沃尼妙林人工抗原及其制备方法与应用 【技术领域】
本发明涉及一种沃尼妙林人工抗原及其制备方法与应用。
背景技术
沃尼妙林(Valnemulin)是新一代截短侧耳素(pleuromu.tilin)类半合成抗生素，属二萜烯类，是泰妙菌素的同类药物。现已上市的沃尼妙林原料药为盐酸沃尼妙林，化学名为{[2～((R)一2一氨基一3一甲基丁酰氨基)一1，1一二甲基乙基]巯基}乙酸(3as，4R，5S，6S，8R，9R，9aR，IOR)一八氢一5，8一二羟基一4，6，9，10一四甲基一6～乙烯基一3a，9一丙烷一3aH一环戊环辛烯一1(4H)一酮一8一酯盐酸盐，分子式C3lH53CINz 05S，相对分子量601.30，化学结构式见式(II)。盐酸沃尼妙林为白色或淡黄色非结晶性粉末，有吸湿性；在水、无水乙醇中易溶，在叔丁基甲醚中几乎不溶；比旋度为+15.5°～+18.0°；熔点174～177℃；pH值为3.0～6.0。
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式(II)
沃尼妙林的作用机理是与病原微生物核糖体上的50s亚基结合，抑制其蛋白质的合成。Poulsen等研究发现，沃尼妙林可与病原微生物核糖体23sRNA的v区结合，阻止转肽酶在tRNA的CCA一末端的准确定位，从而抑制病原微生物蛋白质的合成，致使其死亡。
1984年，瑞士Sandoz公司Bemer等利用截短侧耳素率先合成成功。1999年，瑞士Norvatis公司将其做成预混剂，商品名Econor，现已在多个国家上市，主要用于防治畜禽支原体及肠道螺旋体感染。由于沃尼妙林具有安全、高效、低毒、不易产生耐药性等特点，目前许多国家已广泛使用。虽然，沃尼妙林以其治疗效果好、消除快、残留低、不易产生耐药性、毒副作用小、对环境无污染等特点，得到了世界各国越来越多的关注。但动物实验表明其也可引起一些不良反应，此外沃尼妙林可与聚醚离子载体类药物，如莫能菌素、盐霉素、拉沙里菌素、马杜霉素等相互作用，导致动物出现严重的中毒症状，甚至死亡。因此其对人体的健康具有潜在的危害。虽然有研究报道沃尼妙林与其他药物相比不易产生耐药性，但其临床应用时间不长，并不能证明其在长期使用后的结果。目前，EMEA规定了沃尼妙林在猪体内的最大残留限量(MRLs)：肝脏，500μg/kg；肾脏，100μg/kg；肌肉，50μg/kg。
目前对沃尼妙林还没有一种公开发表，稳定可靠的残留检测方法，可能是由于沃尼妙林的最大吸收在近紫外区，而近紫外区各种杂质的干扰又比较大，这无疑增大了其残留检测的难度，因此，建立一种稳定可靠的残留检测方法就成了当前亟待解决的问题。免疫化学分析由于其原理为抗原抗体之间的特异性结合，刚好可避开上述困难，因而具有独特的优势。同时免疫分析还具有操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫抗原分子的结构，因此免疫抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种沃尼妙林人工抗原及其制备方法与应用。
本发明提供沃尼妙林人工抗原为式I所示化合物；
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式I；
式I中，n为1‑25的自然数；
K表示载体蛋白。
所述化合物中，所述K具体可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兰素蛋白或卵清白蛋白等，优选牛血清白蛋白。
所述化合物中，所述n具体可为18。
本发明还保护式I所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
1)将沃尼妙林、载体蛋白共溶于PBS中，得到溶液I；将碳二亚胺(EDC)溶于水中，得到溶液II；所述沃尼妙林、所述载体蛋白、所述碳二亚胺的质量比为(10‑100)∶(20‑200)∶(20‑200)；
