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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510364438.2 (22)申请日 2015.06.26 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104878014 A (43)申请公布日 2015.09.02 (73)专利权人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街61号 (72)发明人 吴佳洁刘强陈凤娟杨超 付道林 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/82(2006.01) (56)对比文件 Axel et al. “Promoters of 。
2、the Barley Germin-Like GER4 Gene Cluster Enable Strong Transgene Expression in Response to Pathogen Attack. The Plant Cell .2010, 第941页右栏第1段-945段左栏第2段， 第948页左 栏第3段-右栏第1段. Wendy.Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat. Journal of Experimental Botany .2012,17911798.。
3、 刘晓敏等.玉米逆境诱导型启动子克隆及其 植物表达载体构建. 生物技术通报 .2011,86- 90. 审查员 马骞 (54)发明名称 一种受锈菌诱导的小麦启动子 (57)摘要 本发明涉及植物基因工程技术领域， 提供了 一个受锈菌诱导的小麦启动子及其应用。 该启动 子来源于小麦类萌发素蛋白基因， 其核苷酸序列 如SEQIDNO:1所示， 长度为672bp， 发明人用含 有该启动子和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表 达 载 体 转 化 模 式 植 物 二 穗 短 柄 草 (Brachypodium)， 验证了该启动子受锈菌诱导而 增强表达。 利用该特性， 可以把该启动子应用于 麦类作物目的基因。
4、或基因片段的诱导型过量表 达或RNAi沉默研究， 以实现基因的功能分析或基 因工程育种。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图2页 CN 104878014 B 2017.10.27 CN 104878014 B 1.一种受锈菌诱导的小麦启动子， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 2.如权利要求1所述的启动子在麦类作物的基因功能分析和基因工程育种中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104878014 B 2 一种受锈菌诱导的小麦启动子 技术领域 0001 本发明涉及植物基因工程技术领域， 提供了一种受锈菌诱导的小麦启动子， 利用 该启动子可用于小麦基因工程育种等方面。
5、。 背景技术 0002 启动子是一段特定的直接与RNA聚合酶及其转录因子相结合、 决定基因转录起始 与否的DNA序列， 位于受其调控的基因上游某一固定位置， 紧邻转录起始位点， 长度一般约 为一百至一千个碱基。 根据作用方式及功能， 可将启动子分为组成型、 特异型及诱导型启动 子。 其中组成型启动子可在所有组织中启动下游基因的表达， 所启动基因的表达具有持续 性， 如编码肌动蛋白和微管蛋白等植物持家基因(housekeeping gene)的启动子； 特异型启 动子仅在特定组织或时期内具有起始转录的功能， 如种子贮藏蛋白的胚乳特异启动子。 诱 导型启动子仅在特定外界环境因素的刺激下才促使目的基。
6、因的表达模式发生变化。 虽然利 用生物信息学软件可以预测启动子包含的各类调控元件， 但是对于启动子的确切的功能分 析往往需要实验验证， 如报告基因的融合表达验证(Thilmony等， GM Crops Food， 2014,5: 36-43)， 或对启动子捕获载体(Promoter trapping)的转基因后代进行分析(Jennifer等, 2012,PLoS One,7:e41916)等。 0003 近年来， 小麦(Triticum aestivum L.)基因组学的迅速发展为小麦重要基因的分 离与功能研究提供了大量候选基因， 为进一步有效开展基因工程育种奠定了重要基础。 在 基因功能研究。
