一种联合检测病原菌的通用型基因液相芯片.pdf

本发明涉及一种用于检测生物恐怖细菌的通用检测悬浮芯片，其中还涉及对优化改进的悬浮芯片PCR反应体系，特异性探针的设计。本发明具有开放性、灵活性、灵敏度高、检测通量大、适用于微量样品的多靶标检测等优点。

1、  一种联合检测病原菌的通用型基因液相芯片，其中所述检测芯片包括PCR反应体系，微球，捕获探针，链亲和素-藻红蛋白。

2、  权利要求1所述的基因液相芯片，其中所述PCR反应体系中使用的聚合酶为高保真酶。

3、  权利要求1所述的基因液相芯片，其中所述病原菌可以包括炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌和类鼻疽博克霍尔德菌中的一种或多种，也可以包括其它致病菌。

4、  权利要求1所述的基因液相芯片，其中所涉及的通用引物包括16S rRNA基因通用引物对341a、519b，以及其他16S rRNA、23S rRNA或16S～23S rRNA基因能对所有细菌DNA进行扩增的通用引物对。

5、  权利要求4所述的基因液相芯片，其中所述细菌通用引物以及针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌以及类鼻疽伯克霍尔德菌的属特异或种特异性探针如下：


6、  权利要求1-5任一项所述的基因液相芯片，其中所述PCR反应体系中，反应温度为50-60℃。

7、  权利要求6所述的基因液相芯片，其中所述DNA杂交温度为45-65℃。

8、  权利要求1所述的基因悬浮芯片，其中，捕获探针的获得包括以下步骤：从NCBI网站下载相关的基因序列并保存，使用DNASTAR的EditSeq子程序，将下载基因序列格式转换成*.seq文件，然后使用MegAlign子程序，将所有*.seq文件调入MegAlign，使用“Align”中的“By ClustalMethod”命令将待比较分析的序列对齐，随后进一步选取其差异序列，设计出种属特异性的探针，将得到的探针提交NCBI数据库进行同源性比较，最终针对每种靶标细菌确定位于V3可变区内的特异性最好的探针。

9、  权利要求1所述的基因悬浮芯片，其中通用引物体系的一般性PCR扩增方法包括：(1)提取待测样品或细菌的DNA作为模板；(2)按照PCR反应体系为按比例分别加入：引物341a与引物519b(10μmol/L)，Taq酶，DNA模板，ddH₂O补足；(3)按照PCR反应条件进行扩增。

