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1、(10)授权公告号 CN 102206588 B (45)授权公告日 2012.08.15 CN 102206588 B *CN102206588B* (21)申请号 201110111548.X (22)申请日 2011.04.29 CGMCC NO.4701 2011.03.21 C12N 1/14(2006.01) C12P 1/02(2006.01) C12R 1/80(2006.01) (73)专利权人 黑龙江大学 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区学府 路 74 号 (72)发明人 金涛 邹积宏 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 韩末。
2、洙 CN 101125289 A,2008.02.20, 全文 . 侯军 等 .“筛选产抗氧化物质菌株的研 究” .南开大学学报 （自然科学版） .2009, 第 42 卷 ( 第 4 期 ), 第 7-12 页 . 吴祖芳 等 .“乳酸菌高抗氧化活性菌株的筛 选及鉴定” .中国食品学报 .2010, 第 10 卷 ( 第 1 期 ), 第 73-78 页 . Wang Hong 等 .“Analysis of antioxidant activity and volatile components of mycelium acetone extract from seven marine-d。
3、erived fungi Penicillium spp.” . 中 国海洋药物杂志 .2009, 第 28 卷 ( 第 6 期 ), 第 19-25 页 . (54) 发明名称 一株产抗氧化剂的菌株 (57) 摘要 一株产抗氧化剂的菌株， 它涉及一株青霉菌 菌株。本发明提供了一株青霉菌菌株， 可产生抗 氧化剂， 为抗氧化剂的获得提供微生物资源基础。 本发明产抗氧化剂的菌株为青霉 JTLR-1， 保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏日期为2011年3月21日， 保藏号为 CGMCC No.4701。本发明的青霉 JTLR-1 能够产生 抗氧化剂， 为抗氧化。
4、剂的获得提供微生物资源基 础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 蔺娜 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一株产抗氧化剂的菌株， 其特征在于产抗氧化剂的菌株为青霉 (Penicillium sp.) JTLR-1， 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏日期为 2011 年 3 月 21 日， 保藏号为 CGMCC No.470。
5、1。 权 利 要 求 书 CN 102206588 B 2 1/3 页 3 一株产抗氧化剂的菌株 技术领域 0001 本发明涉及一株青霉菌菌株。 背景技术 0002 自由基是生命活动中多种生化反应的中间代谢物质。自由基产生过多或清除过 慢， 会造成机体在分子水平、 细胞水平及组织器官水平的各种损伤， 加速机体的衰老过程并 诱发各种疾病。自由基攻击生命大分子和各种细胞器造成组织损伤， 是引起机体衰老的根 本原因， 也是诱发肿瘤等恶性疾病的重大原因。 0003 抗氧化物质 ( 抗氧化剂 ) 是指能够清除氧自由基， 抑制或消除以及减缓氧化反应 的一类物质。抗氧化剂的开发与研究一直以来受到人们的广泛关。
6、注， 天然抗氧化剂已从单 纯作为油脂和含脂食品的抗氧化剂， 发展到作为体内氧自由基的清除剂， 起到保护人体细 胞组织， 保护心脑血管循环系统、 抗癌及延缓衰老等生理作用。 目前天然抗氧化物质主要是 从动植物中提取的， 如维生素类、 酶类和天然药物类等。 但是动植物中天然抗氧化物质含量 较低， 提取工艺复杂， 而且从这些资源提取势必使这些动植物资源遭到严重破坏， 造成生物 多样性和生态环境的损失。 发明内容 0004 本发明提供了一株青霉菌菌株， 可产生抗氧化剂， 为抗氧化剂的获得提供微生物 资源基础。 0005 本发明产抗氧化剂的菌株为青霉 (Penicillium sp.)JTLR-1， 保。
