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1、(10)授权公告号 CN 101195818 B (45)授权公告日 2010.12.15 CN 101195818 B *CN101195818B* (21)申请号 200710191828.X (22)申请日 2007.12.15 C12N 9/26(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 淮海工学院 地址 222006 江苏省连云港市新浦区苍梧路 57 号海洋学院王淑军转 (72)发明人 王淑军 李华钟 杨磊 吕明生 陈丽 刘姝 房耀维 (74)专利代理机构 南京众联专利代理有限公司 32206 代理人 刘喜莲 (5。
2、4) 发明名称 一种热球菌产高温 - 葡萄糖苷酶及其产酶 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种热球菌 (Thermococcus sp.HJ21) 产高温 - 葡萄糖苷酶的方法。本发 明还公开了按上述方法得到的高温 - 葡萄糖 苷酶产品， 该酶作用的最适温度为 100 ； 80保 温 4h， 保持 90的酶活力， 在 90保温 lh 时， 保 持 80的酶活力 ； 该酶适合作用 pH 为 7.0 ； 酶在 pH5.0 8.0 稳定 ； Fe3+、 K+、 Ag+、 DTT 和 EDTA 对该 酶有激活作用， Cu2+、 Al3+、 Ni2+、 碘乙酸和 SDS 对该 酶有抑制作用 ； lmM。
3、 Hg2+完全抑制该酶的活性。 本 发明所得高温 - 葡萄糖苷酶在工业上主要应用 于低聚异麦芽糖的生产， 在淀粉加工工业中可以 用作糖化酶制剂， 可与 - 淀粉酶一起生产高葡 萄糖浆。 (51)Int.Cl. 审查员 曹扣 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 CN 101195818 B1/1 页 2 1. 一种热球菌株 Thermococcus sp.HJ21 产高温 - 葡萄糖苷酶的方法， 其特征在于， 其步骤如下 ： (1)将种子液以2.5的接种量， 接种于产酶培养基， 在85下静置培养21h， 培养液用 滤纸过滤除去。
4、硫颗粒， 于 10000r/min 离心 10min， 去除菌体， 取上清液 ； (2) 在上清液中加入硫酸铵至 65饱和度， 4过夜 ； 10000r/min 离心 30min， 弃掉上 清， 用 25mM pH7.5Tris-HCl 溶液溶解沉淀， 在 4透析过夜后， 于 12000r/min 离心 10min， 所得上清液即为高温 - 葡萄糖苷酶 ； 所述的产酶培养基为 ： 基础盐溶液 1000ml， 将 NaCl 用 25 取代 19.6， 微量盐溶液 10ml， 1 CaCl2H2O 5ml， N-P 混合液 10ml， Fe EDTA 混合液 2ml， 0.02刃天青溶液 5ml，。
5、 PIPE 3.35g， 酵母粉 5g， 蛋白胨 7g， 可溶性淀粉 7g， 硫 5g， pH 6.5 ； 种子液的制备方法为 ： 将菌株接种改良的 YPS 培养基中， 在 88下静置培养 6-8h ； 所述的改良的 YPS 培养基为 ： 基础盐溶液 1000ml， 微量盐溶液 10ml， 1 CaCl2H2O 5ml， N-P 混合液 10ml， Fe EDTA 混合液 2ml， 0.02刃天青溶液 5ml， PIPE 3.35g， 酵母粉 3g， 蛋白胨 3g， 麦芽糖 5g， 硫 5g， pH 6.5 ； 所述的基础盐溶液 g/L 为 ： NaCl， 19.6 ； Na2SO4， 3.3。
