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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510066111.7 (22)申请日 2015.02.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104805018 A (43)申请公布日 2015.07.29 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: M 2015054 2015.01.22 (73)专利权人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市黄埔大道西601 号 (72)发明人 莫测辉赵海明李彦文蔡全英 李慧杜欢林静冯乃宪 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 。
2、任重 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (56)对比文件 US 2010/0233146 A1,2010.09.16, CN 102154173 A,2011.08.17, 张孝龙等.两株高效苯酚降解菌的筛选、 鉴 定及生物强化-DTRO 组合工艺初步验证. 微生 物学通报 .2014,第41卷(第11期),第2264-2274 页. 骆祝华等.环境内分泌干扰物邻苯二甲 酸酯的生物降解研究进展. 应用与环境生物学 报 .2008,第14卷(第6期),第890-897页. Yuan Shaw。
3、-Ying等.Biodegradation of dibutyl phthalate and di-(2-ethylhexyl) phrhalate and microbial community changes in mangrove sediment. Journal of Hazardous Materials .2010,第184卷(第1-3 期),第826-831页. 审查员 邓旭 (54)发明名称 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉 菌(Agromyces sp )MT-E (57)摘要 本发明属于环境污染物生物处理技术领域， 具体公开了一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯 的壤霉菌(。
4、Agromycessp.)MT-E。 所述菌株于 2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 保藏编号为CCTCCNO： M2015054。 该菌 能够以DBP和DEHP为唯一碳源进行好氧降解， 在 分别含有200mg/L的DBP和DEHP为唯一碳源的无 机盐培养基中7天的降解率分别可达97.06%和 86.25%。 将该菌接种于污染土壤10天后， 土壤中 DBP和DEHP的降解率分别可达77.29%和55.51%， 其高效的降解速率说明该菌在PAEs污染的土壤 修复中具有良好的应用前景。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图4页 CN 104805018 B。
5、 2017.09.01 CN 104805018 B 1.一株壤霉菌(Agromyces sp.)菌株MT-E， 所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典型 培养物保藏中心 （CCTCC） ， 保藏编号为CCTCC M 2015054。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104805018 B 2 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp )MT-E 技术领域 0001 本发明涉及环境污染物生物处理技术领域， 具体地， 涉及一株新型邻苯二甲酸酯 降解菌， 更具体地， 涉及一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT- E。 背景技术 000。
6、2 邻苯二甲酸酯， 又称酞酸酯， 缩写PAEs， 是邻苯二甲酸形成的酯的统称。 其中， 邻苯 二甲酸二丁酯 （di-n-butylphthalate， DBP） 和邻苯二甲酸二异辛酯 （di-(2-ethylhexyl) phthalate， DEHP） 是两种最广泛使用的塑料增塑剂， 在PVC塑料中其含量可达4060%。 近几 十年来， 我国塑料大棚和农膜使用量急剧增加。 随着塑料薄膜的大量使用， 越来越多的DBP 和DEHP被释放进入农田土壤， 它们已成为在农田土壤中最常被检出的有机污染物， 检测级 别达到mg/kg。 研究表明， 这两种邻苯二甲酸酯具有高毒性， 致畸性、 致癌性和致突变性。