7、及基因工程改良中， 目前广泛采用的是目标基因的过量表达与RNAi沉默研 究。 玉米泛素基因(ubiquitin)启动子、 花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子等组成型启动子 是上述研究中最常用的启动子元件。 然而， 组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非 特异、 持续、 高效表达不但会造成浪费， 而且引起非目标性状或其它重要农艺性状的变化， 弱化基因工程改良的预期目标(Brunner等， Plang Biotechnol J.,2011,9:897-910； Morran等， Plang Biotechnol J.,2011,9:230-249； Risk等， Plant Biotechn。
8、ol J.,2013, 11:847-54)。 0004 利用诱导型启动子， 实现对目的基因表达模式的精细控制是解决上述问题的有效 策略。 例如在大麦中利用组成型启动子过量表达小麦TaDREB3转录因子基因， 虽然可以提高 抗冻性， 但开花时间推迟3-6周， 而利用低温诱导启动子OsWRKY71或TdCor39， 转基因大麦不 但抗冻性明显提高， 而且其它农艺性状基本不受影响(Kovalchuk等， Plant Biotechnol J.,2013,11:659-670)。 抗旱基因LcNECD1在矮牵牛中组成型表达可导致植株矮化、 种子发 芽延迟， 而利用胁迫诱导启动子rd29A驱动的过量表。
9、达， 不但可以提高抗旱性， 而且可以消 除对植株生长及种子休眠特性影响(Estrada-Melo等， Horticulture Research,2015,2: 15013)。 因此， 诱导型启动子的研究与利用在基础研究和植物基因工程育种方面具有重要 的应用价值。 0005 目前已在植物中鉴定多个诱导型启动子， 可响应高温、 低温、 干旱、 盐碱、 病原菌等 胁迫信号的刺激， 并被用于目的基因的过量表达或RNAi沉默研究。 但是锈菌诱导型启动子 说明书 1/6 页 3 CN 104878014 B 3 鲜有报道。 小麦条锈病、 叶锈病和秆锈病是世界范围内危害小麦生产的重要病害。 锈菌可通 过气。
10、流进行高空远距离传播， 造成大面积锈病流行， 危害严重年份可造成减产10-30。 抗 病品种的培育是防治小麦锈病的重要措施。 改良基因工程技术、 培育更好的抗病品种是现 有技术亟待解决的问题之一。 发明内容 0006 本发明的发明人针对上述现有技术的情况， 提供了一个受病原菌诱导的小麦启动 子及其应用。 该启动子来源于小麦类萌发素蛋白基因， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示， 长度为672bp， 发明人用含有该启动子和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组表达载体转化模式 植物二穗短柄草(Brachypodium)， 验证了该启动子受锈菌诱导而增强表达。 利用该特性， 可 以把该启动子应用于。
11、麦类作物目的基因或基因片段的诱导型过量表达或RNAi沉默研究， 以 实现基因的功能分析或基因工程育种。 0007 本发明所述的过量表达植物抗病基因(Wang等， Funct Integr Genomics,2015, 15:375-81)或沉默表达病原菌的致病基因(Wei等， Plant Biotechnol J.,2015,doi: 10.1111/pbi.12352)， 正逐渐被应用于小麦的抗病育种中， 发明人基于这种技术基础获得 了本发明的技术方案。 0008 发明人首先提供了一个受锈菌诱导的小麦启动子， 发明人将其命名为PTaGER4,其 核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。 00。
12、09 该启动子来源于小麦类萌发素蛋白基因， 可以是下述核苷酸序列之一： 0010 核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列； 0011 基本上相当于SEQ ID NO.1所示的经取代、 缺失和/或添加一个或几个核苷酸所衍 生的具有相同启动子功能的DNA序列； 0012 或者在严格条件下与SEQ ID NO.1所示限定的序列杂交且具有启动子功能的DNA 序列； 0013 可以认为在核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA序列的基础上基于不破坏其启 动子功能的合理变化都属于本发明所涵盖的范围。 0014 在获得上述启动子的基础上， 发明人将该启动子与报告基因GFP连接并重组至植 物。
