技术领域
本发明涉及促红细胞生成素生产技术领域，尤其涉及一种通过逆向灌注方式高效生产促红细胞生成素的方法。
背景技术
促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一种促进红系祖细胞的增殖、分化和红细胞成熟的糖蛋白激素，由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌，进入血液循环，作用于骨髓中的红系祖细胞，促进红细胞生成。人体缺氧时，此种激素产生应激增加，致使红细胞加快生成，增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比），改善缺氧症状。在基因重组技术诞生之前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，得率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定，亦无法大规模应用。应用DNA重组技术将红细胞生成素的基因构建到中国仓鼠卵巢细胞中（CHO细胞），通过工程细胞培养表达，纯化精制后得到基因工程重组蛋白EPO，主要用于治疗因长期接受肾透析而导致的恶性贫血症，还可用于改善癌症病人因做化疗或其他手术等所引起的贫血症。1990年初入市场的EPO在全球只拿到了2亿美元年销售额。但时隔15年后，其在2004年全球总销售额已达惊人的119亿美元，销售额增长了60倍，并因此成为世界上第一只销售额突破百亿美元的生物工程药品。据DATAMONITOR咨询公司的一份报告预测，到2015年，全球EPO市场将达143亿～150亿美元，总体呈上升趋势。
动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已成为当今生物制药领域中的主流技术，动物细胞培养工业化最关键的技术是使细胞的培养条件达到最优化,尽可能消除或减轻培养环境对细胞的影响,维持细胞高活力和提高细胞密度，达到大规模化程度。目前进行促红细胞生成素生产中，培养的CHO细胞的生物反应器主要是传统的固定床生物反应器，其原理在于将片状纤维载体置于生物反应器中间，并使其固定进行细胞培养。细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，并靠生物反应器的底部搅拌产生的负压迫使培养基不断从上而下流经载体。细胞培养是通过搅拌器将培养基循环供给至贴附在片状载体上的细胞，以达致营养成分和溶氧的传递；但随着细胞的增殖，片状载体的重量也随之增加而使载体与载体之间的接触面积增大，从而使实际细胞扩增面积减少，这时，现有的细胞培养技术中的灌注方式及搅拌方式就不能保证培养基和溶氧得到及时的供给，导致细胞因局部密集而呈现生长速度不一及死细胞的比例增加，直接影响整个扩增和表达，最终导致促红细胞生成素的产量减少。因此，大规模细胞培养生产促红细胞生成素工艺的重点和难点在于如何使营养成分能够进行充分的交换，减少乳酸、氨离子、二氧化碳、甲基乙二醛等的有毒代谢产物的积累，优化细胞培养环境。
发明内容
本发明可解决目前促红素生产中细胞培养技术无法突破最大14L培养规模瓶颈的技术难题，提高CHO细胞培养过程中促红素表达的细胞培养规模和产量，从而提供一种可使营养成分充分交换、减少有毒代谢产物积累并且使固定床生物反应器的培养规模可达100L的促红细胞生成素的生产方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种高效生产促红细胞生成素的方法，包括以下步骤：
将载体和CHO细胞悬液加入已灭菌的生物反应器中，然后加入含血清培养基，并将生物反应器的转速设为100-250rpm，培养细胞12-24h。
优选的，接种后的生物反应器内的CHO细胞的细胞浓度大于0.5×105cell/mL，更优选的细胞浓度为0.5-5×105cell/mL；所述载体的用量为10-40g/L。
优选的，所述含血清培养基为含10%牛血清DEMA培养基；所述载体为聚酯片。
优选的细胞培养条件为：压力≤0.2MPa，溶氧量为30-80%，pH为7.0-7.4，温度为35-38℃。
（2）由生物反应器的底部向上连续逆流灌注含血清培养基，使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度保持在1.5g/L以上；当糖的日消耗量≧100g/d时，停止含血清培养基培养。
优选的，生物反应器先以常速搅拌6-24h后，再将转速提高至高速并搅拌1-10min，然后再调回常速。优选的，常速为100-250rpm，高速为300-500rpm。更优选的，常速为200rpm，高速为300rpm。
优选的，每天提高转速1-4次。
（3）将生物反应器中的含血清培养基更换为无血清培养基，培养细胞6-12h。
优选的，将生物反应器内的含血清培养基排空后再加入无血清培养基。
