樱花品种八重红枝垂和雨情枝垂的分子特异性标记引物.pdf

摘要
申请专利号：	CN201510145815.3	申请日：	20150331
公开号：	CN104762384B	公开日：	20170822
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/68,C12N15/11	主分类号：	C12Q1/68,C12N15/11
申请人：	龙游县林场
发明人：	余建国,胡耀辉,徐梁,柳新红,王青华,郭佳,徐洪峰
地址：	324400 浙江省衢州市龙游县城东五爪垅
优先权：	CN201510145815A
专利代理机构：	杭州千克知识产权代理有限公司	代理人：	冷红梅
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内容摘要

本发明涉及一对特异性高的樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的分子特异性标记引物，以及一种能对樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′‑TGAGTCCAAACCGGATACTATTC‑3′；下游引物：5′‑GACTGCGTACGAATTGACATAGTA‑3′。本发明分子特异性标记引物可对樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。

权利要求书

1.樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3′；下游引物：5′-AGCGGCCGCAAGAGAACG-3′。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”进行快速鉴定的方法。

(二)背景技术

樱花隶属于蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，是世界著名的观赏植物。目前已知樱花品种有300多个，因其株型优美、花色艳丽、整个花期延续期长，在园林上有极大的应用价值。近年来，我国各地大规模种植樱花并应用于公园、学校、街道、庭院等绿地中，成为早春主要观赏花木之一。北京、武汉、青岛、上海等城市每年纷纷举办樱花节，樱花产业得到迅猛发展，这对于建设美丽中国，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。

我国樱属植物资源丰富，分布广泛，且樱属植物表型具有较强可塑性，种间杂交容易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态分类很难快速、准确有效评价与区分。学术界对目前种植樱花品种的名称和描述都很混乱，“同物异名”或“同名异物”现象较为严重，缺乏统一规范的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此亟需建立一个科学合理的樱花品种分类鉴定系统。

目前就全国范围内的樱花品种调查和分类还仅仅是通过传统的形态学特征、过氧化物酶和酯酶同工酶技术、电镜扫描花粉粒和Q型聚类分析等方法，这些方法尽管有用，但很难对樱花品种进行正确的鉴定和应用。而近年来在植物分类界已广泛应用的DNA分子标记技术迄今尚未在樱花品种分类、品种间亲缘关系及遗传多样性等研究上得以应用。因此，有必要利用分子标记技术手段，对我国现有的樱花品种进行科学鉴别，不仅有助于樱花品种分类鉴定系统的建立，也为樱属植物资源的进一步研究提供分子依据。

目前国内引进大量的樱花品种，在北京、青岛、武汉、上海等各大公园内广泛栽植，观赏价值极高，其中以晚樱品种居多，普遍具有花量大、花色艳丽、花瓣多、花期长、抗性强、适应性广等特点。我们经过长期的调查工作，发现20个晚樱品种包括红笠(Cerasus serrulata‘Benigasa’)、红华(C.serrulata‘Kouka’)、一叶(C.serrulata‘Hisakura’)、福绿寿(C.serrulata‘Contorta’)、普贤象(C.serrulata‘Albo-rosea’)、松月(C.serrulata‘Superba’)、郁金(C.serrulata‘Grandifora’)、红丰(Cerasus×sieboldii‘Beni‐yutaka’)、御衣黄(C.serrulata‘Gioiko’)、关山(C.serrulata‘Kanzan’)、大提灯(C.serrulata‘Ojochin’)、八重红枝垂(C.spachiana‘Plena Rosea’)、市原虎尾(C.serrulata‘Albo Plena’)、咲耶姬(Cerasus×yedoensis‘Sakuyahime’)、朱雀(C.serrulata‘Shujaku’)、杨贵妃(C.serrulata‘Mollis’)、雨情枝垂(C.spachiana‘Ujou‐shidare’)、菊垂樱(C.serrulata‘Plena-pendula’)、平野妹背(C.serrulata‘Imose’)、旭山樱(C.serrulata‘Asahiyama’)在园林中的应用极其广泛，但这些品种的“同名异物”、“同物异名”现象也异常严重，从表型特征方面很难鉴别，给园林植物应用、推广以及新品种选育带来很多困难，因此着力从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实现樱花品种准确快速鉴定的科学途径。