6、 ； KCl， 0.5 ； KBr， 0.05 ； H3BO3， 0.02 ； MgCl2， 8.8 ； 所述的微量盐溶液 g/L 为 ： CuSO45H2O， 0.01 ； ZnSO47H2O， 0.1 ； CoCl26H2O， 0.005 ； MnCl2 4H2O， 0.2 ； Na2MoO4 2H2O， 0.1 ； KBr， 0.05 ； KI， 0.05 ； H3BO3， 0.1 ； NaF， 0.05 ； LiCl， 0.05 ； Al2(SO4)30.05， NiCl26H2O， 0.01 ； VoSO42H2O， 0.005 ； H2WO42H2O， 0.002 ； Na2SeO。
7、4， 0.005 ； SrCl6H2O， 0.005 ； BaCl， 0.005 ； 所述的 N-P 混合液 g/L 为 ： (NH4)2SO4， 43.0 ； NaNO3， 60.5 ； KH2PO4， 3.6 ； 所述的 Fe EDTA 混合液 g/L 为 ： FeSO47H2O， 1.54 ； Na-EDTA， 2.06。 2. 一种如权利要求 1 所述的方法所产高温 - 葡萄糖苷酶， 其特征在于， 所述的高温 - 葡萄糖苷酶的酶学性质为 ： 该酶作用的最适温度为 100， 在 110仍有 60的酶活 力 ； 80保温 4h， 保持 90的酶活力， 在 90保温 1h， 保持 80的酶活。
8、力 ； Ca2+可降低高温 - 葡萄糖苷酶的热稳定性 ； 该酶最适作用 pH 为 7.0， pH 在 6.0 8.0 有 70以上的酶活 力 ； 酶在 pH5.0 8.0 稳定 ； Fe3+、 K+、 Ag+、 DTT 和 EDTA 对该酶有激活作用， Cu2+、 Al3+、 Ni2+、 碘 乙酸和 SDS 对该酶有抑制作用 ； 1mMHg2+完全抑制该酶的活性。 权 利 要 求 书 CN 101195818 B1/6 页 3 一种热球菌产高温 - 葡萄糖苷酶及其产酶方法 技术领域 0001 本发明涉及一种菌株产酶方法及其产品， 特别是热球菌 (Thermococcussp.HJ21) 产高温。
9、 - 葡萄糖苷酶及其产酶方法， 属于微生物工程领域。 背景技术 0002 - 葡萄糖苷酶 (-glucosidase EC 3.2.1.20) 又称 - 转移葡萄糖苷酶 (-transglucosidase EC 2.4.1.24)， 可以从低聚糖类底物的非还原性末端切开 -1， 4 糖苷键， 释放出葡萄糖， 或将游离出的葡萄糖残基以 -1， 6 糖苷键转移到另一个糖类底物 上， 从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖(IMO)、 糖脂或糖肽等。 该酶既具有水解能力， 又具有 转移能力， - 葡萄糖苷酶糖苷键水解和转移活性的特性可能由于酶结合和催化位点结构 的不同引起的。 -葡萄糖苷酶在自然界中分布广。
10、泛， 种类繁多， 性质各异， 几乎存在于所有 生物体内。 在人类的糖原降解及动物、 植物和微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。 - 葡萄糖苷酶在淀粉加工工业中可以用作糖化酶制剂， 与 - 淀粉酶一起生产高葡萄糖 浆。另外， - 葡萄糖苷酶作为工业化生产 IMO 的关键酶制剂备受国内外食品工业界的重 视。 0003 目前， 国内研究主要集中在医药 - 葡萄糖苷酶抑制剂上， 而对 - 葡萄糖苷酶 性质和应用方面研究报道较少， 仅有 Thermus thermophilus、 Aspergillus niger 等少数 报道。国外对 - 葡萄糖苷酶研究较多， 如 Pyrococcusfurios。