13、表达载体。 利用农杆菌介导法进行二穗短柄草的遗传转化。 对转基因材料接种短柄草锈 菌， 通过对接种前后的叶片组织进行报告基因的表达分析与荧光检测， 判定PTaGER4启动子 受锈菌诱导的特性。 0015 利用上述发现的特性， 利用PTaGER4启动子开展目的基因的过量表达， 可以使目的 基因在受到病原菌诱导后增强表达， 避免了持续过量表达可能对转基因植株的生长发育或 农艺性状造成的严重影响。 0016 利用PTaGER4启动子开展目的基因的RNAi沉默研究， 可在受到病原菌诱导后抑制 目的基因的表达。 0017 综上所述， 本发明的发明人提供了一个受锈菌诱导的小麦启动子， 并验证了该启 动子受。
14、锈菌诱导而增强表达的特性， 利用该特性可以把该启动子应用于麦类作物目的基因 或基因片段的诱导型过量表达或RNAi沉默研究， 以实现基因的功能分析或基因工程育种。 说明书 2/6 页 4 CN 104878014 B 4 附图说明 0018 图1.本发明所述启动子转化二穗短柄草后， 农杆菌侵染后短柄草愈伤组织的GFP 荧光检测结果灰度图； 0019 图中C为本发明所述启动子转化后二穗短柄草， D为组成型启动子-玉米泛素启动 子转化后二穗短柄草， 由图可知， 筛选获得的短柄草愈伤组织为阳性转基因材料， 其中可观 察到明显的绿色荧光信号， 说明本发明克隆的PTaGER4序列具有启动子的功能。 002。
15、0 图2.利用本发明所述启动子获得的转基因短柄草受锈菌侵染后GFP基因的表达水 平变化结果灰度图； 0021 图2A中左侧为接种前的转基因短柄草叶片， 右侧为锈菌接种10天后的发病叶片； 0022 图2B中1和2为锈菌侵染前叶片中GFP基因的表达水平， 3和4为锈菌侵染后叶片中 GFP基因的表达水平， 0023 结果表明， 接种前叶片中的GFP基因表达量很低， 而发病后叶片中的GFP表达量明 显提高； 0024 图3.利用本发明所述启动子获得的转基因短柄草受到锈菌诱导后GFP荧光观察结 果灰度图； 0025 图中A和D为空白对照载体pIPKb001(GFP上游为多克隆位点序列)的转基因短柄 草。
16、； 0026 B和E为载体pIPKb002(玉米泛素启动子驱动GFP)的转基因短柄草； 0027 C和F为本发明所述启动子转化后的转基因短柄草； 0028 ABC为诱导前， DEF为诱导后， 0029 结果发现在不接种锈菌情况下， 空白对照(pIPKb001)没有GFP荧光信号(A)， 对照 载体(pIPKb002)的转基因短柄草叶片可见GFP荧光信号(B)， 表明本发明所使用的载体系统 可正常工作， 本发明所述启动子转化后的转基因短柄草(C)叶片中也观察到GFP荧光信号， 表明该启动子具有转录功能； 0030 锈菌接种10天后， 取发病叶片的锈菌孢子堆附近区域进行观察， 空白对照(D)及阳 。
17、性对照(E)无明显变化， 而本发明所述启动子转化后的转基因短柄草(F)叶片中的GFP荧光 信号明显增强， 表明其可受锈菌诱导而增强表达的特征。 具体实施方式 0031 以下实施例中进一步定义本发明， 根据以上的描述和这些实施例， 本领域技术人 员可以确定本发明的基本特征， 并且在不偏离本发明精神和范围的情况下， 可以对本发明 作出各种改变和修改， 以使其适用各种用途和条件。 除特殊注明外， 本发明所采用的均为本 领域现有技术。 0032 实施例1小麦GER4基因启动子的克隆： 0033 利用大麦类萌发素蛋白基因GER4c的编码序列(GenBank： 418E01)， 在小麦中国春 基因组数据库。
18、()中搜索同源序列， 通过序列拼接获得了长 度为1.4kb的序列跨叠群， 其中包含小麦GER同源基因5 端两个外显子及其上游序列。 根据 小麦同源基因的上游序列设计引物,引物末端分别添加StuI和SpeI酶切位点序列， 正向引 说明书 3/6 页 5 CN 104878014 B 5 物序列： 5 -AAAAGGCCTCTTTGCAGGCACTAACTTCATA-3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示； 反 向引物序列： 5 -TTTACTAGTTGATTTCAGCTCCTTTGGGTC-3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所 示。 0034 PCR扩增使用Phusion高保。
19、真酶(Thermo Scientific公司， 货号F-530S)。 0035 PCR扩增体系包含5Phusion HF Buffer 10 l、 10mM dNTPs 1 l、 10 mol引物2.5 l、 DMSO 1.5 l、 Phusion 5U及中国春基因组DNA 100ng， 总体积50 l。 PCR扩增条件： 98 1min； 9810s， 5830s， 721min， 35cycles； 725min。 0036 PCR产物使用天根琼脂糖凝胶回收试剂盒进行DNA纯化， 然后进行PCR产物末端加 “A” 。 反应体系10 l， 包括10Taq Buffer 1 l， 10mM d。