7、， 以 及生殖毒性， 已被美国环境保护局 （EPA） 列为优先控制污染物。 因此， 我国农业土壤中的DBP 和DEHP污染问题亟待解决。 0003 由于这两种邻苯二甲酸酯的化学稳定性很好， 自然条件下通过光解、 水解等化学 作用消失的速率非常缓慢， 其半衰期长达20 年之久， 绝大部分的DBP和DEHP主要是通过生 物降解途径从环境中消失。 其中微生物降解具有成本低， 条件温和， 不产生二次污染等优 点， 符合构建环境友好型及资源节约型社会的要求与发展趋势。 因此， 利用微生物的降解作 用将DBP和DEHP转化为无害物质是去除环境中邻苯二甲酸酯污染的最佳手段。 0004 目前， 国内外学者已分。
8、别针对DBP和DEHP筛选出许多具有良好降解性能的菌株， 但 其中能够同时降解这两种邻苯二甲酸酯的菌株很少。 壤霉菌 （Agromycessp. ） 是土壤中广泛 存在的一类菌属， 目前有报道该菌属的某些菌种具有可高效降解苯酚、 农药噻虫嗪及耐重 金属的特性， 但尚未见其可降解邻苯二甲酸酯的报道。 发明内容 0005 本发明为了克服现有技术的上述不足， 提供一株新型邻苯二甲酸酯降解菌。 0006 为了实现上述目的， 本发明是通过以下方案予以实现的： 0007 一株壤霉菌(Agromycessp.)菌株MT-E， 所述菌株于2015年1月22日保藏在中国典 型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 。
9、保藏编号为CCTCC NO: M 2015054， 保藏地址为： 中国武汉武汉 大学， 菌株分类命名为Agromycessp. MT-E。 0008 本发明所述壤霉菌(Agromycessp.)菌株MT-E是从常年使用塑料大棚的农田土壤 中分离筛选获得的， 该菌株可同时高效降解DBP和DEHP， 因此本发明补充了邻苯二甲酸酯降 解菌的种质资源， 也为进一步研发PAEs污染的农田土壤的生物修复技术提供了科学依据， 具有广泛的应用潜力。 0009 壤霉菌(Agromycessp.)菌株MT-E在牛肉膏蛋白胨培养基 （LB） 上划线培养7天， 菌 说明书 1/5 页 3 CN 104805018 B。
10、 3 落呈暗黄色、 扁平、 湿润、 边缘不平整、 扩散生长， 七天后几乎铺满平板。 扫面电子显微镜下 呈短杆状， 长约0.81.5微米， 宽约0.30.5微米。 经生理生化检测， 该菌为革兰氏阳性菌。 另 外， 该菌株的最适生长条件为： 温度3035， pH为6.08.0。 0010 壤霉菌(Agromycessp.)菌株MT-E的16S rDNA基因序列如SEQ ID NO:1所示， 通过 NCBI官方网站 （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/） 的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对， 结果表明该菌株与Agromycessp. 相似性最高， 同。
11、源率达99%。 0011 壤霉菌(Agromycessp.)菌株MT-E具有同时高效降解DBP和DEHP的能力。 将制备好 的MT-E菌种悬液接种于均含有200 mg/L的DBP和DEHP的MSM培养基三角瓶中， 该菌以DBP和 DEHP作为唯一碳源生长， 并对其具有高效的降解率。 在第1， 3， 5， 7天对DBP的降解率分别为 8.40%， 40.64%， 89.30%， 97.06%； 对DEHP的降解率分别为5.31%， 30.92%， 73.12%， 86.25%。 可 见， 该菌株对两种邻苯二甲酸酯均具有良好的降解效果。 0012 将该菌株接种于DBP和DEHP污染的土壤中， 30。
12、避光静置培养10天后， 与未接菌的 对照相比， 该菌株显著降低了土壤中DBP和DEHP的含量。 在第10天对DBP和DEHP的降解率分 别为77.29%和55.51%。 而对照组DBP和DEHP的自然降解率分别为9.37%和7.87%。 说明该菌株 在DBP和DEHP污染的土壤修复中具有极大的应用潜力。 0013 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果： 0014 本发明提供了一株可同时高效降解DBP和DEHP的新菌株壤霉菌(Agromycessp.) MT-E， 丰富了邻苯二甲酸酯降解菌的种质资源库， 而且该菌株在土壤中分布广泛， 易于培 养， 适应能力强； 另外通过土壤修复实验说明了该菌。
13、实际污染土壤的生物处理中将有巨大 的应用前景。 附图说明 0015 图1为MT-E菌株在LB培养基上培养7天的生长形态特征。 0016 图2为MT-E菌株的扫描电镜照片。 0017 图3为MT-E菌株的16S rDNA的系统发育树。 0018 图4为MT-E菌株对DBP和DEHP的降解动力学及生长曲线。 0019 图5为MT-E菌株对污染土壤中DBP和DEHP的降解效果。 具体实施方式 0020 下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。 本发明以下实施例 为本发明较佳的实施方式， 本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想， 实施 方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述。