7、藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3 号， 保藏日期为 2011 年 3 月 21 日， 保藏号为 CGMCC No.4701。 0006 本 发 明 青 霉 JTLR-1 属 于 半 知 菌 亚 门 (Deuteromycotina)，丝 孢 菌 纲 (Hyphomycetes)， 丝孢目 (Moniliales)， 丛梗孢科 (Moniliaceae)， 青霉属 (Penicillium)。 0007 本发明青霉 JTLR-1 在 PDA 固体培养基或查氏固体培养基中培养， 1 2 天培养基 表面有白色絮状菌丝体， 生长快。
8、， 质地柔软， 2 天后平板底部中心处有少量红色物质产生， 边 缘为淡黄色， 5 7 天后可产生分生孢子， 菌落正面菌丝夹杂大量分生孢子 ( 见图 1)， 表面 无渗出液， 分生孢子颜色为深绿色， 菌落反面呈红色夹杂黄色(见图2)。 青霉JTLR-1在PDA 液体培养基或查氏液体培养基上培养315天后， 摇瓶中长满白色菌丝球， 呈小球型， 溶液 表面液面层及摇瓶壁上有大量产红色夹杂黄色菌丝体产生。在光学显微镜下， 菌丝呈长丝 状， 菌丝中间无隔(见图3)。 分生孢子梗直径2.53.5微米 ； 帚状枝为2层， 下层小梗3 5 个， 上层小梗 5 7 个。分生孢子呈圆形或椭圆形， 大小 (2.5m。
9、 3.5m)(2.0m 2.5m)。 0008 本发明青霉 JTLR-1 可在 PDA 培养基或查氏培养基中培养， 最适生长温度 25 28， 最适 pH 值为 5 7。 0009 本发明青霉JTLR-1能够产生抗氧化剂， 使用-胡萝卜素-亚油酸法和清除DPPH 说 明 书 CN 102206588 B 3 2/3 页 4 法对青霉JTLR-1的发酵产物和化学合成抗氧化剂BHT的抗氧化活性进行检测， 实验结果显 示青霉 JTLR-1 产生的抗氧化剂优于 BHT 的抗氧化活性。 0010 本发明青霉 JTLR-1 属于青霉属 (Penicillium sp.)， 保藏在中国微生物菌种保藏 管理委。
10、员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏 日期为 2011 年 3 月 21 日， 保藏号为 CGMCC No.4701。 附图说明 0011 图 1 为本发明青霉 JTLR-1 的菌落正面形态图 ； 图 2 为本发明青霉 JTLR-1 的菌落 背面形态图 ； 图 3 为本发明青霉 JTLR-1 的菌丝形态图。 具体实施方式 0012 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式， 还包括各具体实施方式间的 任意组合。 0013 具体实施方式一 ： 本实施方式产抗氧化剂的菌株为青霉 JTLR-1， 保藏在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微。
11、生物中心 (CGMCC)， 保藏日期为 2011 年 3 月 21 日， 保藏号为 CGMCC No.4701。 0014 青霉 JTLR-1 在 PDA 固体培养基或查氏固体培养基中培养， 1 2 天培养基表面有 白色絮状菌丝体， 生长快， 质地柔软， 2 天后平板底部中心处有少量红色物质产生， 边缘为淡 黄色， 5 7 天后可产生分生孢子， 菌落正面菌丝夹杂大量分生孢子， 表面无渗出液， 分生孢 子颜色为深绿色， 菌落反面呈红色夹杂黄色。青霉 JTLR-1 在 PDA 液体培养基或查氏液体培 养基上培养315天后， 摇瓶中长满白色菌丝球， 呈小球型， 溶液表面液面层及摇瓶壁上有 大量产红色。
12、夹杂黄色菌丝体产生。在光学显微镜下， 菌丝呈长丝状， 菌丝中间无隔。分生孢 子梗直径 2.5 3.5 微米 ； 帚状枝为 2 层， 下层小梗 3 5 个， 上层小梗 5 7 个。分生孢 子呈圆形或椭圆形， 大小 (2.5m 3.5m)(2.0m 2.5m)。 0015 本实施方式的青霉 JTLR-1 可在 PDA 培养基或查氏培养基中培养， 最适生长温度 25 28， 最适 pH 值为 5 7。 0016 具体实施方式二 ： 本实施方式从榛属植物茎皮内分离纯化得到， 具体步骤为 ： 一、 将带部分木质部的榛树皮先用无菌水冲洗去掉杂质， 再用质量浓度为 75的酒精浸泡 1min， 然后用无菌水冲。