11、us、 P.woesei、 Sulfolobus shibatae、 S.solfataricus、 Thermococcushydrothermalis、 Thermotoga maritima 和 Thermoanaerobacter ethanolicus 等。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足， 提供一种新的利用热球菌产 高温 - 葡萄糖苷酶的方法。 0005 本发明所要解决的另外的技术问题是提供上述方法所产高温 - 葡萄糖苷酶产 品。 0006 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。 0007 本发明的特征包括利用热球菌 (Thermo。
12、coccus sp.HJ21) 菌株产高温 - 葡萄糖 苷酶的方法， 以及该方法所得的高温 - 葡萄糖苷酶产品。 0008 本发明所涉及的菌株是热球菌 (Thermococcus sp.HJ21)， 该菌株已于 2007 年 12 月 1 日在 Genebank 公开 ( 登陆号为 EF198107)， 网址为 http ： /www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/viewer.fcgi ？ db nuccore&id 145559569。该菌株为公知公用材料， 在该专 利申请日起二十年内， 公众如果需要， 淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。 0009 一、 本发明中的培。
13、养基 0010 1.1 改 良 的 YPS 培 养 基 (g/L) ： 基 础 盐 溶 液 1000ml， 微 量 盐 溶 液 10ml， 1 CaCl2 H2O 5ml， N-P混合液10ml， Fe EDTA混合液2ml， 0.02刃天青溶液5ml， PIPE 3.35g， 说 明 书 CN 101195818 B2/6 页 4 酵母粉 3g， 蛋白胨 3g， 麦芽糖 5g， 硫 5g， pH 6.5。基础盐溶液 (g/L) ： NaCl， 19.6 ； Na2SO4， 3.3 ； KCl， 0.5 ； KBr， 0.05 ； H3BO3， 0.02 ； MgCl2， 8.8。微量盐溶液 。
14、(g/L) ： CuSO45H2O， 0.01 ； ZnSO47H2O， 0.1 ； CoCl26H2O， 0.005 ； MnCl24H2O， 0.2 ； Na2MoO42H2O， 0.1 ； KBr， 0.05 ； KI， 0.05 ； H3B03， 0.1 ； NaF， 0.05 ； LiCl， 0.05 ； Al2(SO4)30.05， NiCl26H2O， 0.01 ； VoSO42H2O， 0.005 ； H2WO4 2H2O， 0.002 ； Na2SeO4， 0.005 ； SrCl 6H2O， 0.005 ； BaCl， 0.005。N-P 混合液 (g/ L) ： (NH4。
15、)2SO4， 43.0 ； NaNO3， 60.5 ； KH2PO4， 3.6。Fe EDTA 混 合 液 (g/L) ： FeSO47H2O， 1.54 ； Na-EDTA， 2.06。 0011 1.2产酶培养基(g/L) ： 基础盐溶液1000ml(将NaCl用25取代19.6)， 微量盐溶液 10ml， 1 CaCl2H2O 5ml， N-P 混合液 10ml， Fe EDTA 混合液 2ml， 0.02刃天青溶液 5ml， PIPE 3.35g， 酵母粉 5g， 蛋白胨 7g， 可溶性淀粉 7g， 硫 5g， pH 6.5。 0012 1.3 种子液的制备 ： 将菌株接种改良的 YP。