一种联合检测病原菌的通用型基因液相芯片
技术领域
本发明涉及一种联合检测病原菌的通用型基因液相芯片，尤其是针对可能当做生物恐怖因子的烈性病原菌，例如炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌和类鼻疽博克霍尔德菌的快速联合检测的通用型液相芯片，本发明还涉及对上述基因液相芯片应用中所用特异性探针、PCR反应条件、聚合酶的改进。
背景技术
病原菌种类繁多。针对病原菌的检测方法多种多样，主要有传统的细菌学分离培养方法、免疫学方法以及分子生物学方法。经典检测技术分离培养、血清学凝集方法等，鉴定结果虽然准确可靠，但耗时长，每次只能确定或排除一种病原细菌，难以满足传染病和生物恐怖事件防控快速反应的技术需求。分子生物学方法包括PCR、核酸杂交等方法，可进行微量的核酸分析，但也存在一定的局限性，如很难实现微生物的高通量分析。片基式的基因芯片，可实现多病原检测，但芯片制作需要规模化，若增加或调整病原检测种类，需重新研制和制作芯片，受限于高成本和非通用性。悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片、液态芯片(liquid array，liquid chip)，利用编码微球作为反应载体，同实现一个反应体系中进行100种病原的同时检测，时间短，通量大，可实现对生物恐怖样本或传染病病料多靶标的同时筛查。
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)是急性传染病炭疽的病原体，为粗大的革兰阳性杆菌，具有强烈的致病性、传染性和生存能力。鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是严重危害人类健康的烈性传染病鼠疫的病原体，革兰氏阴性卵圆形杆菌。土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)是急性传染病土拉菌病(土拉热，兔热病)的病原体，革兰氏阴性球杆菌，致病力强，少数(10-50菌体)即可能致病。布鲁菌(Brucella)是布鲁菌病(brucellosic)的病原体，一组微小的球杆状的革兰氏阴性菌，自然界中抵抗力较强。类鼻疽博克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)是人兽共患病类鼻疽病的病原体，革兰阴性杆菌，自然界中抵抗力较强。
本发明以检测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌和类鼻疽博克霍尔德菌为例，提供一种广谱联合检测病原菌的基因液相芯片，实现病原菌的多元化、高通量筛查，对于预防和控制跨境传播传染病的传播、应对生物恐怖、维护国家和人民生命健康安全具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于为人们提供一种开放性的能灵活增删检测病原细菌的悬浮芯片通用引物检测体系，以期实现快速准确的检测。因此，除使用以上所述的16S rRNA基因通用引物对341a、519b外，其他16S rRNA、23S rRNA或16S～23S rRNA的能对所有真细菌DNA进行扩增的通用引物对均可以用于建立通用型的检测体系。
1.根据上述目的，在进行PCR扩增时，采用16S rRNA、23S rRNA或16S～23S rRNA通用引物进行扩增，且在下游引物标记生物素。
2.针对特定待检细菌PCR扩增区域内的可变区设计种或属特异性探针，连接于具有唯一光谱地址的编码微球。
3.捕获探针捕获PCR产物以及检测。
本发明选择炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌以及类鼻疽伯克霍尔德菌为病原菌或生物恐怖菌模型，以16S rRNA基因的V3可变区为靶标设计炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌以及类鼻疽博克霍尔德菌种/属特异性探针。特异性探针可参见表1。这些探针可以分别与不同编号的编码微球偶联，制备出可对上述多种细菌同时进行检测的悬浮芯片；选择细菌通用引物341a，519b(参见表1)，其中下游引物519b 5’端生物素修饰，该对通用引物作为该体系的检测引物；在应用时，使用上述引物对待检样本提取的DNA进行扩增，使扩增的PCR产物带上生物素标记，然后再将此PCR产物与上述的微球体系混合，使扩增的生物素标记的PCR产物与微球上的相应探针进行杂交从而被微球捕获，然后再与链亲和素-藻红蛋白(SA-PE)反应，通过Bio-Plex检测系统或者美国luminex公司的200_TM，100 IS System进行检测，实现对上述一至五种/属细菌的一次性检测；增加针对其他菌的探针偶联的微球，可实现更多种/属细菌的检测。
表1、检测通用引物以及探针序列
细菌通用引物以及针对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌以及类鼻疽伯克霍尔德菌的属特异或种特异性探针

