一种猪瘟病毒纯化方法 技术领域 本发明涉及一种猪瘟病毒的纯化方式， 具体涉及从原代牛睾丸细胞繁殖猪瘟病毒 的细胞液中纯化猪瘟病毒的方法。
背景技术 猪瘟是一种严重危害养猪业的毁灭性传染病。20 世纪 50 年代中国首创了举世闻 名的猪瘟兔化弱毒疫苗， 随后创制了不同的疫苗制造工艺， 如乳兔组织苗、 牛体反应组织苗 和猪瘟牛睾丸细胞苗等， 应用比较普遍的是犊牛睾丸细胞苗。猪瘟弱毒疫苗是一株非常安 全的弱毒疫苗， 对各种年龄和品种的猪都没有副作用， 并且有良好的免疫效力， 它能同时诱 导体液免疫和细胞免疫应答， 对不同基因型的猪瘟病毒株均能提供有效的免疫保护。但是 一般用于动物的病毒性疫苗含有来源于动物组织、 细胞和培养基的蛋白质、 糖类、 脂类及核 酸等杂质成分， 以及细胞代谢副产物等， 易使接种动物产生过敏， 持续发热等副作用。
国际专利 WO 98/22588 色谱层析的方法纯化来自于细胞培养的腺病毒 ； 美国应用 专利 US20090123989 描述了一种通过超滤的方法从细胞繁殖的含有腺病毒的溶液中纯化 腺病毒的方法 ； 采用离子交换和膜亲和层析的方法纯化病毒颗粒样腺病毒载体 (Peixoto et al.， 2008 ； Sellick， 2006)， 纯化禽流感病毒 (Kalbfuss et al.， 2007 ； Opitzet al.， 2009 ； Opitz et al.， 2007)。美国专利 4725546， 采用硫酸酯化的纤维素或者交联的脂多糖 通过层析的方式纯化日本脑炎病毒， 从而为治疗日本脑炎病毒提供良好的高纯度的疫苗。 美国专利 6207439， 采用硫酸酯化的纤维素或者交联的脂多糖通过层析的方式纯化流感病 毒， 从而提高病毒纯度获得良好的疫苗。美国专利 3874999 通过 MgSO4 沉淀含病毒液中的 杂蛋白， 而达到纯化病毒的目的。刘劲松等用兔抗牛睾丸细胞培养物的 IgG 琼脂糖 4B 偶联 制备亲和层析柱， 然后通过亲和层析免疫吸附除去 PEG 沉淀法部分纯化抗原中的残留牛睾 丸细胞培养物成分。其结果表明， 通过 3 次反向亲和层析柱的纯化抗原， 其总蛋白去除率达 76.9％ ( 刘劲松等， 1992)。
虽然对病毒的纯化方法有很多种， 但是均存在一些缺点， 例如 MgSO4 沉淀法其对病 毒的活性影响非常大， 在高浓度的 MgSO4 溶液中病毒被灭活 ； 而利用亲和层析的方法虽然能 够获得纯度较高的病毒， 但是亲和层析的填料成本太高， 在兽用疫苗中不能广泛使用。 猪瘟 6 病毒是单股 RNA 病毒， 相对分子量为 4×10 道尔顿。本病毒呈圆形颗粒状， 其直径为 38 ～ 44nm， 核衣壳为对称的 20 面体立体结构。猪瘟病毒的抵抗力较强， 血液中的病毒在 37℃可 存活 7 天， 在细胞培养物中猪瘟病毒 60℃ 10 分钟就会失去活性。病毒在 pH5-10 的环境中 稳定。目前， 使用的猪瘟疫苗均为猪瘟病毒经过兔体弱化而形成的猪瘟弱毒疫苗。在工业 只有部分厂家经过病毒浓缩， 例如膜过滤 化生产的过程中， 均未经过对猪瘟病毒进行纯化。 等方式去掉小部分杂蛋白或者细胞碎片等物质。这样， 生产用于动物的病毒性疫苗含有来 源于动物组织、 细胞和培养基的蛋白质、 糖类、 脂类及核酸等杂质成分， 以及细胞代谢副产 物等， 易使接种动物产生过敏， 持续发热等副作用。
发明内容 本发明的目的是提供一种猪瘟病毒纯化方式。
该猪瘟病毒纯化方法包括如下步骤 ：
1) 对猪瘟病毒细胞培养液进行过滤 ； 2) 通过横向切留超滤浓缩方式对初滤的猪 瘟病毒细胞液进行浓缩 ； 3) 使用阴离子交换层析柱对猪瘟病毒进行纯化。
所述的猪瘟病毒细胞培养液为原代牛睾丸细胞繁殖猪瘟病毒的细胞培养液。