20、NTPs 0.5 l， Taq DNApolymerase 0.2 l， PCR回收产物8.3 l。 72反应30分钟。 0037 将加尾后的PCR产物， 通过TA克隆连接至pUC-T载体(康为世纪公司， 货号CW0802)， 转化大肠杆菌感受态细胞DH5a(康为世纪公司， 货号CW0808B)， 涂布氨苄青霉素筛选的LB固 体培养基。 培养12-16小时后， 挑取单克隆进行测序验证， 测序结果与拼接的跨叠群序列一 致， 长度为672bp。 0038 实施例2植物表达载体的构建： 0039 内含子的克隆： 0040 根据小麦WIR1基因(GenBank： M95500)设计引物， 扩增其内含子。
21、片段(151bp)， 末端 分别引入Spe I和Hind III酶切位点。 正向引物序列： 5 -TTTACTAGTGGAGCCACGGCCGTCCACG- 3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示； 反向引物序列： 5 -TTTAAGCTTTGCCTGGACGGGAAACCAT GGA-3 其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。 0041 中间载体的构建： 0042 首先， 将上步获得的小麦PTaGER4基因启动子利用StuI和SpeI进行双酶切， 然后克 隆至pUC-T载体(康为世纪公司， 货号CW0802)。 然后， 将重组质粒进行SpeI、 HindIII双酶切， 与WIR。
22、1基因内含子的酶切片段进行连接。 最后， 利用StuI、 HindIII酶切获得 “启动子-内含 子” 片段， 连接至pIPKb001载体(Himmelbach等， 2007， Plant Physiology， 145:1192-1200)。 转化大肠杆菌感受态DB3.1， 挑取菌落纯化质粒DNA， 之后利用实施例1中PTaGER4启动子的 引物(SEQ ID NO:2与NO:3所示)进行PCR扩增筛选及测序验证。 0043 目的载体的构建： 0044 选择对照载体pIPKb001、 pIPKb002及携带PTaGER4启动子的重组质粒， 利用其携带 的Gateway重组位点， 与携带绿色荧。
23、光蛋白基因(GFP)的入门载体PC445(吕波， 山东农业大 学博士论文图15， 2013)进行LR反应， 将GFP基因整合至重组质粒。 0045 LR反应体系： 目的载体(150ng/ l)1 l； 入门载体PC445(50-150ng)1 l， 水7 l； LR ClonaseTM II Enzyme Mix(Invitrogen公司， 货号11791)2 l； 25反应1h； 加入1 l Proteinase K， 37灭活10min。 反应液转化DH5感受态细胞(康为世纪公司， 货号 CW0808B)， 挑取菌落纯化质粒DNA， 利用GFP基因的引物进行PCR扩增筛选。 PCR引物序列。
24、GFP- F： 5 -CACAAGTTCAGCGTGTCCG-3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示， GFP-R： 5 - GTTCACCTTGATGCCGTTC-3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。 正确序列载体编号PC912。 0046 实施例3二穗短柄草的遗传转化及筛选验证 0047 利用农杆菌介导转化法进行二穗短柄草遗传转化。 取载体2 l， 电击转化农杆菌菌 说明书 4/6 页 6 CN 104878014 B 6 株AGL1感受态细胞。 利用OD值为0.6的农杆菌菌液侵染短柄草愈伤组织， 然后置于3层灭菌 滤纸上， 22暗培养3天。 然后置于含潮霉素40m。
25、g/L的诱愈培养基上筛选3周， 中间继代培养 一次， 培养条件为28暗培养。 如果愈伤状态较好， 可以转移到再生培养基(REM)上， 再生培 养条件为： 光照16h， 黑暗8h， 28。 待嫩叶长至1-2cm， 将其转移至含生根培养基(MS)的培养 瓶中， 使其生根。 等幼嫩植株的根长到足够健壮(2-3cm)时， 4春化1-2周， 然后移栽到土 中。 0048 取转基因短柄草的叶片提取DNA， 利用载体中GFP基因的上游序列设计引物进行 PCR扩增， 筛选阳性转基因植株。 0049 筛选对照载体pIPKb001载体转基因后代的引物为： 正向引物5 TTAAACCGAAGGCGG GAAAC3 。