13、洗掉酒精， 在用无菌剪刀剪成面积为 0.5cm0.5cm 的榛树皮小块 ； 二、 将榛树皮小块放置于 PDA 琼脂固体培养基平板上， 在 28条件下恒温培养至树皮小块 周围明显长出菌丝 ； 三、 采用尖端菌丝挑取法将菌接种于 PDA 琼脂固体培养基， 在 28恒温 条件下培养 3 5 天， 挑取单菌落， 用 PDA 琼脂固体培养基平板划线培养法， 经多次分离、 筛 选、 纯化， 得到可以产生抗氧化剂的青霉 JTLR-1。 0017 对分离纯化得到的青霉 JTLR-1 进行分子生物学鉴定， 按以下步骤进行 ： 提取菌 株的总 DNA， 采用真菌通用引物 ITS1、 ITS4 扩增青霉 JTLR-。
14、1 rDNA ITS 序列， PCR 产物纯 化后， 经 NCBI 数据库序列比对， 与青霉属 (Penicillium sp.) 内各个种之间有极高的同 源性， 同源性为 98以上， 通过结合菌体形态特征、 生长条件确定青霉 JTLR-1 属于青霉属 (Penicillium sp.)。 0018 将本实施方式的青霉 JTLR-1 接种于种子培养基 (PDA 琼脂固体培养基 )， 于 28 说 明 书 CN 102206588 B 4 3/3 页 5 培养 2 天， 然后转接于装有 200mL 发酵培养基 (PDA 液体培养基 ) 的 500mL 三角瓶中， 于 28、 180r/min 条。
15、件下摇瓶培养 7 天， 收集发酵固体培养物。 0019 对本实施方式的青霉 JTLR-1 的发酵产物进行抗氧化活性检测， 具体如下 ： 取青霉 JTLR-1 的发酵固体培养物用液氮冷冻并研碎后， 以 1g 固体培养物加入 10mL 质量浓度 50 的甲醇水的比例进行提取， 用正己烷萃取， 直至正己烷萃取液无色后， 除去上层正己烷层， 取下层冷冻干燥， 即得到菌产抗氧化剂。 0020 (1)- 胡萝卜素 - 亚油酸法测定菌产抗氧化剂的抗氧化活性 0021 将 0.2mg - 胡萝卜素溶于 0.2mL 氯仿中， 加入 20mg 亚油酸及 200mg 吐温 -40， 混合均匀后于 40水浴中除去氯仿。
16、， 然后加入 50mL 蒸馏水 ( 经鼓氧气 2 3min)， 剧烈振 荡， 即配成反应介质溶液。同时设置空白， 除不加 - 胡萝卜素氯仿溶液外， 其他步骤同前。 于具塞试管中逐一加入 4.0mL 反应介质溶液， 将菌产抗氧化剂和化学合成抗氧化剂 BHT 溶 于无水乙醇配制成系列浓度溶液作为样液， 分别加入 0.2mL 样液， 同时设置空白调零管、 对 照管和样品管， 其中空白调零管中不含 - 胡萝卜素与试样， 对照管不含试样， 以 0.2mL 无 水乙醇代替试样溶液。上述溶液混匀后， 置于 50水浴中恒温， 在 470nm 波长下测定 t 0 时的吸光度， 之后每间隔 15min 测定吸光度。
17、， 直至对照管中 - 胡萝卜素颜色消失 ( 约 120min)。 0022 抗氧化活性的计算公式 ： 0023 (A0、 分别表示 t 0 时样品和对 照的吸光度 ； At、 分别表示 t 120min 时样品和对照的吸光度 ) 0024 -胡萝卜素-亚油酸法测定菌产抗氧化剂， 表现出优良的抗氧化活性， 其IC50值 为 1.05mg/mL， 而 BHT 的 IC50 值为 1.28mg/mL， 说明菌产抗氧化剂优于 BHT 的抗氧化活性。 0025 (2) 菌产抗氧化剂清除 DPPH 自由基能力的测定 0026 用无水乙醇配置6.510-5mol/L DPPH溶液， 另将菌产抗氧化剂和化学合。
18、成抗氧化 剂 BHT 溶于无水乙醇配制成系列浓度溶液作为样液。精确吸取 2.5mL DPPH 溶液和 0.5mL 样液摇匀， 室温避光放置反应 10min 后倒入光径 1cm 比色皿 517nm 下测定吸光值。重复测 定 3 次， 结果取平均值。然后按下式计算 DPPH 自由基清除率， 抗氧化剂清除自由基能力采 用清除 DPPH 的 IC50 值表示， 即 DPPH 自由基清除率为 50时所对应的抗氧化剂溶液浓度。 0027 清除率 ( ) 1-(Ai-Aj)/A0100， 其中 A0为 2.5mL DPPH 溶液 +0.5mL 无水 乙醇， Ai为 2.5mLDPPH 溶液 +0.5mL 样液， Aj为 2.5mL 无水乙醇 +0.5mL 样液。 0028 经计算本实施方式的青霉JTLR-1菌产抗氧化剂的IC50值(50DPPH自由基清除 率所需样品的浓度 ) 为 41.17g/mL， 而 BHT 的 IC50 值为 94.26g/mL， 说明菌产抗氧化剂 优于 BHT 的抗氧化活性。 0029 由以上结果可知， 本实施方式的青霉 JTLR-1 能够产生抗氧化剂。 说 明 书 CN 102206588 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102206588 B 6 。