其中步骤 1) 中对猪瘟病毒细胞液进行过滤的滤膜孔径为 0.2 ～ 1.2μm。优选先 采用 1.0μm 以上的滤膜， 再采用 0.2 ～ 0.45μm， 更为优选为 0.45μm 孔径的滤膜。
其中步骤 2) 所述的对初滤的猪瘟病毒细胞液进行浓缩的倍数为 10 ～ 40 倍， 优选 为 20 倍。所述的横向切留超滤浓缩的浓缩膜孔径为 1K ～ 100K， 优选为 30 ～ 50K。
其 中 步 骤 3) 所 述 的 阴 离 子 层 析 柱 选 自 下 述 的 层 析 树 脂 ： UNOsphere Q、 TM Marcro-prep High Q、 Qsepharose Fast Flow HiPrep16/DEAEFF、 DEAE-SephadexA-25、 CMSepharoseFastFlow， 优选为 Marcro-prep High Q。
本发明还提供阴离子交换层析纯化猪瘟病毒的方法， 包括如下步骤 ：
1) 装层析柱
将 层 析 柱 垂 直 放 稳， 关 闭 出 液 管 口， 柱 顶 部 接 上 装 柱 容 器。 将 50 ％ (V/V) Marcro-prep High Q 介质的混合液轻轻搅拌均匀， 往装柱容器加入 40ml 均匀的介质混合 液。静置 3h 后， 打开出液管口， 流走多余液体， 轻轻拆离装柱容器。
2) 平衡层析柱
将层析仪各吸液管插入相应液体瓶内， 启动层析仪， 预热 30min。开动低压泵， 将管道中气泡排出， 并用相应溶液将各管道冲洗。暂停低压泵， 将装好的层析柱与层析仪 连接好。3CV(column volume) 超纯水 ( 已过滤 ) ； 接着 2CV 1.5mol/L NaCl+0.025mol/L Tris(pH 8.4)， NaCl 浓度由通过调整 A2 液和 B2 液的百分比实现， 即 25％ A2+75％ B2 ； 最后 4CV A2 液冲洗层析柱。其中所述 A2 液为 A2 为 0.025mol/L Tris ； pH 8.4 ； B2 液为 2.0mol/ L NaCl+0.025mol/L Tris， pH 8.4。
3) 平衡猪瘟细胞毒液
往浓缩 20 倍的猪瘟细胞毒液中加入 0.5mol/L Tris(pH 7.5)， 猪瘟细胞毒液和 0.5mol/L Tris 的体积比为 2 ∶ 38。22μm 微孔滤膜过滤 2 次。分装并且存于 -20℃冰箱 备用。
4) 自动进行层析。
设 定 系 统 自 动 过 程， 设 置 注 入 层 析 柱 细 胞 毒 液 为 2ml， 设置流速为 ： 8ml/ min(272cm/h)， 设定线性盐浓度梯度洗脱过程， 0M NaCl、 0.4M NaCl、 1.5M NaCl、 2.0M NaCl， 启动系统自动层析。
5) 人工收集层析样品液
猪瘟病毒粒子的等电点约 4.5 左右， 在本层析系统中 (pH 值 7.5) 带负电荷， 与 Marcro-prep High Q 层析柱有较强的吸附作用， 在逐渐提高洗脱液的离子浓度时被洗出。 共检出 9 个洗脱峰， 回收 5， 6 洗脱峰， 获得纯化后的猪瘟病毒液， 存放于 -20 冰箱。
6) 层析柱后处理
按要求再生层析柱， 注入 20％乙醇封存层析柱， 防止柱内微生物生殖。
本发明针对牛睾丸细胞传代的病毒疫苗， 通过横向流超滤膜浓缩、 强阴离子交换 层析等方法， 去除了大部分生物源性杂质成分， 纯化富集具有免疫保护作用的病毒抗原成 分， 使得纯化病毒疫苗比传统粗制疫苗更加安全。 根据本发明的方法纯化猪瘟病毒， 病毒回 收率为 71.6％， 杂蛋白去除率为 91.06％， 病毒活性无明显损失。 附图说明
图 1 为 Marcro-prep High Q 阴离子交换层析图。
图 2 为 ELISA 标准曲线。 具体实施方式