因此，本发明所述的联合检测基因液相芯片包括：通用引物、PCR反应体系，编码微球，捕获探针，链亲和素-藻红蛋白(即SA-PE)。
本发明所述的改进了的PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、上下游引物、dNTP、镁离子。其中，本发明人对PCR反应体系中的聚合酶进行了筛选，本领域中普遍使用的聚合酶是由工程菌大肠杆菌进行表达然后进行提取的，在提取的时候可混有少量的大肠杆菌DNA，而本发明的PCR反应体系采用细菌通用引物，因此大肠杆菌DNA也可以被扩增，从而使阴性对照也出现扩增条带。我们筛选的结果是高保真酶，例如宝生物的premix Taq酶，，它可以满足扩增需要且阴性对照不出现扩增条带。
本发明的基因液相芯片中，所用的微球是Luminex的荧光编码微球，这些直径约5.6μm乳胶微球是由聚苯乙烯制成的大小均一的圆形微球，在其制作过程中按照严格比例掺入2种荧光染料，每种染料又有10个浓度梯度，因而根据其搭配比例不同可以将微球按照其颜色分为100种，使得每个球形基质都有独特的光谱地址。
本发明基因悬浮芯片中，所用的捕获探针为本发明人根据上述五种/属细菌的基因序列设计的探针(见表1)，并在5’端连接上15-20个T，作为与微球偶联的臂。
本发明的基因悬浮芯片中，所述的链亲和素藻红蛋白即为一种荧光蛋白，上面的亲和素可以和微球上捕获的PCR产物的生物素进行结合。
本发明还提供上述通用型基因悬浮芯片的制备方法，该方法包括：1、通用体系PCR扩增，2、捕获探针与微球偶联。
通用型PCR扩增体系：
本发明的PCR反应总体系为：Taq酶15-30μl，引物341a与引物519b(10μmol/L)各0.1-5μL，DNA模板1-5μL，ddH₂O补足50μL。
本发明优选的PCR反应总体系为：Taq酶25μl，引物341a与引物519b(10μmol/L)各2μL，DNA模板2μL，ddH₂O补足50μL。
本发明优选的反应条件如下：94℃10分钟(即min)；94℃ 30秒(即s)，58℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7min。
在确定以上的反应体系时，本发明人进行了反应温度的优化，上述反应温度可以例如是50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃。经扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检查，本发明的反应温度优选在50-58℃的范围内，均可以得到较亮的扩增条带；更优选的温度是54-60℃，最优选为58℃。
捕获探针与微球的偶联
分别选取不同编号的编码微球，例如044，031，028，046，033号的编码微球，洗涤；活化；分别加入芽孢杆菌属的探针、耶尔森菌属的探针、布鲁菌的探针、弗朗西斯菌属的探针、伯克霍尔德菌属的探针，混匀，室温下，用漩涡振荡器以200-400rpm的转速孵育30-90min；用PBST洗涤1-2次；用0.1％的SDS洗涤1-2次；得到检测芽孢杆菌属的偶联微球、检测耶尔森菌属的偶联微球、检测布鲁菌的偶联微球、检测弗朗西斯菌属的偶联微球、检测伯克霍尔德菌属的偶联微球；计数每种微球的单位体积数，确定浓度，分别于4℃下避光保存；使用时，依据检测项目选择混合的微球。
捕获探针的设计
本发明为了达到同时检测多种病原菌，对所用探针的设计进行了大量的研究和摸索，其中采用本领域常规定分子生物学软件DNAStar。在探针设计的方法中，包括下列具体步骤：从NCBI网站下载相关的基因序列并保存。使用DNASTAR的EditSeq子程序，将下载基因序列格式转换成*.seq文件，然后使用MegAlign子程序，将所有*.seq文件调入MegAlign。使用“Align”中的“By Clustal Method”命令将待比较分析的序列对齐，随后进一步选取其差异序列，设计出种属特异性的探针。将得到的探针提交NCBI数据库进行同源性比较，最终针对每种靶标细菌确定位于V3可变区内的特异性最好的探针。
本发明的基因悬浮芯片也适用于炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌和类鼻疽博克霍尔德菌五种检测因子以外的细菌的检测，下载待检测因子的16S rRNA基因序列，保存到本地磁盘中。具体步骤例如下面所述步骤：
1.下载其同属以及其他环境常见以及临床常见菌的16S rRNA基因序列，保存到本地磁盘中。
2.使用DNASTAR的EditSeq子程序，将下载基因序列格式转换成*.seq文件。
3.使用MegAlign子程序，将所有*.seq文件调入MegAlign。使用“Align”中的“By Clustal Method”命令将待比较分析的序列对齐，选取其差异序列设计种属特异性的探针。
4.将设计好的探针提交NCBI数据库进行同源性比较。
5.最终针对待检测的靶标细菌确定位于V3可变区内的特异性最好的探针。
6.同上面检测探针与微球的偶联，选择某一编号微球与探针偶联。
7.同上进行偶联微球的质控。
8.根据检测目的，混合不同编号的偶联微球。