14、， 但并不因此限制本发明的保护范围， 其 他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 应被视为等 效的置换方式， 包含在本发明的保护范围之内。 0021 实施例中所述培养基配方如下： 0022 无机盐培养液 （MSM， g/L） ： K2HPO4： 5.8， KH2PO4： 4.5， (NH4)2SO4： 2.0， MgCl2： 0.16， CaCl2： 0.02， Na2MoO42H2O： 0.0024， FeCl3： 0.0018， MnCl22H2O： 0.0015。 最终pH为7.5。 0023 牛肉膏蛋白胨培养基 （LB） ： 酵母粉5.0 g，。
15、 蛋白胨10.0 g， 氯化钠10.0 g， 加超纯水 至1L， 调节pH= 7.0； 121灭菌20min。 固体平板则添加1.5% （w/v） 琼脂粉。 说明书 2/5 页 4 CN 104805018 B 4 0024 实施例1菌株的分离与鉴定 0025 采集常年使用塑料大棚的农田土壤， 称取5 g新鲜土壤样品于含有50 mL无菌水的 150 mL三角瓶中， 在30， 150 rpm 培养3天后取5 mL污泥悬液加入含有100 mL DBP和DEHP （分别为50 mg/L） 的MSM培养基中。 经30， 150 rpm培养7天后， 每次按1 mL的接种量连续富 集、 转接10次， 并相。
16、应提高培养基中PAEs含量至1000 mg/L。 然后将驯化10次的培养液稀释 103105涂布于LB固体平板上， 30倒置培养13天。 待平板上长出单菌落后， 挑取单菌落多 次划线纯化， 分离获得一株细菌， 编号MT-E。 然后将菌株接种于LB固体平板上30倒置培养 7天， 观察其菌落形态 （见图1） 。 由图1可知， 菌落呈暗黄色、 扁平、 湿润、 边缘不平整、 扩散生 长， 七天后几乎铺满平板。 0026 扫描电镜观察鉴定： 将纯化后的菌株MT-E接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活 化。 吸取800 L 菌液经8000 rpm离心35 min， 去上清液， 加入500 L PBS溶。
17、液洗菌3次。 在 收获的菌体沉淀中加入1 mL的2.5%戊二醛充分混匀， 4静置过夜。 然后再次经8000 rpm离 心35 min， 去上清液， 加入500 L PBS溶液洗菌3次。 随后将菌体分别在30%， 50%， 70%， 85%， 90%和100%的梯度乙醇中脱水2次， 每个梯度约浸泡15 min， 然后8000 rpm离心去上清液， 最 后用乙酸异戊酯置换乙醇2次， 每次20 min， 方法同上述乙醇脱水过程。 经过CO2干燥后制片 观察。 图2可见在扫描电镜下MT-E菌体呈短杆状， 长约0.81.5微米， 宽约0.3 0.5微米。 0027 将MT-E菌株进行生理生化特征鉴定， 。
18、鉴定结果见表1。 0028 表1.MT-E菌株的生理生化特征鉴定 生理生化测定 结果 革兰氏染色试验 V-P试验 MR试验 淀粉水解试验 氧化酶试验 接触酶反应 尿素试验 吲哚试验 0029 注：“” 代表阳性；“” 代表阴性 0030 MT-E菌株的16S rDNA分子鉴定： 提取细菌总DNA， 用细菌16S rDNA通用引物对该菌 基因组进行PCR扩增。 PCR产物经测序 （由上海生工完成测序） 后， 将测序结果与GenBank中已 报道的其他菌株的16S rDNA序列进行同源性比对， 并选取相关菌种做进化树分析 （见图3） 。 另外， 其形态特征和生理生化指标 （见表1） 也与壤霉菌 （。
19、Agromyces sp. ） 也最为相似， 因此 本发明分离获得的降解菌鉴定为壤霉菌 （Agromyces sp. ） 。 0031 因此， 发明人将壤霉菌(Agromycessp.)菌株MT-E保藏在中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） 保藏， 保藏日期是2015年1月22日， 保藏编号是CCTCC NO: M 2015054； 所述菌株命 名为Agromycessp. MT-E。 保藏地址为： 中国武汉武汉大学。 0032 实施例2 壤霉菌(Agromycessp.) 菌株MT-E对DBP和DEHP的降解效果实验 0033 S1.菌悬液的制备： 将纯化后的MT-E菌株接入含有10 mL。
20、的LB液体培养基过夜活化 培养至对数期， 经5000 rpm 离心10 min收集菌体， 用PBS洗菌3次后重悬， 调节OD600 nm = 说明书 3/5 页 5 CN 104805018 B 5 0.8 作为菌悬液。 0034 S2.向含有200 mg/L浓度DBP和DEHP （各含200 mg/L） 的100 mL MSM培养液中接种 上述菌悬液1 mL， 以不接菌作为阴性对照， 并调节pH为7.5， 每组三个重复。 在30， 150 rpm 恒温摇床培养7天， 分别于0， 1， 3， 5， 7天取样并抽提样品， 经GC/MS测定样品中DBP和DEHP的 降解情况， 同时用分光光度计测定。
