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1、(10)申请公布号 CN 102206688 A (43)申请公布日 2011.10.05 CN 102206688 A *CN102206688A* (21)申请号 201110106809.9 (22)申请日 2011.04.27 C12P 7/64(2006.01) C12N 9/90(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 何国庆 刘佩 阮晖 周倩 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (。
2、54) 发明名称 酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚 油酸的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种酿酒酵母展示亚油酸异构 酶催化合成共轭亚油酸的方法， 将含有重组质粒 的酿酒酵母 K601， 接种到 YPG 培养基中， 诱导培 养， 收集菌体， 洗涤， 得到酿酒酵母展示亚油酸异 构酶催 ； 然后将得到的酿酒酵母展示亚油酸异构 酶加入到含有亚油酸的缓冲液中， 振荡反应。 本发 明将亚油酸异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表 面， 直接与底物亚油酸接触， 提高共轭亚油酸的转 化效率， 降低生成成本。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1。
3、 页 说明书 3 页 序列表 5 页 附图 2 页 CN 102206691 A1/1 页 2 1. 一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法， 包括 ： 将酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的 pH6.0-7.0 的缓冲液中， 振荡反 应 ； 所述的酿酒酵母展示亚油酸异构酶通过如下方法制备 ： 将携带重组质粒的酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)K601， 接种到 YPG 培养基中， 诱导培养， 离心收集菌体， 洗涤， 得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶 ； 所述的重组质粒包括原始载体 pYES2 和插入原始载体 pYES2 的目的基因， 所述目的基 因由。
4、依次连接的 Mf1 信号肽基因、 亚油酸异构酶基因、 酵母 - 凝集素 C 端锚定区基因组 成， 所述的 Mf1 信号肽基因插入到原始载体 pYES2 中 GAL1 启动子的下游。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述的亚油酸异构酶基因碱基序列如SEQ ID NO ： 1 所示。 3. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的酵母 - 凝集素 C 端锚定区基因 碱基序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述的Mf1信号肽基因碱基序列如SEQ ID NO ： 3 所示。 5. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特。
5、征在于 ： 所述的缓冲液为磷酸缓冲液。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于 ： 所述的缓冲液中亚油酸的浓度为3mg/ml。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的振荡反应的温度为 28-32。 8. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述的振荡反应时间为 6 80h。 权 利 要 求 书 CN 102206688 A CN 102206691 A1/3 页 3 酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法 技术领域 0001 本发明涉及生物工程技术领域， 具体涉及一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合 成共轭亚油酸的方法。 背景技术 0002 共轭亚。
6、油酸 (Conjugated linoleic acid， 以下简称 CLA) 是含有顺式或反式共轭 双键的十八碳二烯酸， 是必需脂肪酸亚油酸 (Linoleic acid， 以下简称 LA) 衍生而成的一 组位置和构象异构体的总称。 许多微生物能利用自身的亚油酸异构酶将亚油酸转化成共轭 亚油酸。但目前应用的亚油酸异构酶主要存在以下问题 ： 酶的重组表达方式一般是细胞内 表达和分泌表达， 细胞内表达时由于酶不能与细胞外底物接触， 从而极大地影响酶的催化 效率， 而且酶分子集聚在细胞内形成反馈抑制， 也影响表达效率 ； 分泌表达的主要缺点是表 达效率不高， 而且也不能实现完全分泌表达， 总有相当。