(三)发明内容

本发明目的是提供樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的分子特异性标记引物，以及利用该对引物对樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”进行快速鉴定的方法。

本发明采用的技术方案是：

樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物：5′-TGAGTCCAAACCGGATACTATTC-3′；

下游引物：5′-GACTGCGTACGAATTGACATAGTA-3′。

该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物对樱花品种进行PCR扩增，仅“八重红枝垂”和“雨情枝垂”可获得640bp大小的特异性片段，其他樱花品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于樱花品种的鉴定(鉴定其是否为“八重红枝垂”或“雨情枝垂”之一，后续再进行进一步鉴定)，即待测样品仅限于樱花。

本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现640bp大小的DNA条带，则待测樱花品种为樱花品种“八重红枝垂”或“雨情枝垂”，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为：

上游引物：5′-TGAGTCCAAACCGGATACTATTC-3′；

下游引物：5′-GACTGCGTACGAATTGACATAGTA-3′。

本发明方法关键在于扩增引物的选择、DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。

优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下：

所述PCR扩增条件如下：95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

PCR Buffer终浓度为1×，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1×PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体系体积1/10的10×PCR Buffer。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl(pH 8.5)、500mM KCl、25mM MgCl2和1.0％Triton-X-100，溶剂为ddH2O。

具体的，所述方法如下：

(1)取待测樱花叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测樱花

叶片的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标

记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每25μL组成如下：

PCR反应条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现640bp的DNA条带，则待测樱花品种为“八重红枝垂”或“雨情枝垂”；反之则否。

本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”进行快速鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。

(四)附图说明

图1为对20种樱花品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号12和17分别为樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”，扩增出了分子量为640bp的特异DNA条带；其余编号为其它的樱花品种，未见有600bp多大小的特异DNA条带产生。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

(1)樱花品种基因组DNA的提取：

取待测樱花品种幼嫩叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得樱花品种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer，杭州，中国)后，通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro，GE Healthcare)来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

(2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：

上游引物：5′-TGAGTCCAAACCGGATACTATTC-3′和下游引物：5′-GACTGCGTACGAATTGACATAGTA-3′，由上海生物工程技术有限公司合成。

(3)PCR扩增：

PCR反应液组成：10×PCR Buffer 2.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，5U/μL Taq DNA酶0.2μL，10mM特异引物对各1μL，20ng/μL模板DNA 3μL，ddH2O补足至25μL。

扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸2min，共35个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

(4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5μg/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。

按照上述方法，分别对20个樱花品种(编号1～20代表樱花品种依次为：1、红笠(C.serrulata‘Benigasa’)、2、红华(C.serrulata‘Kouka’)、3、一叶(C.serrulata‘Hisakura’)、4、福绿寿(C.serrulata‘Contorta’)、5、普贤象(C.serrulata‘Albo-rosea’)、6、松月(C.serrulata‘Superba’)、7、郁金(C.serrulata‘Grandifora’)、8、红丰(Cerasus×sieboldii‘Beni‐yutaka’)、9、御衣黄(C.serrulata‘Gioiko’)、10、关山(C.serrulata‘Kanzan’)、11、大提灯(C.serrulata‘Ojochin’)、12、八重红枝垂(C.spachiana‘Plena Rosea’)、13、市原虎尾(C.serrulata‘Albo Plena’)、14、咲耶姬(Cerasus×yedoensis‘Sakuyahime’)、15、朱雀(C.serrulata‘Shujaku’)、16、杨贵妃(C.serrulata‘Mollis’)、17、雨情枝垂(C.spachiana‘Ujou‐shidare’)、18、菊垂樱(C.serrulata‘Plena-pendula’)、19、平野妹背(C.serrulata‘Imose’)、20、旭山樱(C.serrulata‘Asahiyama’)的PCR扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。

其中仅从编号分别为12和17的樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”中各扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为640bp的特异DNA条带，而其余编号的樱花品种，未见有600bp多大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于樱花品种“八重红枝垂”和“雨情枝垂”的鉴定，其稳定性、特异性非常高。

