产；各菌株选用的培养基如表1所示。

    表1各菌株生产葡萄糖胺所用的培养基

    

    

    注：下述各组成成分皆于市售可得。

    RBA：Rice bran(米糠，市售)+B‑grade white crystal sugar(台糖二级白砂糖，购于TSC Taiwan)+Ammonium chloride(氯化胺，NH₄Cl，购于R.D.H，Germany)。

    WP：Superior white fine granulated sugar(高级白砂糖)+Peptone+Basic media。

    WS：Superior white fine granulated sugar+Soy bean(大豆，市售)+Basic media。

    WPS：Superior white fine granulated sugar+Peptone+Soy bean+Basic media。

    Basic media(基本培养基)：0.5g/L KH₂PO₄+0.5g/L MgSO₄·7H₂O+0.1g/L CaCl₂·2H₂O。

    WS1：其中soy bean meal是将大豆磨成粉末后，取50g/L soy bean meal添加于培养基中。

    WS2：是直接取20g/L soy bean(未做磨粉等处理)加入培养基中。

    WPS1及WPS2：是将soy bean打成粉末泡于蒸馏水中搅拌均匀，以滤布滤去大部份的豆渣，取滤液添加于培养基中，其浓度的介定则是由重量差计算所得。

    实施例2摇瓶发酵试验

    分别将实施例1所述的各菌株先以PDA(200g/L Diced potatoes(切块土豆)，20g/L Glucose(葡萄糖)，15g/L Agar(琼脂))固态培养基于30℃下，三区划线培养活化5天，再将单一菌落置入内含200ml己灭菌PDB(Potato Dextrose Broth：20g/L Diced potatoes，4g/L Glucose)液态培养基的250ml摇瓶，进行二次活化，以恒温培养箱在30℃、200rpm下培养7天。

    取各活化后的菌株接种至其适当的培养基(如表1)内，分别控制其培养基酸碱值：微生物Monascus pilosus BCRC 31527的培养基酸碱值为pH5、微生物Aspergillus sp.BCRC 31742的培养基酸碱值为pH 7，于温度30℃下，转速200rpm，培养7天，取样分析干菌重及葡萄糖胺产量：取Monascus pilosusBCRC31527的发酵液倒入250ml离心瓶中，于4℃下，以转速12,000rpm离心30min，将液体倒掉，将菌块以100℃烘干，称得干菌重(Cell dry weight)，再将其粉碎后，加入10ml 6N HCl于100℃下反应24小时，得含葡萄糖胺的液体。取Aspergillus sp.BCRC31742的发酵液，经抽气过滤后得菌块，将菌块取样以100℃烘干，称得湿/干菌重比(ratio of wet cell weight to dry cell weight)，另将湿菌经细胞破碎机破碎后，加入10ml 6N HCl于100℃下反应4小时，得含葡萄糖胺的液体。待收集得的液体冷却后加入10ml超纯水，以NaOH将反应液中和至pH 7，再以抽气过滤收集液体，取0.1ml至试管中，加入0.1ml 3，5‑二硝基氰苯(3，5‑dinitrobenzonitrile acetonitrile)溶液作为内部标准品，再加入0.1ml的40mol/m³ 1‑萘基异硫氰酸酯嘧啶(1‑naphthyl isothiocyanate pyridine)溶液，于50℃的恒温水浴反应1小时，反应后取10μL进行葡萄糖胺鉴定分析。

    以高效液相层析技术(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)进行葡萄糖胺鉴定分析，HPLC分析条件如下：

    HPLC pump：Shimadzu LC‑10AS

    侦测器：Shimadzu Model SPD‑10Avp UV‑VIS index detector

    管柱：LichroCART RP‑18(5μm)，250×4mm I.D.

    移动相：Water/Acetonitrile(87/13)

    流速：1.3ml/min

    UV侦测波长：230nm

    再依葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比，代入以葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比的葡萄糖胺盐酸盐检量线，以内插法求得葡萄糖胺的克数，换算出葡萄糖胺浓度(Glucosamine Concentration)、葡萄糖胺成分含量(Glucosamine Content)，以及对于发酵培养的碳源换算求得其产率(Yield)，并与工作天数换算求得生产率(Productivity)，结果如表2所示。

    如表2所示，本实施例所使用的二种菌株中，以Aspergillus sp.BCRC 31742在WP2培养基环境下培养，可产生的葡萄糖胺浓度最高(5.48g/L)。在WS2培养基环境下培养，可使生产葡萄糖胺培养基成本最低(0.04USD/g‑葡萄糖胺)。且，本实施例以新颖培养基环境下培养Aspergillus sp.BCRC 31742或Monascuspilosus BCRC31527，分别相较于参考文献1，本发明所提供的新颖培养基可促使Aspergillus sp.BCRC 31742或Monascus pilosus BCRC31527产生更多的葡萄糖胺，且所用的培养基成本更为低廉。

    表2文献(粗体字)与各菌株经摇瓶培养所产出的葡萄糖胺浓度、葡萄糖胺含量、产率和生产率

    

    注：RBA：Rice bran，0.4USD/Kg；B‑grade white crystal sugar，0.97USD/Kg；Ammonium chloride，55USD/Kg.

