抗白粉病基因PM23的标记研究.pdf

Pm23是从我国一个普通小麦品系中鉴定到的小麦抗白粉病基因，该基因对世界上很多麦区流行的白粉病表现高抗或免疫，已被定位到5A染色体上。本研究以携有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本，配制杂交组合，用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行了RAPD分析。350个十碱基随机引物在抗感池间的扩增结果显示，相引相标记OPE051100可能与Pm23紧密连锁。对F2分离群体进行RAPD分析表明，该标记与Pm23基因之间的连锁距离为10.65±3.25cM，可以有效用于小麦抗病育种分子标记辅助选择中。

1.  抗白粉病基因Pm23的标记研究，其特征在于：本研究以携有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本，配制杂交组合，用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行了RAPD分析，350个十碱基随机引物在抗感池间的扩增结果显示，相引相标记OPE05₁₁₀₀可能与Pm23紧密连锁，对F₂分离群体进行RAPD分析表明，该标记与Pm23基因之间的连锁距离为10.65±3.25cM，目前国内外尚未见Pm23分子标记的报道，OPE05₁₁₀₀是Pm23的第一个分子标记，可以有效用于小麦抗病育种分子标记辅助选择中。

抗白粉病基因Pm23的标记研究
技术领域
本发明抗白粉病基因Pm23的标记研究，利用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行RAPD分析，以期找到与Pm23紧密连锁的RAPD标记，应用于分子标记辅助选择育种实践中，属于作物遗传育种学领域。
背景技术
小麦抗白粉病基因Pm23是在普通小麦栽培品种中发现的，该基因对当前我国各大麦区流行的小麦白粉菌优势小种表现免疫，并且因其载体品种为普通栽培小麦，没有不良基因的连锁累赘，所以Pm23是小麦抗白粉病育种中不可多得的一个优质抗源。该基因已被定位到5A染色体上，但到目前为止，还没能找到与之连锁的分子标记，这在一定程度上限制了它在抗病育种中的应用。
发明内容
本研究的主要目的是用集群分离分析法(BSA)对抗性基因Pm23进行RAPD和SSR分析，以期找到与Pm23紧密连锁的RAPD标记或SSR标记，应用于分子标记辅助选择育种实践中。
以带有抗病基因Pm23的小麦品系Pm23为抗病亲本，以不具有任何抗病基因的小麦品种Chancellor为感病亲本(同时也兼作感病对照)，配制杂交组合Pm23×Chancellor，F₁代自交，获得101株F₂单株作为分离群体，用于分子标记的筛选和遗传连锁分析。结果与分析
由于Pm23已被定位到5A染色体上，在实验的早期，我们首先用位于5A上的18对SSR引物在抗、感亲本和抗、感池间进行了扩增，检测结果表明，这18个引物在抗、感池间均不表现多态性。随后，我们又对79对非5A染色体的SSR引物进行筛选，亦未发现在抗、感池间表现多态性的引物。
本研究采用350个随机单引物对抗病亲本Pm23和感病亲本Chancellor进行分析。除引物S186，S210，S212，S219，OPV05没有扩增产物外，其余345个引物都能在抗感亲本间扩增出比较清晰的条带，多的可达8条带，平均4.5条，扩增片断长度在250bp～2200bp之间。经4次以上重复扩增检测，其中6个引物能在抗感亲本间稳定扩增出有差异的条带(考虑到相斥相标记在辅助选择中应用价值不大，那些能在抗感亲本间扩增出相斥相条带的引物没有重复扩增和统计在内)。这6个引物分别是S203，S109，OPE01，OPE05，OPE13和OPA06。讨论
Pm23已被定位到5A染色体上(Mcintosh等，University Extention Press，1998，Vol，5：123-127)，本实验首先用位于5A上的18对SSR引物在抗、感亲本和抗、感池间进行筛选，结果没有找到在抗感池间表现多态性的引物。随后又对79对非5A染色体的SSR引物进行筛选，亦未发现在抗感池间表现多态性的引物。推测其原因可能是目前5A染色体上SSR标记密度不高所以难以找到与Pm23相连锁的标记。
RAPD的稳定性和重复性一直是该项标记技术应用于理论研究和育种实践的最大障碍。本实验数百次的稳定性重复扩增表明，只要建立其优化的RAPD-PCR反应程序，该技术仍不失为一种很实用的分子标记技术。在本实验的早期，我们研究了影响RAPD-PCR反应重复性的因子，如：Mg²⁺浓度、引物质量、模板DNA和Taq酶质量等，结果表明，模板DNA的质量对扩增结果影响不大；合适的Mg²⁺浓度，高质量的引物和Taq酶是多次重复扩增获得一致性结果的保证。只要在实验中动作快捷，操作细心认真，保证每次扩增从样品准备到电泳检测的一致性和所用试剂和药品的质量，获得好的重复性结果是相当容易的。另外，好的扩增结果和重复性还要求操作环境洁净、低温(配置反应体系最好用冰盒)，点样前凝胶凝固时间不可过短或过长(以30分钟左右为宜)。