21、各时间点的细菌生长情况OD600 nm。 0035 样品处理： 将在摇瓶中培养后的样品 100 mL 转移入分液漏斗， 加入20 mL 二氯 甲烷振荡萃取10 min， 用150 mL 三角瓶收集有机相 （下相） ， 分液漏斗中的水相再加入20 mL的二氯甲烷相同方法振荡萃取3次， 合并有机相， 然后过含有18 cm已烘干的无水Na2SO4玻 璃柱 （1.5 cm35 cm） 进行干燥， 用鸡心瓶收集滤液， 经旋转蒸干后定容10 mL待测。 0036 色谱条件： 采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。 色谱柱为安捷伦HP-5 柱子(0.25 m 0.25 mm 30 m)，。
22、 进样温度为250， 离子源 （EI） 温度为220， 采用不 分流进样 1 L， 载气为高纯氦气。 升温程序为： 初始温度为100， 保持2 min， 15/min梯 度上升至129， 然后以40/min升温至280， 保持5min。 0037 质量控制： 采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。 6种PAEs混标的基质加 标平均回收率为90.5107.6%， 相对偏差低于10.7%， 仪器检测限为0.62-1.22 ug/mL。 0038 由附图4可知， 随着培养时间的延长， 样品中DBP和DEHP的残留量显著降低。 特别是 DBP， 其降解速率高于DEHP， 在第1， 3， 5， 7天。
23、DBP的降解率分别为8.40%， 40.64%， 89.30%， 97.06%； 而DEHP降解相对较慢， 但随着培养时间的延长， 仍能达到较好的降解效果。 在第1， 3， 5， 7天DEHP的降解率分别为5.31%， 30.92%， 73.12%， 86.25%。 另外， 随着培养时间增加， MT- E菌株的生长逐渐旺盛， 说明该菌能够很好的利用DBP和DEHP进行生长繁殖， 在邻苯二甲酸 酯污染环境的生物修复中具有良好的应用潜力。 0039 实施例3菌株MT-E对DBP和DEHP污染土壤的修复效果 0040 S1.供试土壤制备： 土壤为华南农业大学农场水稻土， 风干后过60目筛， pH为6。
24、.7， 向其中添加DBP和DEHP， 使其在土壤中含量分别达到100 mg/kg， 并加双蒸水调至田间持水 量 （约30%） ， 避光老化15天。 0041 S2.分别称取上述含100 mg kg-1 DBP和DEHP的土壤200 g于三角瓶中， 向土壤中添 加菌悬液50 mL， 充分混匀， 另外不接菌的处理为对照组。 将土壤调至田间持水量 （约30%的 含水量） ， 在30恒温箱中避光培养， 分别于0， 2， 4， 6， 8， 10天定期取样抽提， 然后经GC/MS测 定土壤中DBP和DEHP残留量。 0042 样品抽提： 称取1 g风干磨碎的土壤样品于35 mL玻璃离心管中， 加入20 m。
25、L的二氯 甲烷并超声萃取10 min， 然后经3500 rpm离心收集上清液。 土样沉淀中再加入20 mL的二氯 甲烷相同方法超声萃取3次， 合并上清液。 然后经旋转蒸发浓缩上清液， 用二氯甲烷超声清 洗后过柱子 （1.0 cm35 cm， 填料自上而下为无水Na2SO4， 硅胶和氧化铝） ， 用鸡心瓶收集滤 液经N2吹干后， 用色谱纯二氯甲烷重新溶解并定容至1 mL， 待GC/MS测定。 0043 GC/MS色谱条件同上所述。 0044 质量控制： 采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。 6种PAEs混标的基质加 标平均回收率为92.5110.2%， 相对偏差低于10.5%， 仪器检测限。
26、为0.120.45 ug g-1。 该方 法满足痕量有机物定量分析要求。 0045 如图5所示， 与未接菌的对照组相比，Agromyces sp. MT-E菌显著增强了土壤中 说明书 4/5 页 6 CN 104805018 B 6 DBP和DEHP的降解效果。 在接菌后第0、 2、 4、 6、 8、 10天， 土壤中的DBP残留分别为95.13 mg/ kg、 92.46 mg/kg、 82.45 mg/kg、 63.49 mg/kg、 34.08 mg/kg、 21.16 mg/kg； 土壤中DEHP的残 留量分别为97.06 mg/kg、 94.28 mg/kg、 87.15 mg/kg。
27、、 76.36 mg/kg、 55.21 mg/kg、 43.18 mg/kg。 在接菌培养的第10天， DBP的降解率比对照组提高了大约77%， DEHP则提高了大约 55%。 土壤中的DBP和DEHP含量均随修复时间的延长而逐步降低。 可见，Agromyces sp. MT-E 菌能够显著提高污染土壤中DBP和DEHP的消除， 可作为DBP和DEHP污染土壤生物修复技术的 理想微生物。 说明书 5/5 页 7 CN 104805018 B 7 0001 SEQUENCE LISTING 0002 暨南大学 0003 一株可同时降解多种邻苯二甲酸酯的壤霉菌(Agromyces sp.)MT-。