优选的，所述无血清培养基由基础培养基和添加剂组成；基础培养基由质量份额比为1:9的DMEM培养基和CHO-S-SFMⅡ培养基组成；添加剂及其用量为D-半乳糖250mg/L、D-甘露糖250mg/L、N-乙酰氨基葡萄糖250mg/L、D-葡萄糖1-3g/L和正丁酸钠1.0mmol/L。
优选的细胞培养条件为：压力≤0.2MPa，溶氧量为30-80%，pH为7.0-7.4，温度为35-38℃。
（4）由生物反应器的底部向上连续逆流灌注无血清培养基，使生物反应器内的无血清培养基的糖浓度保持在1.5g/L以上；培养细胞至细胞收获液的体外活性<3000IU/mL；
优选的，生物反应器先以100-250rpm的转速搅拌6-24h后，再将转速提高至300-500rpm并保持1-10min，然后再调回100-250rpm。
优选的，每天提高转速1-4次。
（5）细胞收获液经分离、纯化得EPO。
优选的，细胞收获液依次通过亲和层析、DEAE离子交换层析、反相层析和凝胶过滤层析，分离纯化得到EPO。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过由生物反应器底部向上逆流灌注培养基，从而保障新鲜的培养基可均匀到达各载体间隙，使营养物质可进行充分、及时的交换，可避免细胞生长速度不一和死细胞比例增加的问题。在培养过程中，通过采用100-250rpm的转速，并间隔将转速提高至300-500rpm且保持一定时间，使载体不断的翻转从而可与新鲜培养基进行更充分的接触，进一步保障营养物质可进行充分、及时的交换，从而避免因接触面积增大而致使局部细胞密度减少、细胞分布不均匀的问题。通过逆流灌注培养基和循环调整转速，可减少乳酸、氨离子、二氧化碳和甲基乙二醛等有毒代谢产物的积累，并且细胞培养规模可达100L，从而提高产量，降低了EPO的生产成本。
附图说明
图1为实施例4、19、20和比较例1生产的EPO中唾液酸含量的对比；
图2为实施例4、19、20和比较例1中细胞收获液与传统方法生产的EPO对照品的中高唾液酸EPO比重的对比；
图3为HPLC检测实施例4、19、20和比较例1生产的EPO的纯度的对比；
图4为实施例4、19、20生产的EPO与传统培养方法生产的EPO对照品的肽图对比；
图5为实施例4、19、20和比较例1的每一亚批（每100L细胞收获液为一亚批）的EPO表达量；
图6为实施例4、19、20和比较例1中无血清培养基培养天数及对应的糖的日消耗量。
具体实施方式
为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
含血清培养基：10%牛血清DEMA培养基。
无血清培养基：由基础培养基和添加剂组成。其中，基础培养基由质量份额比为1:9的DMEM培养基和CHO-S-SFMⅡ培养基组成；添加剂及其用量为D-半乳糖250mg/L、D-甘露糖250mg/L、N-乙酰氨基葡萄糖250mg/L、D-葡萄糖1-3g/L和正丁酸钠1.0mmol/L。
载体：聚酯片。
实施例1-16
第一阶段：含血清培养基培养阶段。
CHO细胞复苏后，经培养制备成细胞悬液，备用。
向30L装有载体且已高温高压灭菌的生物反应器中加入含血清培养基。同时将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度37℃，pH7.20，DO50%，常速搅拌，罐内压力≤0.2Mpa。然后接种CHO细胞，使罐内细胞浓度达到一定量，并补给含血清培养基至罐内载体、细胞悬液和培养基的总体积等于生物反应器的工作体积，开始进行细胞固定培养。
完成细胞固定培养后，由生物反应器的底部向上连续逆流灌注含血清培养基，进行细胞灌注培养。其中，逆流灌注的流量为0.5-3.0L/h，旧培养基的排出流量为0.5-3.5L/h，且旧培养基的排出流量大于逆流灌注的流量，并使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度保持在1.5g/L以上。在灌注培养过程中，先以常速搅拌培养一段时间（记为常速时间），然后将转速提高至高速并保持一段时间（记为高速时间），接着再将转速重新调回常速。每天提高转速几次，使罐内的载体不断翻转。当生物反应器加入含血清培养基流量＞3.0L/h，糖的日消耗量≧200g/d时，停止含血清培养基培养。
第二阶段：无血清培养基培养阶段。
将罐内的含血清培养基排空，然后加入无血清培养基至生物反应器的工作体积，并将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度37℃，pH7.20，DO50%，常速搅拌，罐内压力≤0.2Mpa，开始进行细胞无灌注培养。