2)将溶液II和溶液I混合，15‑25℃反应1‑3小时，得到式I所示化合物。
具体来说，所述方法包括如下步骤：
1)将50mg沃尼妙林、100mg载体蛋白共溶于2ml 0.01M pH7.4的PBS中，得到溶液I；将100mg碳二亚胺溶于1ml水中，得到溶液II；
2)将溶液II和溶液I混合，20℃反应2小时，得到式I所示化合物。
所述方法中，所述K具体可为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兰素蛋白或卵清白蛋白等，优选牛血清白蛋白。
所述方法中，所述n具体可为18。
所述方法还包括将步骤2)得到的式I所示化合物进行透析的步骤；所述透析的条件为：4℃‑20℃、用PBS透析48‑96小时，优选为4℃、用0.01M pH7.4的PBS透析72小时。
所述方法还包括将透析后的所述化合物进行离心取上清的步骤；所述离心的条件为：4℃、5000‑8000rmp、20‑30分钟，优选为4℃、5000rpm、30分钟。
沃尼妙林可先溶解于PBS溶液中，再加几滴DMF促溶。具体可以采取逐滴加入的方式。所述反应过程中也可以进行搅拌。
所述的化合物可应用于制备沃尼妙林抗体，如单克隆抗体。
用所述的化合物为免疫原制备得到的单克隆抗体也属于本发明的保护范围。
所述化合物或所述抗体可应用于检测沃尼妙林。
本发明以EDC与载体蛋白的羧基反应，生成载体蛋白的活性酯中间产物，然后与含伯氨基的沃尼妙林发生反应，从而使载体蛋白与沃尼妙林以酰胺键相连，得到人工抗原。将人工抗原免疫动物后产生了针对沃尼妙林的特异性抗体。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清的效价可达1∶102400，最低检测限为0.05ng/mL，半抑制浓度为0.4ng/mL，产生的抗体的特异性高、灵敏度高、准确度高。本发明的抗原和/或抗体，可用于建立竞争酶联免疫吸附分析技术，从而用于快速检测食品中的沃尼妙林残留，较常规色谱法比，具有成本低廉、操作简单、样品前处理简便、方便快捷的特点，还减少由于采用HPLC、GC检测而使用的甲醇、乙腈等有机溶剂对环境的污染，适合于大规模检测。本发明的制备方法的产率高。因此，本发明的抗原及抗体及检测方法具有广阔的应用前景。
【附图说明】
图1为沃尼妙林人工抗原的紫外光谱图。
【具体实施方式】
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、沃尼妙林人工抗原的制备和鉴定
沃尼妙林：购自Sigma Aldrich公司；产品目录号：32971。
一、沃尼妙林人工抗原的制备
将50mg沃尼妙林(Valnemulin)、100mg载体蛋白(牛血清蛋白BSA)共溶于2ml0.01M pH7.4的PBS中，得到溶液I；称取碳二亚胺(EDC)100mg，溶于1ml水中，得到溶液II；将溶液II加入到溶液I中，在20℃的条件下，反应2小时，得到反应产物(沃尼妙林人工抗原)。将反应产物进行透析，透析的条件为：4℃、用0.01MpH7.4的PBS透析72小时。透析后将化合物于4℃、5000‑8000rmp离心30分钟，取上清(沃尼妙林人工抗原)，分装于安培瓶中，‑20℃保存。
二、沃尼妙林人工抗原的鉴定
将步骤一保存的上清(沃尼妙林人工抗原)用0.01M pH7.4的PBS稀释，然后进行紫外(200‑400nm)光谱扫描，以1mg/mL的BSA作为对照。紫外(200‑400nm)光谱扫描结果见图1，沃尼妙林人工抗原的紫外图谱与BSA相比发生了明显变化，说明沃尼妙林半抗原与载体蛋白BSA成功偶联。沃尼妙林人工抗原(Valnemulin‑BSA)为式I所示化合物，沃尼妙林和BSA的偶联比为18∶1。
实施例2、抗血清的制备和特异性鉴定
沃尼妙林标准品：购自Sigma Aldrich公司；产品目录号：32971。
新西兰大白兔：购自北京实验动物研究中心。