16、S 培养基中， 在 88下静置培养 6-8h。 0013 二、 产酶条件对酶产生的影响 0014 本发明提供的热球菌(Thermococcus sp.HJ21)产高温-葡萄糖苷酶， 对其产酶 条件进行了较深入的研究， 研究了不同因素对产酶的影响， 在各种单因素优化的基础上， 选 取了多因素进行了正交试验。 0015 2.1 发酵时间对产酶的影响 0016 将菌株接入到改良的 YPS 培养基中， 在 88下静置培养 36h， 每 3h 到 6h 取出测酶 活力。胞内高温 - 葡萄糖苷酶是通过超声破碎法获得。以最高酶活设为 100， 由图 1 可 知胞内高温-葡萄糖苷酶活在36h时， 产酶量上升速。
17、度较快， 到发酵6h时， 即菌体生长 到指数期后期产酶量最高， 随时间增加， 酶活力逐渐下降。胞外酶在 3 21h 成上升趋势， 在2130h时产酶较高， 在21h时最高。 从产酶时间来看， 胞内高温-葡萄糖苷酶在发酵 较短的时间内产生， 胞外高温 - 葡萄糖苷酶需要发酵较长的时间 ； 从产酶量来看， 胞内酶 产量比胞外酶产量高。所以， 判断热球菌 (Thermococcussp.HJ21) 主要产胞内高温 - 葡 萄糖苷酶。 0017 2.2 发酵温度对产酶影响 0018 将菌株接入到改良的 YPS 培养基中， 分别在不同温度 (50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 100。
18、 ) 下进行产酶发酵试验， 培养 9h 后取出测定酶活。在 85时高温 - 葡萄糖苷酶产量最高， 在 75 90产酶量较高。若温度过低， 菌株代时周期加长， 菌株 总量较低， 直接影响酶产量 ； 温度过高， 菌株不适或不能生长， 产酶量下降 ( 见图 2)。 0019 2.3 改良的 YPS 培养基 pH 对产酶的影响 0020 用 1mol/L 的 NaOH 或 HCl 将改良的 YPS 培养基的初始 pH 分别调至 4.0、 5.0、 6.0、 6.5、 7.0、 7.5、 8.0、 9.0、 10.0， 在 88培养 9h， 测定酶活。由图 3 可以看出在 pH 6.0 7.5 之间产酶。
19、相对较高， 在 pH6.5 时产酶量最高， 这与初始设计 pH 相同。过低或过高的 pH 对产 酶都有一定的影响。 0021 2.4 改良的 YPS 培养基 NaCl 浓度对产酶的影响 0022 在改良的 YPS 培养基中加入 NaCl， 使之终浓度 (w/v) 分别为 0、 1、 2、 2.5、 3、 4和 5， 在 88培养 9h， 测定酶活。如图 4 所示， NaCl 质量浓度对产酶影响比较显 著。不加 NaCl 时， 不利于菌体生长， 几乎不产生酶， 随 NaCl 浓度增加， 产高温 - 葡萄糖苷 酶的量也逐渐增加， 当改良的YPS培养基NaCl质量浓度为2.5时， 产高温-葡萄糖苷酶。
20、 说 明 书 CN 101195818 B3/6 页 5 最高， 进一步升高NaCl浓度则会对菌体生长和高温-葡萄糖苷酶酶活积累产生一定的抑 制作用。 0023 2.5 不同碳氮源对产酶的影响 0024 去除改良的 YPS 培养基中的麦芽糖、 蛋白胨和酵母粉， 以 0.6 (w/v) 的硫酸铵作 氮源， 分别在改良的YPS培养基加入0.5的各种碳源(麦芽糖、 葡萄糖、 可溶性淀粉、 糊精、 马铃薯淀粉、 果糖、 乳糖、 蔗糖、 纤维素 ) 进行碳源对产酶影响的发酵试验。去除改良的 YPS 培养基中的蛋白胨、 酵母膏， 分别加入 0.3的各类氮源 ( 蛋白胨、 酵母膏、 酵母粉、 硝酸铵、 硫酸。
21、铵、 酪蛋白、 尿素、 胰蛋白胨、 鱼粉)进行氮源对产酶影响的发酵试验， 结果见表1。 采用 单糖、 双糖作为碳源， 产酶量不如淀粉类的多聚糖， 这可能多聚糖类的碳源对产酶具有一定 诱导效应， 其中以可溶性淀粉的效果最好。无机氮源不利于产酶， 有机氮源较适合产酶 ； 以 尿素为氮源， 发酵 9h 后菌体量较少， 产酶量最低 ； 以酵母粉、 蛋白胨为氮源产酶较高， 其中 酵母粉为最好氮源。此数据为培养基成分的正交试验提供了设计依据。 0025 表 1 碳氮源对产酶的影响 0026 碳源 相对酶活 ( ) 氮源 相对酶活 ( ) 麦芽糖 葡萄糖 可溶性淀粉 糊精 马铃薯淀粉 果糖 乳糖 蔗糖 纤维。