9.样品提取核酸，同上面进行PCR反应。
10.PCR产物的捕获并检测。
附图说明
图1为土拉弗朗西斯菌的DNA浓度-荧光强度曲线；
图2为布鲁菌(M5株)的DNA浓度-荧光强度曲线；
图3为炭疽芽孢杆菌的DNA浓度-荧光强度曲线；
图4为类鼻疽伯克霍尔德菌的DNA浓度-荧光强度曲线；
图5为鼠疫耶尔森菌(EV76株)的DNA浓度-荧光强度曲线；
图6为对靶因子任意四种组合以及五种组合的复合检测结果示意图。
图1-图5中的X轴表示被检测菌的DNA浓度，Y轴表示检测荧光信号MFI。
图6中的X轴表示检测样品，Y轴表示检测微球，Z轴表示检测荧光信号MFI。
图6中：
B(blank)：PCR的空白对照做为检测样本进行检测；
X1：炭疽芽孢杆菌+鼠疫耶尔森菌+布鲁菌+土拉弗朗西斯菌；
X2：炭疽芽孢杆菌+鼠疫耶尔森菌+布鲁菌+类鼻疽伯克霍尔德菌；
X3：炭疽芽孢杆菌+鼠疫耶尔森菌+土拉弗朗西斯菌+类鼻疽伯克霍尔德菌；
X4：炭疽芽孢杆菌+布鲁菌+土拉弗朗西斯菌+类鼻疽伯克霍尔德菌；
X5：鼠疫耶尔森菌+布鲁菌+土拉弗朗西斯菌+类鼻疽伯克霍尔德菌；
X6：炭疽芽孢杆菌+鼠疫耶尔森菌+布鲁氏菌+土拉弗朗西斯菌+类鼻疽伯克霍尔德菌。
具体实施方式
实施例1：通用引物体系的一般性PCR扩增方法
1.利用常规方法提取待测样品或细菌的DNA作为模板；
2.按照PCR反应总体系为50μL量分别加入：引物341a与引物519b(10μmol/L)各2μL，Taq酶25μl，DNA模板2μL，ddH₂O补足50μL；
3.按照如下PCR反应条件进行扩增：94℃10min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃延伸7min；
4.得到PCR产物，待检。
实施例2：捕获探针与微球偶联
1.分别选取不同编号编码微球，用漩涡振荡器振荡微球悬液，使微球混合均匀。
2.分别取上述微球大约1.25×10⁶个，分别转移至离心管，14000g离心3-5Min，小心吸出上清。
3.加入50ul 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡20-30S，超声20-30s，使微球重悬。
4.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L。
5.将1ul稀释的待偶联的探针加于微球悬浮液中，振荡混匀。
6.加入2.5ul新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀。
7.用铝箔包裹离心管避光，漩涡振荡器上400-600rpm振荡，室温孵育30min。
8.再次加入新鲜配制的10mg/mL EDC。
9.再次在漩涡振荡器上400-600rpm振荡，室温避光孵育30min。
10.用0.02％PBST 1ml洗涤1次，离心14000g 3-5min.
11.移弃上清，微球重悬于1ml 0.1％SDS中，洗涤，离心。
12.移弃上清，微球重悬于100ul pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。
13.用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度。
14.把偶联好的待检微球放在4℃避光保存，一般将每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。
实施例3：捕获探针捕获待检测的PCR产物
1.取已经偶联好的检测探针每种各3500个于杂交液中，使其总量为33μl(根据微球计数结果计算相应加入量)
2.向各管中加5～17ul五种细菌混合模板的PCR产物使其终体积为50ul，吹打混匀。
3.95℃变性10min。
4.杂交温度下杂交一定时间。
5.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。
6.再向各孔加75ul 4ng/ul SA-PE的1×TMAC液，室温避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE。
7.再向各孔加入75ul 1×TMAC溶液，振荡使微球重悬。
8.反应结束后上机检测。
实施例4：对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌三种病原菌的检测
1.利用通用引物体系对待测炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌三种病原菌的DNA模板进行PCR扩增，具体方法如实施例1；得到PCR产物待检。
2.分别选取044，031，046号编码微球，洗涤；活化；分别加入芽孢杆菌属的探针、耶尔森菌属的探针、弗朗西斯菌属的探针与微球偶联，具体方法如实施例2。
3.取044，031，046号编码微球已经偶联好的检测探针每种各3500个于杂交液中，总量为33μl，加17ul五种细菌混合模板的PCR产物，其终体积为50ul，吹打混匀，变性，杂交，使捕获探针捕获待检测的PCR产物，清洗，加入SA-PE，反应后上机检测，具体方法如实施例3。