HRP‑羊抗兔IgG：购自上海锐聪科技发展有限公司；产品目录号：KT117。
一、沃尼妙林抗血清的制备
新西兰大白兔100只，随机分成实验组和对照组(每组50只)；实验组以步骤二制备的沃尼妙林人工抗原进行免疫，对照组以牛血清蛋白(BSA)进行免疫；每只兔子每次免疫1mg/mL(以BSA量计)，每两周免疫一次，共免疫7次；分别在第三次免疫之后7天，第四次免疫之后7天，第五次免疫之后7天，第六次免疫之后7天，第七次免疫之后7天，每组取10只兔子耳缘静脉采血。
二、沃尼妙林抗血清的效价测定
分别将步骤一采得的血样制备血清，进行间接竞争ELISA分析(每孔均设三个复孔)，具体步骤如下：
1、包被：用包被缓冲液将Valnemulin‑OVA(制备方法同Valnemulin‑BSA，用OVA代替BSA)倍比稀释为系列浓度(1000‑100000)，每一浓度包被一行，100μL/孔，4℃过夜；
2、洗涤与封闭：倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟；每孔加入150μL封闭液，37℃恒温封闭1h，然后洗涤3次，每次3分钟；
3、加样：将50μL倍比稀释的兔血清(1000‑100000，)与50μL沃尼妙林标准液(1μg/ml)加到酶标板上37℃反应1小时，倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次；然后每孔加入100μL HRP‑羊抗兔IgG，37℃反应1小时，倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次；
4、显色测定：每孔加入TMB溶液100μL，37℃显色20min，然后每孔加入50μL 2mol L
‑1H
2SO
4以终止反应，最后用酶标仪测定各孔的OD
450nm值。
ELISA分析中：空白对照孔中用PBS代替兔血清，作为空白对照；零标准孔中用PBS代替沃尼秒林标准液，作为阴性对照。
实验组：沃尼妙林人工抗原第6次免疫之后获得了特异性抗体，效价高达1∶102400，其配对包被抗原稀释倍数为5000倍；与阴性对照(未加沃尼妙林标准品)相比，加入沃尼妙林标准品后，吸光值呈明显的递减梯度，说明获得的兔血清能够特异性地识别沃尼妙林。
对照组：BSA免疫组采集的7次免疫血清，测定中均无显色，说明实验组产生的抗体是特异性针对沃尼妙林药物的。
结果表明，用沃尼妙林人工抗原免疫兔子，可以获得高效价的抗体，且免疫后得到的兔血清能够特异性地识别沃尼妙林。
三、沃尼妙林抗血清的最低检测限和半抑制浓度测定
分别将步骤一采得的血样制备血清，进行如下实验：
1、包被：用包被缓冲液将Valnemulin‑OVA(制备方法同Valnemulin‑BSA，用OVA代替BSA)稀释5000倍，100μL/孔，4℃过夜；
2、洗涤与封闭：倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟；每孔加入150μL封闭液，37℃恒温封闭1h，然后洗涤3次，每次3分钟；
3、加样：将50μL的兔血清(102400倍稀释)与50μL沃尼妙林系列标准液(0、0.05、0.25、1.25、6.25、50.0、250.0ng/mL)加到酶标板上37℃反应1小时，倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次；然后每孔加入100μL HRP‑羊抗兔IgG，37℃反应1小时，倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次；
4、显色测定：每孔加入TMB溶液100μL，37℃显色20min，然后每孔加入50μL 2mol L
‑1H
2SO
4以终止反应，最后用酶标仪测定各孔的OD
450nm值。
用20％抑制浓度作为最低检测限，测定结果为0.05ng/mL，半抑制浓度为0.4ng/mL。