22、素 33.32.67 17.81.56 100.01.31 84.62.45 71.81.41 25.51.24 30.01.80 18.11.19 20.50.83 蛋白胨 酵母膏 酵母粉 硝酸铵 硫酸铵 酪蛋白 尿素 胰蛋白胨 鱼粉 57.62.19 21.31.68 100.02.37 22.91.13 10.30.75 24.72.76 16.82.37 37.01.53 25.70.78 0027 2.6 正交试验设计 0028 以蛋白胨、 酵母粉、 可溶性淀粉、 时间和 NaCl 浓度为因素设计正交试验 L16(45)， 蛋 白胨、 酵母粉和可溶性淀粉分别用 0.1、 0.3、 0。
23、.5和 0.7 (w/v) 四个水平， 时间分别 取 18h、 21h、 24h 和 27h， NaCl 浓度分别取 1.5、 2、 2.5和 3 (w/v) 四水平进行试验。 以蛋白胨、 酵母粉、 可溶性淀粉、 时间和 NaCl 为因素， 每个因素选取四个水平， 采用 L16(45) 正交表进行试验， 考查这几个因子对热球菌 (Thermococcus sp.HJ21) 产酶的综合影响， 筛 选出最优的培养条件。结果如表 2 所示， 级差 R 越大， 表明因素对高温 - 葡萄糖苷酶产量 的影响越大， 本试验中， 因 R5 R1 R4 R2 R3， 所以这五个因素对高温 - 葡萄糖苷酶 产量的。
24、影响重要性依次为 NaCl 浓度蛋白胨量时间酵母粉量可溶性淀粉量。由此 可以看出在发酵过程中要控制好NaCl的浓度和蛋白胨添加量。 优化发酵条件为A4B3C4D2E3， 即蛋白胨 0.7、 酵母粉 0.5、 可溶性淀粉 0.7、 NaCl 浓度 2.5， 发酵时间 21h。 0029 表 2L16(45) 正交试验设计与结果 0030 说 明 书 CN 101195818 B4/6 页 6 实验号 蛋白胨 ( ) 酵母粉 ( ) 可溶性淀粉 ( ) 时间 (h) NaCl( ) 酶活力 (U/L) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 K1 K2 K3 。
25、K4 R 0.1 0.1 0.1 0.1 0.3 0.3 0.3 0.3 0.5 0.5 0.5 0.5 0.7 0.7 0.7 0.7 6.342 7.745 6.632 10.498 4.156 0.1 0.3 0.5 0.7 0.1 0.3 0.5 0.7 0.1 0.3 0.5 0.7 0.1 0.3 0.5 0.7 7.815 7.957 9.305 6.14 3.165 0.1 0.3 0.5 0.7 0.3 0.1 0.7 0.5 0.5 0.7 0.1 0.3 0.7 0.5 0.3 0.1 8.322 8.025 6.205 8.665 2.46 18 21 24 27 24。
26、 27 18 21 27 24 21 18 21 18 27 24 6.915 9.785 8.220 6.297 3.488 1.5 2 2.5 3 3 2.5 2 1.5 2 1.5 3 2.5 2.5 3 2 1.5 5.373 7.938 9.995 7.953 4.622 3.55 8.83 8.81 4.18 8.54 9.06 9.35 4.03 3.67 5.63 10.78 6.45 15.50 8.31 8.28 9.9 0031 三、 高温 - 葡萄糖苷酶的性质 0032 3.1 粗酶液的制备 0033 将种子液以 2.5的接种量， 接种于产酶培养基， 在 85下静置培养。