7、一部分表达产物滞留于细胞内， 从而 也不能实现酶与细胞外底物的完全接触。这两种表达方式都导致酶的催化效率不高。 发明内容 0003 本发明提供一种用酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法， 将亚 油酸异构酶展示在细胞壁上， 可以直接接触到底物， 进而提高共轭亚油酸的转化效率。 0004 一种酿酒酵母展示亚油酸异构酶催化合成共轭亚油酸的方法， 包括 ： 0005 将酿酒酵母展示亚油酸异构酶加入到含有亚油酸的缓冲液中， 振荡反应 ； 0006 所述的酿酒酵母展示亚油酸异构酶通过如下方法制备 ： 0007 将携带重组质粒的酿酒酵母 K601， 接种到 YPG 培养基中， 诱导培养， 离心收。
8、集菌 体， 洗涤， 得到酿酒酵母展示亚油酸异构酶 ； 0008 所述的重组质粒包括原始载体 pYES2 和插入原始载体 pYES2 的目的基因， 所述目 的基因由依次连接的 Mf1 信号肽基因、 亚油酸异构酶基因、 酿酒酵母 - 凝集素基因 C 端 锚定区基因组成， 所述的 Mf1 信号肽基因插入到原始载体 pYES2 中 GAL1 启动子的下游。 0009 所述的亚油酸异构酶基因 lai 来源于植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum) lp15-2-1， 其保藏号为 CGMCC No.3782， 该菌株的分离、 纯化及鉴定方法已在中国专利申请 201010251108.X。
9、 中公开， GenBank 号为 HQ831447， 碱基序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； Mf1 酵 母信号肽基因来自酿酒酵母， GenBank 号为 YPL187， 碱基序列如 SEQ ID NO ： 3 ； 酵母 - 凝 集素 C 端锚定区基因 sag 的 GenBank 号为 YJR004C， 碱基序列如 SEQ IDNO ： 2 所示。 0010 所述的酿酒酵母 K601 为标准试验菌株， 它可以商业购买或从保藏机构获得。 0011 所述的缓冲液为磷酸缓冲液。 0012 所述的缓冲液中亚油酸的浓度为 3mg/ml。 0013 所述的振荡反应温度为 28 32。 0014 。
10、所述的振荡反应时间为 6 80h。 0015 本发明通过将亚油酸异构酶基因插入到载体 pYES2 中， 导入到酿酒酵母 K601 中， 说 明 书 CN 102206688 A CN 102206691 A2/3 页 4 携带重组质粒的酿酒酵母K601经诱导培养后， 亚油酸异构酶通过Mf1酵母信号肽分泌到 细胞外， 并利用亚油酸异构酶下游的凝集素锚定蛋白锚定在酿酒酵母细胞壁上， 使亚油酸 异构酶展示表达在酿酒酵母细胞外表面， 直接与底物亚油酸接触， 提高共轭亚油酸的转化 效率， 降低生成成本。 附图说明 0016 图 1 是酵母细胞壁展示表达载体的结构示意图。 0017 图 2 是 PCR 鉴。
11、定酵母转化子的电泳结果图。 0018 图 3 是酵母细胞表面展示亚油酸异构酶酶活测定图。 0019 图 4 酵母细胞表面展示亚油酸异构酶转化合成 CLA 的气相色谱图 ； A ： 阴性对照菌 株 ( 转有空载体 pYES2) 转化产物的气相色谱图 ； B ： 重组酵母菌菌株转化产物的气相色谱 图 ； C ： LA 和 CLA 甲酯标样的气相色谱图， 其中 1 为 LA ； 2 为 c9t11-CLA ； 3 为 t10c12-CLA。 具体实施方式 0020 实施例 1 酵母展示重组质粒的构建 0021 分别以植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)lp15-2-1 和酿。
12、酒酵母 K601 基因 组 DNA 为模板， 利用表 1 中的引物， 进行 PCR 扩增， PCR 反应体系为 ： 10PCR buffer( 含 Mg2+)5L， dNTPs(25mM)4L， 引物 1 和引物 2(10M) 各 1L， 基因组 DNA 1g， ExTaqDNA 聚合酶 1U， 加无菌超纯水至终体积 50L ； PCR 反应条件为 ： 94预变性 5min ； 94变性 30s， 48退火 30s( 基因 mf1)/50退火 40s( 亚油酸异构酶基因 lai 和酵母 - 凝集素 C 端含 321aa 的锚定区基因 sag)， 72延伸 1min， 反应 30 个循环 ； 7。
13、2延伸 5min。得到信 号肽基因 mf1(SEQ ID NO ： 3)、 亚油酸异构酶基因 lai(SEQ ID NO ： 1) 和酵母 - 凝集素 C 端含 321 氨基酸的锚定区基因 sag(SEQ ID NO ： 2)。 0022 表 1 所用引物序列 0023 0024 将 PCR 产物与克隆载体 pMD 18-T simple(pMDS) 连接， 转化大肠杆菌 DH5 感 受态细胞， 得到质粒 pMDS-lai、 pMDS-mf1 和 pMDS-sag。首先用 HindIII 和 EcoR I 双 酶切质粒 pMDS-mf1 和空载体 pYES2， 回收基因片段 mf1 和载体 p。