4、利用同一检测体系，样品中同时含有炭疽菌、鼠疫菌、土拉菌能够同时检出。并且针对单一检测对象如炭疽菌、鼠疫菌、土拉菌的检测灵敏度分别为2.6pg、2.6pg、0.17pgDNA。
实施例5：对炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌和类鼻疽博克霍尔德菌五种病原菌的检测
1.利用通用引物体系对待测样品或细菌的DNA模板进行PCR扩增，具体方法如实施例1；得到PCR产物待检。
2.分别选取044，031，028，046，033号编码微球，洗涤；活化；分别加入芽孢杆菌属的探针、耶尔森菌属的探针、布鲁菌的探针、弗朗西斯菌属的探针、伯克霍尔德菌属的探针，与微球偶联，具体方法如实施例2。3.取044，031，028，046，033号编码微球已经偶联好的检测探针每种各3500个于杂交液中，总量为33μl，加17ul五种细菌混合模板的PCR产物，其终体积为50ul，吹打混匀，变性，杂交，使捕获探针捕获待检测的PCR产物，清洗，加入SA-PE，反应后上机检测，具体方法如实施例3。
4.以复合体系对7株炭疽芽孢杆菌，4株鼠疫菌，5株布鲁菌，2株土拉弗朗西斯菌，2株类鼻疽伯克霍尔德菌进行检测，结果均为阳性。以复合体系对29株非目的菌进行检测，近缘的蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌与炭疽菌出现交叉反应；近缘的假结核耶尔森菌与鼠疫菌出现交叉反应；鼻疽博客霍尔德尔菌与类鼻疽伯克霍尔德菌出现交叉反应；其余环境常见菌株或肠道细菌如大肠菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、弧菌、气单胞菌、葡萄球菌等检测均为阴性。利用通用引物体系，样品中含有炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗朗西斯菌、布鲁氏菌和类鼻疽博克霍尔德菌五种病原菌中的一种、两种、三种、四种或五种，均能检出，可以实现多种细菌的联合检测。该复合体系对炭疽菌、鼠疫菌、土拉菌、布鲁菌和类鼻疽菌的检测限分别为14pg、2.2pg、0.2pg、40pg、0.8pgDNA。
实施例6：检测上述五种检测生物恐怖菌以外的细菌的通用检测方法
1.下载待检测因子的16S rRNA基因序列，保存到本地磁盘中。
2.下载其同属以及其他环境常见以及临床常见菌的16S rRNA基因序列，保存到本地磁盘中。
3.使用DNASTAR的EditSeq子程序，将下载基因序列格式转换成*.seq文件。
4.使用MegAlign子程序，将所有*.seq文件调入MegAlign。使用“Align”中的“By Clustal Method”命令将待比较分析的序列对齐，选取其差异序列设计种属特异性的探针。
5.将设计好的探针提交NCBI数据库进行同源性比较。
6.最终针对待检测的靶标细菌确定位于V3可变区内的特异性最好的探针。
7.同上面检测探针与微球的偶联，选择某一编号微球(注：体系内探针不能使用同一编号的微球进行偶联，一个检测因子必须使用一个编号的微球)与探针偶联。
8.同上进行偶联微球的质控。
9.根据检测目的，混合不同编号的偶联微球。
10.样品提取核酸，同上面进行PCR反应。
11.PCR产物的捕获检测同上。
实施例7：对生物恐怖菌的一般性定量检测
待检目的菌核酸系列稀释，一般设6个以上稀释度，同上面的PCR程序和反应条件进行PCR反应，同上面的反应进行PCR产物的检测，根据检测结果，运用Bio-Plex Version 4.0分析系统提供的方程拟合标准曲线，根据标准曲线，代入各个待测样品的MFI值，即可实现待检样品核酸的定量分析。
如鼠疫耶尔森菌DNA，系列稀释至浓度范围0.03pg-30ng，同上进行PCR反应，产物同上进行方法检测，Bio-plex 4.0分析结果得出拟合曲线，曲线方程为FI＝5.04464+(9953.98-5.04464)/((1+(Conc/1.29718)^-0.511995))^10，LOD值为2.6pg/反应体系，相当于490cfu/test。

结论
本发明的优点：
1，开放性，灵活性：本发明的检测体系是由一系列偶联上探针的微球组成，使用时候可根据检测需要，自由的选择微球进行组合，从而实现个体化的检测；另外，用户还可根据自身的检测需求，设计探针，偶联微球后进行检测。
2，灵敏：较之于普通的PCR反应，本发明具有较高的检测灵敏度，随不同的细菌，灵敏度从0.17-18.5pg。本发明灵敏度的提高从以下两个方面体现：1)检测仪器存在信号的放大系统；2)PCR产物带上的生物素与亲和素化的荧光染料藻红蛋白中的亲和素结合的放大作用。
3，检测通量大，适用于微量样品的多靶标检测：本发明通过一管PCR反应，一个孔就可同时对多靶标进行检测，根据编码微球的种类，理论上可以实现100种不同靶标的检测。
4，可定量：结合标准工作曲线，可实现对不同靶标的定量检测。
5，稳定性：各探针检测变异系数值在5.18％-17.88％，检测性能稳定，结果可靠，具有可重复性。