27、 21h， 培养液 用滤纸过滤除去硫颗粒， 于 10000r/min 离心 10min， 去除菌体， 取上清液。在上清液中缓慢 加入硫酸铵至 65饱和度， 4过夜。10000r/min 离心 30min， 小心弃掉上清， 用尽量少的 25mM pH7.5Tris-HCl 溶液溶解沉淀， 在同样的缓冲液中 4透析过夜后， 于 12000r/min 离 心 10min， 所得上清液即为高温 - 葡萄糖苷酶。 0034 3.2 酶作用温度对酶活性的影响 0035 将酶分别在 50、 60、 70、 80、 85、 90、 95、 100 ( 水浴 ) 和 110 ( 高 压灭菌锅)温度下， 缓冲液为。
28、用pH 7.0的磷酸钠缓冲溶液(50mM)， 以pNPG作为底物进行酶 活测定， 以最高酶活力为 100。图 5 表明， 该高温 - 葡萄糖苷酶在 100时有最大的催 化效率， 在 110仍有 60的催化活性， 而在 70以下催化效率较低。 0036 3.3 酶的热稳定性 0037 取适量酶液 ( 添加或不添加 Ca2+， 终浓度 5mM) 分别在不同温度 (80， 90， 100 ) 下 保温 4h， 每隔 0.5 到 1h 取出一组样品， 迅速置于 4冰箱内， 待保温结束后统一在标准条 件下测定残余酶活， 以未处理的酶液的酶活设为 100。如图 6 所示， 添加 Ca2+可降低高温 说 明。
29、 书 CN 101195818 B5/6 页 7 - 葡萄糖苷酶的热稳定性。该酶在不加 Ca2+的情况下， 80保温 4h， 保持 90的酶活力 ； 在 90保温 1h 时， 可以保持 80的酶活力 ； 在 100保温 0.5h， 可以保持 70左右的酶活 力。延长保温时间， 酶活力呈逐渐下降趋势。 0038 3.4 酶的作用 pH 对酶活性的影响 0039 用不同pH的40mmol/L Brittion-Robinson通用缓冲液(40mmol/L磷酸-40mmol/ L硼酸-40mmol/L乙酸， 用NaOH调pH)取代酶活测定方法中的缓冲液进行酶活测定。 如图7 所示， 该酶在较广的 p。
30、H 值范围表现出酶活力。最适反应 pH 为 7.0， pH 在 6.0 8.0 有 70 以上的酶活力。 0040 3.5 酶的 pH 稳定性 0041 酶在不同pH的10mmol/L的Brittion-Robinson通用缓冲液中常温下24h处理后， 加入 100mmol/L、 pH7.0 缓冲液恢复 pH， 然后在标准条件下测定残余酶活， 以未处理的酶液 的酶活设为 100。结果见图 8。高温 - 葡萄糖苷酶在 pH5.0 8.0 的范围内较稳定， 该 酶在pH5.56.0处理后， 保持近100的酶活力， 而在pH3.04.0处理后， 酶活性几乎消 失， 但总体上该高温 - 葡萄糖苷酶在较。
31、宽 pH 值保持稳定。 0042 3.6 金属离子、 化学试剂对酶的作用 0043 将金属离子和化学试剂与酶液混合， 使其最终浓度分别达到 1.0mM， 5.0mM， 然后在 100下测酶活。以未经金属离子和化学试剂处理的作对照 (100 )。如表 3 所示， Fe3+、 K+、 Ag+、 DTT 和 EDTA 对热球菌 (Thermococcussp.HJ21) 的高温 - 葡萄糖苷酶有激活作用， 1mM 的 Cu2+、 Al3+、 Ni2+、 碘乙酸和 SDS 对有明显抑制作用， Mg2+和 Ca2+对高温 - 葡萄糖苷酶 有较小的抑制作用， 浓度增加， 抑制作用更明显。高温 - 葡萄糖苷。
32、酶对 Hg2+比较敏感， 1mM Hg2+完全抑制该酶的活性。 0044 表 3 金属离子和化学试剂对酶活力的影响 0045 金属离子 相对酶活 ( ) 1mM 相对酶活 ( ) 5mM 化学试剂 相对酶活 ( ) 1mM 相对酶活 ( ) 5mM Mg2+ Fe3+ Ca2+ Cu2+ K+ Al3+ Ni2+ Ag+ Hg2+ 96.61.50 110.52.16 94.12.29 73.50.85 116.41.47 48.12.89 70.61.72 110.22.67 3.41.04 94.82.35 104.73.27 90.32.85 62.13.27 107.21.88 40.。