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510145815.3 (22)申请日 2015.03.31 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 104762384 A (43)申请公布日 2015.07.08 (73)专利权人龙游县林场地址 324400 浙江省衢州市龙游县城东五爪垅 (72)发明人余建国胡耀辉徐梁柳新红王青华郭佳徐洪峰 (74)专利代理机构杭州千克知识产权代理有限公司 33246 代理人冷红梅 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/1。

2、1(2006.01) (56)对比文件林霜霜.福建山樱花及其近缘物种的杂交试验及分子鉴定. 中国优秀硕士学位论文全文数据库 .2011,全文. Burkhardt s et.al.Detection and quantification of the antioxidant melatonin in montmor. J Aqric Food Chem .2001,4898-4902. 张琼;.樱属观赏品种资源调查及部分种与品种SSR分析. 中国优秀硕士学位论文全文数据库 .2013,全文. 审查员黄蕊 (54)发明名称樱花品种八重红枝垂和雨情枝垂的分子特异性标记引物 (57)。

3、摘要本发明涉及一对特异性高的樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的分子特异性标记引物，以及一种能对樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物： 5 -TGAGTCCAAACCGGATACTATTC-3 ；下游引物： 5 -GACTGCGTACGAATTGACATAGTA-3 。本发明分子特异性标记引物可对樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。权利要求书1页说明书4页序列表1页附图1页 CN 1047623。

4、84 B 2017.08.22 CN 104762384 B 1.樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的分子特异性标记引物，所述引物序列如下：上游引物： 5 -AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3 ；下游引物： 5 -AGCGGCCGCAAGAGAACG-3 。权利要求书 1/1 页 2 CN 104762384 B 2 樱花品种八重红枝垂和雨情枝垂的分子特异性标记引物 (一)技术领域 0001 本发明涉及樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的分子特异性标记引物以及利用该分子特异性标记引物对樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 进行快速鉴定的方法。。

5、 (二)背景技术 0002 樱花隶属于蔷薇科(Rosaceae)樱属(Cerasus)，是世界著名的观赏植物。目前已知樱花品种有300多个，因其株型优美、花色艳丽、整个花期延续期长，在园林上有极大的应用价值。近年来，我国各地大规模种植樱花并应用于公园、学校、街道、庭院等绿地中，成为早春主要观赏花木之一。北京、武汉、青岛、上海等城市每年纷纷举办樱花节，樱花产业得到迅猛发展，这对于建设美丽中国，促进农民增收，推进山区综合开发和建设社会主义新农村，都具有十分重要的意义。 0003 我国樱属植物资源丰富，分布广泛，且樱属植物表型具有较强可塑性，种。

6、间杂交容易，品种数量众多，有些品种间性状差异较小，传统形态分类很难快速、准确有效评价与区分。学术界对目前种植樱花品种的名称和描述都很混乱，“同物异名” 或 “同名异物” 现象较为严重，缺乏统一规范的名称及科学系统的分类体系，不便于品种鉴定、推广、交流及新品种的培育，因此亟需建立一个科学合理的樱花品种分类鉴定系统。 0004 目前就全国范围内的樱花品种调查和分类还仅仅是通过传统的形态学特征、过氧化物酶和酯酶同工酶技术、电镜扫描花粉粒和Q型聚类分析等方法，这些方法尽管有用，但很难对樱花品种进行正确的鉴定和应用。而近年来在植物分类界已广泛应用的DNA分子标。

7、记技术迄今尚未在樱花品种分类、品种间亲缘关系及遗传多样性等研究上得以应用。因此，有必要利用分子标记技术手段，对我国现有的樱花品种进行科学鉴别，不仅有助于樱花品种分类鉴定系统的建立，也为樱属植物资源的进一步研究提供分子依据。 0005 目前国内引进大量的樱花品种，在北京、青岛、武汉、上海等各大公园内广泛栽植，观赏价值极高，其中以晚樱品种居多，普遍具有花量大、花色艳丽、花瓣多、花期长、抗性强、适应性广等特点。我们经过长期的调查工作，发现20个晚樱品种包括红笠(Cerasus serrulata Benigasa )、红华(C.serrulata Kouk。