以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。
实施例 1
牛睾丸细胞传代的猪瘟病毒细胞培养液通过孔径为 0.45μm 的滤膜过滤， 去掉细 胞碎片等大的杂质。然后把初滤的猪瘟病毒细胞培养液通过横向切留超滤浓缩的方式， 把 病毒液浓缩 20 倍， 其中横向切留超滤浓缩膜孔径为 30K。 使用 Marcro-prep High Q 阴离子 交换层析对病毒液进行纯化， 步骤如下 ：
1) 装层析柱
将 层 析 柱 垂 直 放 稳， 关 闭 出 液 管 口， 柱 顶 部 接 上 装 柱 容 器。 将 50 ％ (V/V) Marcro-prep High Q 介质的混合液轻轻搅拌均匀， 往装柱容器加入 40ml 均匀的介质混合 液。静置 3h 后， 打开出液管口， 流走多余液体， 轻轻拆离装柱容器。
2) 平衡层析柱
将层析仪各吸液管插入相应液体瓶内， 启动层析仪， 预热 30min。开动低压泵， 将管道中气泡排出， 并用相应溶液将各管道冲洗。暂停低压泵， 将装好的层析柱与层析仪 连接好。3CV(column volume) 超纯水 ( 已过滤 ) ； 接着 2CV 1.5mol/L NaCl+0.025mol/L Tris(pH 8.4)， NaCl 浓度由通过调整 A2 液和 B2 液的百分比实现， 即 25％ A2+75％ B2 ； 最后 4CV A2 液冲洗层析柱。其中所述 A2 液为 A2 为 0.025mol/L Tris ； pH 8.4 ； B2 液为 2.0mol/ L NaCl+0.025mol/L Tris， pH 8.4。
3) 平衡猪瘟细胞毒液
取 38ml 猪瘟细胞毒液， 加入 2ml 0.5mol/L Tris(pH 7.5) 样品缓冲液。22μm 微 孔滤膜过滤 2 次， -20℃冰箱备用。
4) 自动进行层析。
设定系统自动过程， 注入步骤 3) 平衡过的猪瘟细胞毒液 12ml， 设置流速为 ： 8ml/ min(272cm/h)， 设定线性盐浓度梯度洗脱过程。启动系统自动层析。
5) 人工收集层析样品液
猪瘟病毒粒子的等电点约 4.5 左右， 在本层析系统中 (pH 值 7.5) 带负电荷， 与 Marcro-prep High Q 层析柱有较强的吸附作用， 在逐渐提高洗脱液的离子浓度时被洗出。 共检出 9 个洗脱峰 ( 图 1)， 回收各个吸收峰的样品液， 并做好记录， 收集后存放于 -20 冰箱。
6) 层析柱后处理
按要求再生层析柱， 注入 20％乙醇封存层析柱， 防止柱内微生物生殖。将层析后的样品进行 ELISA 免疫检测， 步骤如下 ：
1) 标准样品制备
用已灭菌生理盐水按 10 倍， 20 倍， 40 倍， 80 倍， 稀释前述的 20 倍病毒浓缩液， 配制 一系列浓度标准样品 ： 猪瘟细胞毒浓缩液 10 倍稀释液， 猪瘟细胞毒浓缩液 20 倍稀释液， 在 猪瘟细胞毒浓缩液 40 倍稀释液， 猪瘟细胞毒浓缩液 80 倍稀释液， 生理盐水。
2) 标准样品及层析样品 ELISA 检测
(1) 检测抗体的加入 ： 取出用抗体包被的微量反应板， 并在记录表上标记好每个 样本的位置 ； 在每个反应孔中加入 50μl 的检测抗体。可以用移液器加样。
(2) 样本的加入 ： 在阴性对照的双孔中各加入 50μl 阴性对照 ； 在阳性对照的双孔 中各加入 50μl 阳性对照 ； 在剩下的反应孔中分别加入 50μl 被检样品。对于不同的被检 样品要更换洗头 ； 轻弹微量反应板或用振荡器振荡， 将反应板中的溶液混匀。
(3) 样品的孵育 ： 在 37℃的条件下孵育 2 小时， 在孵育过程中应将微量反应板封闭 或在湿盒内孵育， 以防反应孔中的液体蒸发。