14、YES2 并连接， 构建 pYES2-mf1(pYM) 载体 ； 再用 EcoR I 和 Xho I 双酶切质粒 pMDS-lai 和 pYM， 回收 lai 基 因片段并将之插入载体 pYM 中， 构建 pYES2-mf1-lai(pYML) 载体 ； 最后用 Xho I 和 XbaI 双酶切质粒 pMDS-sag 和 pYML， 回收基因片段 sag 和载体 pYML 并连接， 构建酵母展示表 达载体 pYES2-mf1-lai-sag(pYMLS)。结果如图 1 所示， 从 N 端到 C 端为 GAL1 启动子 +mf1+lai+sag。 0025 实施例 2 重组酵母的获得及筛选 00。
15、26 SD( 尿嘧啶缺失型 ) 固体筛选培养基 (g/L) ： SD+2琼脂粉 说 明 书 CN 102206688 A CN 102206691 A3/3 页 5 0027 SD 培养基成分 (g/L) ： 16.8g 酵母氮源 ； 0.77g 尿嘧啶缺失型氨基酸 ； 2g 半乳糖。 0028 载体pYES2上有URA基因， 重组酵母菌能够在缺失尿嘧啶的培养基上生长， 因此选 用 SD 固体筛选培养基筛选转化子。 0029 将上述重组质粒通过电击法转化到酿酒酵母细胞K601中， 用Bio-Rad的基因电击 转化仪 (BTX)， 将电击杯转入电击座中， 进行电击转化， 条件为 ： 电压为 1.。
16、5KV ； 电容 25F ； 电阻200 ； 电击时间5s ； 然后在SD固体筛选培养基上倒置培养， 30、 培养48h， 筛选得到 转化子 ； 最后对获得的转化子进行亚油酸异构酶基因的 PCR 扩增鉴定， 结果如图 2 所示， 与 阴性对照菌株 (CK) 相比， 重组酵母菌菌株均能扩增出约 1700bp 的条带， 说明质粒 pYMLS 已 经成功转入到酿酒酵母 K601 中。 0030 实施例 3 重组酵母酶活测定及转化产物分析 0031 YPG 诱导培养基成分 (g/L) ： 10g 蛋白胨 ； 5g 酵母膏 ； 10g 半乳糖。 0032 将上述获得的重组酵母菌接种到 YPG 诱导培养基。
17、中， 30培养 48h 后， 离心 (3000r/min， 10min， ) 收集菌体细胞， 将收集的菌体细胞经生理盐水 (0.9 v/v) 洗涤两次 后， 加入到含有 3mg/ml 亚油酸的磷酸缓冲液中 (0.1mol/l， pH7.0) ； 30， 180rpm 条件下进 行转化反应， 每隔6小时取样测定亚油酸异构酶的酶活， 以携带空载体pYES2的酵母菌菌体 细胞的转化产物为对照， 结果如图 3 所示， 由图可知随着培养时间的增加， 重组酵母菌菌体 细胞的酶活逐渐增加， 在20h时达到最大， 为40.5U/ml， 之后逐渐下降 ； 而携带空载体pYES2 的酵母菌体细胞基本检测不到亚油酸。
18、异构酶酶活。 0033 将上述重组酵母菌的转化 20h 时产物经两倍体积正己烷提取后， 用气相色谱检 测， 如图 4 所示， 图中 A ： 阴性对照菌株 ( 转有空载体 pYES2) 转化产物的气相色谱图 ； B ： 重 组酵母菌菌株转化产物的气相色谱图 ； C ： LA 和 CLA 甲酯标样的气相色谱图， 其中 1 为 LA ； 2 为 c9t11-CLA ； 3 为 t10c12-CLA。 0034 LA 和 CLA 甲酯标样的检测表明 LA 的出峰时间为 30.46min， 而 CLA 中的两种 异构体 c9t11-CLA 和 t10c12-CLA 得到了较好的分离， 其保留时间分别为 。
19、： 32.62min 和 32.83min( 图 4C) ； 利用气相色谱分析法分别对对照菌株和重组酵母菌菌株细胞合成的 CLA 产物进行分析， 结果如图 4 中 A 和 B。通过与图 4C 中 LA 和 CLA 甲酯标样的保留时间比对， 转有空载体 pYES2 的阴性对照菌株培养液催化 LA 后其产物中并没有明显的 CLA 产生 ( 图 4A) ； 而含有酵母展示表达载体 pYMLS 的酿酒酵母工程菌株培养液催化 LA 后产物在保留时 间为 30.28 和 32.45min 时出现典型峰 ( 图 4B)， 比对图 4C 中 LA 和 CLA 甲酯标样的保留时 间得知， 二者分别为 LA 和 。
20、c9t11-CLA。且剩余 LA 的峰面积为 ： 15682.3， c9t11-CLA 的峰面 积为 ： 5800.3， 不考虑产物提取及甲酯化过程中的 LA 损失， 则约有 27.0的 LA 转化合成了 c9t11-CLA。 说 明 书 CN 102206688 A CN 102206691 A1/5 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 102206688 A CN 102206691 A2/5 页 7 0003 序 列 表 CN 102206688 A CN 102206691 A3/5 页 8 0004 序 列 表 CN 102206688 A CN 102206691 A4/5 页 9 0005 序 列 表 CN 102206688 A CN 102206691 A5/5 页 10 序 列 表 CN 102206688 A CN 102206691 A1/2 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102206688 A CN 102206691 A2/2 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102206688 A 。