8、a )、一叶(C.serrulata Hisakura )、福绿寿(C.serrulata Contorta )、普贤象(C.serrulata Albo-rosea )、松月(C.serrulata Superba )、郁金(C.serrulata Grandifora )、红丰(Cerasussieboldii Beni yutaka )、御衣黄(C.serrulata Gioiko )、关山(C.serrulata Kanzan )、大提灯 (C .serrulata Ojochin )、八重红枝垂(C .spachiana Plena Rosea )、市原虎尾。

9、(C.serrulata Albo Plena )、咲耶姬(Cerasusyedoensis Sakuyahime )、朱雀 (C.serrulata Shujaku )、杨贵妃(C.serrulata Mollis )、雨情枝垂(C.spachiana Ujou shidare )、菊垂樱(C.serrulata Plena-pendula )、平野妹背(C.serrulata Imose )、旭山樱(C.serrulata Asahiyama )在园林中的应用极其广泛，但这些品种的 “同名异物” 、“同物异名” 现象也异常严重，从表型特征方面很难鉴别，给园林植物应用。

10、、推广以及新品种选育带来很多困难，因此着力从分子水平上开发出这些品种稳定、特异的DNA指纹标记才是实说明书 1/4 页 3 CN 104762384 B 3 现樱花品种准确快速鉴定的科学途径。 (三)发明内容 0006 本发明目的是提供樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的分子特异性标记引物，以及利用该对引物对樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 进行快速鉴定的方法。 0007 本发明采用的技术方案是： 0008 樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的分子特异性标记引物，所述引物序列为： 0009 上游引物： 5 -TGAGTCCAAACCGGATACTAT。

11、TC-3 ； 0010 下游引物： 5 -GACTGCGTACGAATTGACATAGTA-3 。 0011 该引物对是采用PCR技术，经过大量筛选试验获得樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的特异性DNA片段之后，将该片段克隆测序，以得到的DNA序列为基础设计特异性引物，以该特异性引物对樱花品种进行PCR扩增，仅 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 可获得640bp 大小的特异性片段，其他樱花品种均不能获得特异性片段。需要说明的是，本发明分子特异性标记引物仅限于樱花品种的鉴定(鉴定其是否为 “八重红枝垂” 或 “雨情枝垂” 之一，后续再进行进一步鉴定)，即待。

12、测样品仅限于樱花。 0012 本发明还涉及一种利用所述的分子特异性标记引物对樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现640bp大小的DNA条带，则待测樱花品种为樱花品种 “八重红枝垂” 或 “雨情枝垂” ，反之则否；所述分子特异性标记引物序列为： 0013 上游引物： 5 -TGAGTCCAAACCGGATACTATTC-3 ； 0014 下游引物： 5 -GACTGCGTACGAATTGACATAG。

13、TA-3 。 0015 本发明方法关键在于扩增引物的选择、 DNA提取、 PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，均可按照本领域常规方法进行。 0016 优选的，本发明所述PCR扩增体系组成如下： 0017 0018 所述PCR扩增条件如下： 95预变性3min； 95变性40s， 55退火40s， 72延伸 2min，共35个循环；最后于72补平7min，终止温度为4。 0019 PCR Buffer终浓度为1，是指PCR Buffer中各组分在反应体系中的浓度与1 说明书 2/4 页 4 CN 104762384 B 4 PCR Buffer相同，通常选用体积为反应体。

14、系体积1/10的10PCR Buffer。 10PCR Buffer 成分为： 100mM Tris-HCl(pH 8.5)、 500mM KCl、 25mM MgCl2和1.0Triton-X-100，溶剂为 ddH2O。 0020 具体的，所述方法如下： 0021 (1)取待测樱花叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测樱花 0022 叶片的基因组DNA； 0023 (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标 0024 记引物作为扩增引物，进行PCR扩增： 0025 PCR反应体系每25 L组成如下： 0026 0027 0028 PCR反应条件如下：。