(4) 洗板 ： 吸出反应孔中的液体物质并弃入废液缸中 ； 每个反应孔加入约 300μl 的洗涤液进行洗涤， 洗涤五次。每次洗涤后吸出所有孔中的液体。在洗涤时以及在加酶标 二抗之前要防止反应板出现干燥现象。在最后一次洗涤完后， 将反应板在吸水性强的物质 上拍干。 (5) 加辣根过氧化物酶标记物 ：
在每个反应孔中加入 100μl 辣根过氧化物酶标记物。
(6) 辣根过氧化物酶标记物孵育 ：
在室温 (18-25℃ ) 孵育 30 分钟。
(7) 重复步骤 (4)
(8) 加入底物 ： 在每个反应孔中加入 100μl TMB 底物。
(9) 底物孵育 ： 在室温下 ( 暗处 )(18-25℃ ) 孵育 10 分钟。计时从加入第一孔时 开始计算。
(10) 终止反应 ： 在每个反应孔中加入 100μl 的终止液终止反应。加入顺序同底 物的加样顺序， 同步骤 9。
(11) 读板 ： 使用超微量紫外 / 可见光光度计， 空气调零 ； 在波长 450nm 读取记录样 本和对照的吸光度值 ； 计算结果。
根据本发明建立的 ELISA 检测方法， 建立 ELISA 标准曲线发现 ELISA 的吸光值与 病毒浓度有很好的线性关系 ( 图 2)。通过标准曲线拟合的直线方程计算， 9 个洗脱峰的样 品的吸光值如表 1 所示， 计算病毒回收率分别为 21.7％和 49.9％ ( 计算公式 ： 猪瘟病毒回 收率＝ ( 样品 OD 值 - 阴性对照 OD 值 )× 回收样品体积 / 浓缩后样品 OD 值 × 上样体积 )。 合并 5， 6 样品实际病毒回收率为 71.6％。
表 1 ELISA 检测结果
经 ELISA 检测， 病毒粒子主要位于样品 5、 6 这个洗脱峰中 ( 表 1)， 分离效果较好， 其它样品含有极其少的病毒颗粒， 绝大部分是培养基中的血清， 细胞代谢产物、 有害分泌 物、 小的细胞碎片等。分离过程中之所以其它样品也存在病毒颗粒， 主要是因为 ： 1) 少量 病毒颗粒与小的细胞碎片等大蛋白或者脂类物质紧密结合在一起 ； 2) 少量病毒裂解了， 而 ELISA 检测时仍然能够检测出来 ； 3) 猪瘟病毒颗粒本来就大小不均一， 因此， 所带电荷也不 均一。
通过考马斯亮蓝染色法对 9 个洗脱样品进行蛋白含量的测定， 结果如表 2 所示。
表 2 pH7.5 样品蛋白含量及蛋白回收率
从表 2 中可以看出， 将层析样品 5， 6 合并作为本次纯化的回收样品该样品中的蛋白含量为纯化前原病毒液的 8.94％， 即纯化后的样品杂蛋白去除率为 91.06％ ( 计算方法 为： 样品蛋白含量＝各个样品所含蛋白总量 / 上样液总的蛋白含量 x100％ )。
实施例 2
(1) 灭菌生理盐水稀释样品
用灭菌生理盐水， 将猪瘟细胞毒液稀释至 10 万倍和 30 万倍。将样品 (5， 6) 合并 液稀释至 1 万倍和 10 倍。
(2) 样品注射
取 15 只新西兰兔 ( 中山大学实验动物中心 )( 体重 2kg±0.2kg)， 编上 1-15 号。 按下表对各只新西兰兔注射相应样品。注射方法 ： 1ml 注射器， 吸 1ml 样品， 从各只新西兰 兔耳缘静脉轻轻注射。
通过兔体的定型发热来鉴定回收的病毒样品活性结果如表 3 所示。
表 3 纯化后病毒存活的兔体检测
病毒原液稀释 10 万倍能使兔子发生定型热， 样品 5， 6 合并液稀释 10 万倍能引起 兔发生定型热反应。该结果表明， 回收的病毒量没有明显的损失， 并且保持了病毒的活性。
综上所述， 通过本专利方法纯化病毒疫苗， 回收 5 和 6 层析峰的洗脱液， 杂蛋白去 除率为 91.06％， 病毒回收率 71.6％， 病毒无明显活性损失。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。