26、， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示， 反向引物5 -GTTCACCTTGATGCCGTTC-3 ， 其核 苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。 0050 筛选对照载体pIPKb002载体转基因后代的引物为： 正向引物5 TAATGCCAGCCTGTT AAACG3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示， 反向引物5 -CAATTTCTGGATGCCGACA-3 ， 其 核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示； 0051 筛选载体PC912转基因后代的引物为： 正向引物5 AAAAGGCCTCTTTGCAGGCACTAACT TCATA3 ， 反向引物5 TTTACTAG。
27、TTGATTTCAGCTCCTTTGGGTC-3 ,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。 0052 短柄草愈伤组织中GFP基因的荧光检测 0053 农杆菌侵染后的短柄草愈伤组织， 于筛选培养基培养一周后， 可利用体式荧光显 微镜(徕卡， MZ10F)观察GFP基因的表达。 结果表明， 转化后的愈伤组织中明显可见绿色荧光 信号(图1)， 说明本发明公布的PTaGER4启动子序列具有正常转录功能， 可驱动下游GFP基因 的表达。 与组成型启动子-玉米泛素启动子(ubiquitin)相比， 小麦PTaGER4启动子的转录水 平略低(图1)。 0054 实施例4转基因短柄。
28、草在感染锈病情况下的GFP表达模式变化 0055 转基因短柄草病原菌接种 0056 转基因短柄草种子精选后， 胚朝下浸没在湿润的石英砂中， 23光照培养箱中培 养78d， 移栽至土壤中， 选取边长15cm的方形小花盆， 每盆种植5棵， 待植株长至7、 8片叶子 后利用短柄草锈菌F-Fl(Barbieri等， 2011， Plant Dis.， 95： 1339-1345)侵染短柄草叶片。 黑暗处理24h， 温度11， 湿度100； 然后进行正常光照培养， 光照16h、 黑暗8h， 温度15， 定期加湿， 保持叶尖有水滴， 至叶片发病为止。 0057 GFP基因表达分析 0058 转基因短柄草发。
29、病后， 分别剪取发病叶片。 利用Trizol法提取总RNA， 通过RT-PCR 检测接菌前后叶片GFP表达量的变化。 引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。 以短柄 草的Actin基因作为内参， 引物序列BdAct7-F： 5 -CCTGAAGTCCTTTTCCAGC-3 ， 其核苷酸序列 如SEQ ID NO:12所示， BdAct7-R： 5 -AGGGCAGTGATCTCCTTGC-3 ， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。 0059 PCR反应体系： 2PCR mix 10 l、 10 M引物各1.6 l、 cDNA 2 l、 总体积20 l。 PCR。
30、条 件： 942min， 9430s， 5530s， 7220s， 725min， 30cycles。 取8 l PCR产物用于1.5 琼脂糖凝胶电泳。 说明书 5/6 页 7 CN 104878014 B 7 0060 叶片GFP荧光观察 0061 转基因材料的GFP荧光观察， 取锈菌接种后发病叶片大约5mm， 轻轻刷去叶片表面 粉尘， 加水直接压片。 使用激光共聚焦显微镜(LSM 510META)， 用488nm波长激发光扫描叶 片。 用Zeiss LSM Image Browser软件处理图像。 0062 如图2所示RT-PCR结果表明， 接种前叶片中的GFP基因表达量很低， 而发病后叶。
31、片 中的GFP表达量明显提高(图2)。 0063 如图3所示， 在不接种锈菌情况下， 空白对照没有GFP荧光信号(图3A)， 对照载体 pIPKb002载体的转基因材料叶片有很强的GFP荧光信号(图3B)， 载体PC912(小麦GER基因启 动子驱动GFP)转基因材料叶片中仅能观察到非常微弱的GFP荧光信号， 受叶绿素自发荧光 (红色)的干扰较大(图3C)。 锈菌接种10天后， 取发病叶片的锈菌孢子堆附近区域进行观察， 空白对照及阳性对照无明显变化， 而载体PC912转基因材料叶片的GFP荧光信号增强。 说明书 6/6 页 8 CN 104878014 B 8 0001 序列表 1/3 页 9 CN 104878014 B 9 0002 序列表 2/3 页 10 CN 104878014 B 10 0003 序列表 3/3 页 11 CN 104878014 B 11 图1 图2 说明书附图 1/2 页 12 CN 104878014 B 12 图3 说明书附图 2/2 页 13 CN 104878014 B 13 。