28、E 0004 0005 1 0006 PatentIn version 3.3 0007 1 0008 1408 0009 DNA 0010 MT-E菌株的16S rDNA序列 0011 1 0012 tgctttacca tgcagtcgaa cgatgaactt ggagcttgct ctgggggatt agtggcgaac 60 0013 gggtgagtaa cacgtgagta acctgccctg gactctggga taacttcgag aaatcggagc 120 0014 taataccgga taggaccttg caccgcatgg tgtggggtgg aaagtt。
29、tttc ggtttgggat 180 0015 ggactcgcgg cctatcagct tgttggtgag gtaatggctc accaaggcgt cgacgggtag 240 0016 ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 0017 ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgcgg 360 0018 gatgacggcc ttcgggttgt aaaccgcttt tagtagggaa gaagcc。
30、ttcg ggtgacggta 420 0019 cctgcagaaa aaggaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggtccga 480 0020 gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg tctgctgtga 540 0021 aaactagagg ctcaacctct agcctgcagt gggtacgggc agacttgagt ggtgtagggg 600 0022 agactggaat tcctggtgta gcggtggaat gcgcagatat caggag。
31、gaac accgatggcg 660 0023 aaggcaggtc tctgggcact tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga 720 0024 ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gttgggcgct agatgtgggg acctttccac 780 0025 ggtttccgtg tcgtagctaa cgcattaagc gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 840 0026 aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatg。
32、cgga ttaattcgat 900 0027 gcaacgcgaa gaaccttacc aaggcttgac atacacgaga acgggccaga aatggtcaac 960 0028 tctttggaca ctcgtgaaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1020 0029 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gtcgcatgtt gccagcacgt tatggtgggg 1080 0030 actcatgtga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggat。
33、gacgtc aaatcatcat 1140 0031 gccccttatg tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg ctgcgatgtc 1200 0032 gtaaggcgga gcgaatccca aaaagccggt ctcagttcgg attgaggtct gcaactcgac 1260 0033 ctcatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc 1320 0034 gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcat gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc 1380 0035 taacccttgt gaggagccgt agaaggga 1408 序列表 1/1 页 8 CN 104805018 B 8 图1 说明书附图 1/4 页 9 CN 104805018 B 9 图2 图3 说明书附图 2/4 页 10 CN 104805018 B 10 图4 说明书附图 3/4 页 11 CN 104805018 B 11 图5 说明书附图 4/4 页 12 CN 104805018 B 12 。