33、33.26 64.12.59 129.63.24 0 三氯乙酸 碘乙酸 DTT EDTA SDS 99.63.22 74.52.37 110.41.46 118.32.32 60.91.65 102.22.75 62.11.53 127.11.36 124.32.62 56.23.27 0046 3.7 高温 - 葡萄糖苷酶活测定。 0047 高温 - 葡萄糖苷酶活测定方法 ： 用对硝基苯基 -D- 吡喃葡萄糖苷 (pNPG) 作底物。取 50L pNPG( 浓度为 10mmol/L)、 200L 适度稀释的酶液和 200L 0.1mol/L 说 明 书 CN 101195818 B6/6 页。
34、 8 磷酸钠缓冲液 (pH7.0) 于 100水浴中保温 15min， 立即加入 400L 1mol/L 预冷的碳酸钠 溶液中止反应并显色， 用酶标仪在 405nm 处测定吸光值。 0048 酶活力单位定义 ： 在上述分析条件下， 每分钟催化产生 1mol PNP 的酶量为一 个活力单位 (U)。 0049 本发明所得的高温 - 葡萄糖苷酶在工业上主要应用于低聚异麦芽糖的生产 ； 高 温 - 葡萄糖苷酶在淀粉加工工业中可以用作糖化酶制剂， 可与高温 - 淀粉酶一起生产 高葡萄糖浆。 附图说明 0050 图 1 为发酵时间对产酶的影响图 ( ， 胞内酶 ； ， 胞外酶 )。 0051 图 2 为。
35、发酵温度对产酶的影响图。 0052 图 3 为培养基初始 pH 值对产酶的影响图。 0053 图 4 为培养基 NaCl 浓度对产酶的影响图。 0054 图 5 为酶的作用温度对酶活性影响图。 0055 图 6 为酶的热稳定性图 ( ， 80 ； ， 80加 Ca2+； ， 90 ； ， 90加 Ca2+； -， 100 ； ， 100加 Ca2+)。 0056 图 7 为酶作用 pH 对酶活性影响图。 0057 图 8 为酶 pH 稳定性图。 具体实施方式 0058 实施例 1。一种热球菌 (Thermococcus sp.HJ21) 产高温 - 葡萄糖苷酶的方法， 其步骤如下 ： 0059。
36、 (1)将种子液以2.5的接种量， 接种于产酶培养基， 在85下静置培养21h， 培养 液用滤纸过滤除去硫颗粒， 于 10000r/min 离心 10min， 去除菌体， 取上清液 ； 0060 (2)在上清液中加入硫酸铵至65饱和度， 4过夜 ； 10000r/min离心30min， 弃掉 上清， 用25mM pH7.5Tris-HCl溶液溶解沉淀， 在4透析过夜后， 于12000r/min离心10min， 所得上清液即为高温 - 葡萄糖苷酶。 0061 实施例 2。一种如实施例 1 所述的方法所产高温 - 葡萄糖苷酶， 所述的高温 - 葡萄糖苷酶的酶学性质为 ： 该酶作用的最适温度为 10。
37、0， 在 110仍有 60的酶活 力 ； 80保温 4h， 保持 90的酶活力， 在 90保温 1h， 保持 80的酶活力 ； Ca2+可降低高温 - 葡萄糖苷酶的热稳定性 ； 该酶适合作用 pH 为 7.0， pH 在 6.0 8.0 有 70以上的酶活 力 ； 酶在 pH5.0 8.0 稳定 ； Fe3+、 K+、 Ag+、 DTT 和 EDTA 对该酶有激活作用， Cu2+、 Al3+、 Ni2+、 碘 乙酸和 SDS 对该酶有抑制作用 ； 1mM Hg2+完全抑制该酶的活性。 说 明 书 CN 101195818 B1/2 页 9 说 明 书 附 图 CN 101195818 B2/2 页 10 说 明 书 附 图 。