15、 0029 95预变性3min； 95变性40s， 55退火40s， 72延伸2min，共35个循环；最后于 72补平7min，终止温度为4；； 0030 (3)取步骤(2)扩增产物5 L，与1 L 0.25溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5的琼脂糖凝胶上，于1TAE缓冲液中、 5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现640bp的DNA条带，则待测樱花品种为 “八重红枝垂” 或 “雨情枝垂” ；反之则否。 0031 本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 进行快速。

16、鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。 (四)附图说明 0032 图1为对20种樱花品种进行PCR扩增的结果； M为DNA分子量标准；编号12和17分别为樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” ，扩增出了分子量为640bp的特异DNA条带；其余编号为其它的樱花品种，未见有600bp多大小的特异DNA条带产生。 (五)具体实施方式 0033 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：说明书 3/4 页 5 CN 104762384 B 5 0034 实施例1： 0035 (1)樱花品种基因组DNA的。

17、提取： 0036 取待测樱花品种幼嫩叶片0.01g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用SDS- CTAB法，经多次抽提，来提取获得樱花品种的基因组DNA粗提物。 DNA粗提物再经Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化(博日Bioer，杭州，中国)后，通过1.5的琼脂糖凝胶电泳和DNA/ RNA紫外分光光度计(GeneQuant Pro， GE Healthcare)来检测完整性、纯度及浓度。 OD260/ OD2801.8的DNA样品用于后续PCR扩增。 DNA提取物于-20冰箱贮藏备用。 0037 (2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为： 0038 上游引物。

18、： 5 - T G AG T C C A A A C C G G A T A C T A T T C - 3 和下游引物： 5 - GACTGCGTACGAATTGACATAGTA-3 ，由上海生物工程技术有限公司合成。 0039 (3)PCR扩增： 0040 PCR反应液组成： 10PCR Buffer 2.5 L， 10mmol/L dNTPs 2.5 L， 25mmol/L MgCl22.5 L， 5U/ L Taq DNA酶0.2 L， 10mM特异引物对各1 L， 20ng/ L模板DNA 3 L， ddH2O补足至25 L。 0041 扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。。

19、扩增条件： 95预变性3min； 95变性40s， 55 退火40s， 72延伸2min，共35个循环；最后于72补平7min，终止温度为4。 0042 (4)电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5 L，与1 L 0.25溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5的琼脂糖凝胶上，于1TAE缓冲液中， 5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含0.5 g/ mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照相。 0043 按照上述方法，分别对20个樱花品种(编号120代表樱花品种依次为： 1、红笠 (C.serrulata Benigasa )、 2。

20、、红华(C.serrulata Kouka )、 3、一叶(C.serrulata Hisakura )、 4、福绿寿(C.serrulata Contorta )、 5、普贤象(C.serrulata Albo- rosea )、 6、松月(C.serrulata Superba )、 7、郁金(C.serrulata Grandifora )、 8、红丰 (Cerasussieboldii Beni yutaka )、 9、御衣黄(C.serrulata Gioiko )、 10、关山 (C .serrulata Kanzan )、 11、大提灯(C .serrulat。

21、a Ojochin )、 12、八重红枝垂 (C.spachiana Plena Rosea )、 13、市原虎尾(C.serrulata Albo Plena )、 14、咲耶姬 (Cerasusyedoensis Sakuyahime )、 15、朱雀(C.serrulata Shujaku )、 16、杨贵妃 (C.serrulata Mollis )、 17、雨情枝垂(C.spachiana Ujoushidare )、 18、菊垂樱 (C.serrulata Plena-pendula )、 19、平野妹背(C.serrulata Imose )、 20、旭山樱 (。

22、C.serrulata Asahiyama )的PCR扩增图谱进行电泳检测，结果见图1。 0044 其中仅从编号分别为12和17的樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 中各扩增出了一条清晰明亮、稳定的分子量约为640bp的特异DNA条带，而其余编号的樱花品种，未见有 600bp多大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的分子特异性标记引物用于樱花品种 “八重红枝垂” 和 “雨情枝垂” 的鉴定，其稳定性、特异性非常高。说明书 4/4 页 6 CN 104762384 B 6 0001 序列表 1/1 页 7 CN 104762384 B 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 104762384 B 8 。

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