    RSA：Rice bran，0.4USD/Kg；Sucrose(蔗糖)，88.8USD/Kg；Ammonium chloride，55USD/Kg.

    WP1，WP2，WS1，WS2，WPS1，WPS2：Superior white fine granulated sugar，0.97USD/Kg；Peptone，78USD/Kg；Soy bean，1.3USD/Kg；MgSO₄·7H₂O，52USD/Kg；KH₂PO₄，39USD/Kg；CaCl₂·7H₂O，45.5USD/Kg.

    GP：Glucose，45.8USD/Kg；Peptone，78USD/Kg；MgSO₄·7H₂O，52USD/Kg；KH₂PO₄，39USD/Kg；CaCl₂·7H₂O，45.5USD/Kg.

    Mo‑31527：Monascus pilosus BCRC 31527；

    Mo：Monascus pilosus BCRC 31527(参考文献1)；

    As‑31742：Aspergillus sp.BCRC 31742；

    As：Aspergillus sp.BCRC 31742(参考文献1)。

    参考文献1：Hsieh，J.W.，H.S.Wu，Y.H.Wei，and S.S.Wang，Determination and kinetics ofproducing glucosamine using fungi，Biotechnol.Prog.，23，1009‑1016(2007)

    实施例3发酵槽发酵试验

    首先分别将实施例1所述的Aspergillus sp.BCRC 31742进行二次活化培养，方式同实施例2所述。以一批次搅拌式发酵槽进行发酵试验，将活化后的Aspergillus sp.BCRC 31742接种100ml菌液至WP1培养基的发酵槽中，工作体积为2L，其酸碱值为pH 7，于温度30℃下，转速200rpm进行发酵培养，以外加管线通入纯氧，溶氧量控制在10％，控制在摇瓶实验所得的最适化条件。

    发酵槽收槽后，经抽气过滤后得菌块，将菌块取样以100℃烘干，称得湿/干菌重比(ratio of wet cell weight to dry cell weight)，另将湿菌经细胞破碎机破碎后，加入10ml 6N HCl于100℃下反应4小时，得含葡萄糖胺的液体。待至冷却后加入10ml超纯水，以NaOH将反应液中和至pH 7，再以抽气过滤收集液体，取0.1ml至试管中，加入0.1ml 3，5‑dinitrobenzonitrile acetonitrile溶液为内部标准品，再加入0.1ml的40mol/m3 1‑naphthyl isothiocyanate pyridine溶液，于50℃的恒温水浴反应1小时，反应后取10μL进行葡萄糖胺鉴定分析；同样以HPLC进行葡萄糖胺鉴定分析，HPLC分析条件如实施例2所述。

    再依葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比，代入以葡萄糖胺盐酸盐衍生物对内部标准品波峰面积比的葡萄糖胺盐酸盐检量线，以内插法求得葡萄糖胺的克数，换算出葡萄糖胺浓度、葡萄糖胺成分含量，以及对于发酵培养的碳源换算求得其产率，并与工作天数换算求得生产力，结果如表3所示。

    表3文献(粗体字)与实施例3 Aspergillus sp.BCRC 31742经发酵槽培养所产出的葡萄糖胺浓度、葡萄糖胺含量、产率和生产力的比较

    

    

    注：

    参考文献1：Hsieh，J.W.，H.S.Wu，Y.H.Wei，and S.S.Wang，Determination and kinetics ofproducing glucosamine using fungi，Biotechnol.Prog.，23，1009‑1016(2007)

    如表3所示，将文献1上提及使用Aspergillus sp.BCRC 31742发酵以产生葡萄糖胺的条件，与本实施例所使用的条件比较；Hsieh等人于2007年以GP培养基培养曲菌属菌Aspergillus sp.以生产葡萄糖胺(葡萄糖胺浓度为2.31g/L)的结果，与本实施例所使用的培养基比较，在使用相同微生物发酵的条件下，本实施例所用的WP培养基于10％溶氧量所得的葡萄糖胺浓度(3.91g/L)，比文献报导者高。

    上列详细说明是针对本发明之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，例如：微生物培养基的变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围中。