完成细胞无灌注培养后，由生物反应器的底部向上连续逆流灌注无血清培养基，进行细胞灌注培养。其中，逆流灌注的流量为0.5-3.0L/h，旧培养基的排出流量为0.5-3.5L/h，且旧培养基的排出流量大于逆流灌注的流量，并使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度保持在1.5g/L以上。在灌注培养过程中，先以常速搅拌培养一段时间（记为常速时间），然后将转速提高至高速并保持一段时间（记为高速时间），接着再将转速重新调回常速。每天提高转速几次，使罐内的载体不断翻转。
当细胞收获液的体外活性＜3000IU/mL，终止表达培养，下罐。
所述细胞收获液为无血清培养基培养阶段中排出的旧培养基。
第三阶段：EPO的分离、纯化。
根据现有的分离、纯化技术，将细胞收获液依次经亲和层析、DEAE-离子交换层析、反相层析和凝胶过滤层析，分离纯化得到EPO终产物。
在其它实施方案中，在含血清培养基培养阶段和无血清培养基培养阶段，还可将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度35-38℃，pH7.0-7.4，DO30-80%，罐内压力≤0.2Mpa。
实施例1-16中的各工艺参数如表1和表2所示。
表1含血清培养基培养阶段的工艺条件
表2无血清培养基培养阶段的工艺条件
实施例17
本实施例与实施例1的操作流程相同，不同之处为将30L的生物反应器改为60L的生物反应器，载体的用量为1200g，含血清培养基培养细胞至糖的日消耗量≧420g/d时，停止含血清培养基培养。
实施例18
本实施例与实施例1的操作流程相同，不同之处为将30L的生物反应器改为80L的生物反应器，载体的用量为1600g。含血清培养基培养细胞至糖的日消耗量≧560g/d时，停止含血清培养基培养。
实施例19
本实施例与实施例1的操作流程相同，不同之处为将30L的生物反应器改为100L的生物反应器，载体的用量为2000g。含血清培养基培养细胞至糖的日消耗量≧700g/d时，停止含血清培养基培养。
实施例20
第一阶段：含血清培养基培养阶段。
CHO细胞复苏后，经培养制备成细胞悬液，备用。
向30L装有1000g载体且已高温高压灭菌的生物反应器中加入含血清培养基。同时将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度37℃，pH7.20，DO50%，转速为150rpm，罐内压力≤0.2Mpa。然后接种CHO细胞，使罐内细胞浓度为3×105cell/mL，并补给含血清培养基至罐内载体、细胞悬液和培养基的总体积等于生物反应器的工作体积，开始进行24h细胞固定培养。
完成细胞固定培养后，由生物反应器的底部向上连续逆流灌注含血清培养基，进行细胞灌注培养。其中，逆流灌注的流量为0.5-3.0L/h，旧培养基的排出流量为0.5-3.5L/h，且旧培养基的排出流量大于逆流灌注的流量，并使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度保持在1.5g/L以上。当生物反应器加入含血清培养基流量＞3.0L/h，糖的日消耗量≧200g/d时，停止含血清培养基培养。
第二阶段：无血清培养基培养阶段。
将罐内的含血清培养基排空，然后加入无血清培养基至生物反应器的工作体积，并将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度37℃，pH7.20，DO50%，常速搅拌，罐内压力≤0.2Mpa，开始进行6h细胞无灌注培养。
完成细胞无灌注培养后，由生物反应器的底部向上连续逆流灌注无血清培养基，进行细胞灌注培养。其中，逆流灌注的流量为0.5-3.0L/h，旧培养基的排出流量为0.5-3.5L/h，且旧培养基的排出流量大于逆流灌注的流量，并使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度保持在1.5g/L以上。当细胞收获液的体外活性＜3000IU/mL，终止表达培养，下罐。
第三阶段：EPO的分离、纯化。
细胞收获液依次经亲和层析、DEAE离子交换、反相层析和凝胶过滤，分离纯化得到EPO终产物。
比较例1
第一阶段：含血清培养基培养阶段。
CHO细胞复苏后，经培养制备成细胞悬液，备用。
向14L装有400g载体且已高温高压灭菌的生物反应器中加入含血清培养基。同时将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度37℃，pH7.20，DO50%，转速为150rpm，罐内压力≤0.2Mpa。然后接种CHO细胞，使罐内细胞浓度为0.5×105cell/mL，并补给含血清培养基至罐内载体、细胞悬液和培养基的总体积等于生物反应器的工作体积，开始进行持续24h的细胞固定培养。
完成细胞固定培养后，由生物反应器的上部向下连续灌注含血清培养基，进行细胞灌注培养。其中，连续灌注的流量为0.1-1.0L/h，旧培养基的排出流量为0.2-1.1L/h，且连续灌注的流量小于旧培养基排出的流量，并通过调整连续灌注的流量使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度≧1.5g/L。当连续灌注的流量为>1.0L/h，糖的日消耗量≧100g/d时，停止含血清培养基培养。
第二阶段：无血清培养基培养阶段。
将罐内的含血清培养基排空，然后加入无血清培养基至生物反应器的工作体积，并将生物反应器的细胞培养条件分别设为：温度37℃，pH7.20，DO50%，常速搅拌，罐内压力≤0.2Mpa，开始进行持续6h的细胞无灌注培养。
完成细胞无灌注培养后，由生物反应器的上部向下连续灌注无血清培养基，进行细胞灌注培养。其中，连续灌注的流量为0.1-1.0L/h，旧培养基的排出流量为0.2-1.1L/h。当细胞收获液的体外活性＜3000IU/mL，终止表达培养，下罐。
第三阶段：EPO的分离、纯化。
细胞收获液依次经亲和层析、DEAE离子交换、反相层析和凝胶过滤，分离纯化得到EPO终产物。
比较例2
本比较例与比较例1的操作流程相同，不同之处为将14L的生物反应器改为30L的生物反应器，载体的用量为600g，接种CHO细胞后，罐内的细胞浓度为0.8×105Cell/mL，连续灌注的流量为0.5-3.0L/h，旧培养基的排出流量为0.5-3.5L/h，且连续灌注的流量小于旧培养基排出的流量，并通过调整连续灌注的流量使生物反应器内的含血清培养基的糖浓度≧1.5g/L。当连续灌注的流量>3.0L/h，糖的日消耗量≧200g/d时，停止含血清培养基的培养。
实施例1-20和比较例1-2生产EPO的产量、单产时间及生产的EPO的各参数如下表3所示。
表3实施例1-20和比较例1-2生产EPO的产量、单产时间及生产的EPO的各参数
单产时间是指EPO的平均日产量。
实施例1-20和比较例1-2生产的EPO的外源性DNA残留量＜100pg/10000IU，CHO细胞蛋白质残留量＜0.01%，细菌内毒素<1EU/10000IU。
此外，将实施例4、19、20和比较例1的细胞收获液及所生产的EPO分别进行以下测试：a、唾液酸含量对比；b、细胞收获液及传统方法生产的EPO对照品的中高唾液酸EPO比重的对比；c、HPLC检测EPO纯度对比；d、生产的EPO与传统培养方法生产的EPO对照品的肽图对比；e、每一亚批（每100L细胞收获液为一亚批）的EPO表达量对比；f、无血清培养基培养天数及糖的日消耗量对比。测试结果如图1-6所示。
图1中A代表比较例1，B代表实施例20，C代表实施例4，D代表实施例19。结果显示，逆向灌注方式与循环调整转速相结合培养能提高EPO中的唾液酸含量。
图2中A代表实施例19，B代表传统培养方法生产的EPO对照品，C代表比较例1，D代表实施例20，E代表实施例4。结果显示，逆向灌注方式与循环调整转速相结合培养能增加细胞收获液中高唾液酸EPO的比重。
图3中A代表实施例19，B代表实施例4，C代表实施例20，D代表比较例1。结果显示，逆向灌注方式与循环调整转速相结合培养的产物与传统方法培养的EPO在同一位点出现，所得产物为EPO，纯度≥98%。
图4中A代表传统培养方法生产的EPO对照品，B代表实施例19，C代表实施例4，D代表实施例20，E代表比较例1。结果显示，逆向灌注方式与循环调整转速相结合培养的产物与传统方法培养的EPO的肽图分析一致，所得产物为EPO。
图5和图6中，A代表比较例1，B代表实施例20，C代表实施例4，D代表实施例19。结果显示，逆向灌注方式与循环调整转速相结合培养能增加细胞收获液中EPO的表达量，同时，在表达培养过程中符合糖浓度≥1.5g/L，表明细胞状态是良好的。
根据反复多次的试验及上述实施例和比较例生产EPO的数据，总结如下：由实施例4、20与比较例1-2比较可知，通过逆向灌注的方式进行培养，不仅可实现30L的细胞培养规模，还可提高EPO的产量、纯度等各指标；逆向灌注方式与循环调整转速相结合，可显著提高EPO的产量，唾液酸的含量及体内比活性等。由实施例9-16可知，在含血清培养基培养阶段和无血清培养基培养阶段中，常速搅拌的时间和转速的选择，以及高速搅拌的时间、转速和搅拌次数对EPO的产量及其它参数均都有显著的影响。当常速搅拌的转速高于250rmp时，或高速搅拌的转速高于500rmp，或高速搅拌的时间过长及高速搅拌次数过多时，会使原本附着的细胞容易脱落，导致收获产物减少。因此，常速搅拌为100-250rmp，高速搅拌为300-500rmp，搅拌时间1-10min，以及每天加速搅拌次数1-4次相配合，既可使营养成分进行充分的交换，又可避免细胞脱落，从而可提高细胞培养的规模，突破传统的细胞培养技术的14L培养规模的瓶颈，并且还可提高EPO的产量、单产时间以及其它指标。由实施例19可知，当细胞培养规模到达100L时，仍能保持较高的单产时间，与30L的细胞培养规模相比，单产时间只降低了0.04g/d。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。