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1、10申请公布号CN102021225A43申请公布日20110420CN102021225ACN102021225A21申请号200910067538322申请日20090917C12Q1/68200601G01N21/64200601C12N15/8520060171申请人中国科学院长春应用化学研究所地址130022吉林省长春市人民大街5625号72发明人田华雨陈学思郭兆培李艳辉陈杰林琳景遐斌74专利代理机构长春科宇专利代理有限责任公司22001代理人马守忠54发明名称一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的应用57摘要本发明提供了一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的应用。其用于荧光标记。所述的。
2、纳米颗粒，由纳米金颗粒和超支化聚乙烯亚胺通过硫金键结合在一起，所述的聚乙烯亚胺分子量为30030000，所述的纳米金颗粒和阳离子聚合物的质量比为11001001。该纳米金球形颗粒用于荧光标记时，其激发和发射波长有效范围都比较宽，在激发波长为400450NM，最佳激发波长为430NM的紫外光激发时，产生发射波长峰值在720800NM范围内的红光；在370NM激发波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在600NM左右的黄光。其克服了有机物荧光材料峰值有效范围比较窄的弱点，是一种良好的荧光材料。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页附图1页CN10202。
3、1239A1/1页21一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的应用，其特征在于，其用于荧光标记；所述的超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒，由纳米金颗粒和超支化聚乙烯亚胺通过硫金键结合在一起，所述的聚乙烯亚胺分子量为30030000，所述的纳米金颗粒和阳离子聚合物的质量比为11001001。2一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒用于荧光标记的方法，其特征在于步骤和条件如下取人宫颈癌细胞HELA细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞、非洲绿猴肾细胞COS7细胞或胚胎成纤维细胞3T3细胞，在CO2体积百分含量为5的37的孵箱中，用含质量百分数为10的小牛血清培养液连续培养；取超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒加水溶解，。
4、配置成浓度为10MG/ML的溶液，用孔径为022M的微孔滤膜过滤除菌；用去离子水配制浓度为01MG/ML的质粒DNA水溶液；按照超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒与质粒DNA的质量比为201601，将超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的水溶液和质粒DNA的水溶液等体积混合，把该溶液在室温放置30分钟，得到的超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒/质粒DNA水溶液；取六孔板，在六孔板中种细胞，每孔10106个，在37孵箱中培养24小时，加入上述得到的超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒/质粒DNA水溶液，使质粒DNA为每孔50G，继续培养5小时后，取出细胞，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗5遍，然后用05G/ML的4，6二脒基。
5、2苯基吲哚对细胞核避光标记12分钟，再用磷酸缓冲溶液冲洗5遍，用甘油封片，进行激光共聚焦扫描；所述的超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒在400450NM在波长为400450NM的紫外光激发时，产生发射波长在720800NM范围内的红光，用DAPI标记的细胞核在此波长的紫外光激发时，产生发射波长在460NM左右的蓝色荧光；在370NM波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在600NM左右的黄光。3如权利要求2所述的一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒用于荧光标记的方法，其特征在于，所述的超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的激发光波长为430NM。权利要求书CN102021225ACN102021239A1/。
6、4页3一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的应用技术领域0001本发明涉及一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的应用。背景技术0002随着人类基因组计划的完成和细胞生物学技术的进步，基因治疗将在人类攻克肿瘤这一顽症的过程中占据重要地位，并将逐步成为一种常见治疗手段1。基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术2。基因治疗不仅可以治疗肿瘤，还可以治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括遗传病如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病如艾滋病、类风湿等。近年来国内外对多种疾。
7、病致病基因的研究发展迅速，为基因治疗发展提供了坚实的理论基础和技术条件，使基因治疗有望成为攻克人类顽疾的“利器”之一。0003将基因物质导入细胞进行表达是实现基因治疗的必须步骤，成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。利用病毒载体介导基因转移是基因治疗中应用最广泛的方法，其中包括逆转录病毒、腺病毒AV、腺相关病毒AAV、单纯疱疹病毒HSV、痘苗病毒VV等载体。但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患3，已经引起了多起医疗事故。非病毒类载体因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。阳离子聚合物是非病毒基因载体中受到关注较多的一类载体。目前广泛应用的阳离子聚合物基因载体。
8、有聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖等48。这些载体虽然比病毒类的基因载体安全，但是仍然存在转染效率低、细胞毒性大等缺点910。开发出低毒性和高效率的基因载体已经成为基因治疗发展迫切需要解决的问题。0004近年来，纳米级金属材料特别是贵金属纳米材料，特别是金纳米簇的荧光性质越来越受到人们的关注，这是由于它们在生物学研究领域作为荧光标记材料11，有着潜在的优势。传统半导体纳米荧光材料CDSE/ZNS是由很小的纳米颗粒组成，被称为量子点。当他们的尺寸小于波尔半径时，即当他们的直径在4到5纳米左右时，就产生尺寸依赖的荧光性质1214，产生不同颜色的光，但材料本身的毒性也比较大。金纳米簇也有类似的尺寸依赖的。
9、荧光性质，随着纳米簇中金个数不同可激发出不同颜色的光。而且，金纳米簇不含有毒性重金属，虽然也具有微弱的毒性效应15，16，但它仍然是代替量子点用于生物技术荧光标记最有潜力的材料。0005一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗可以作为基因载体中国发明专利申请号为2008100514118。发明内容0006本发明提供一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的应用。一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒简写为AUPEI在不同波长的激发光源激发时发出不同说明书CN102021225ACN102021239A2/4页4颜色的荧光，用于荧光标记；所述的一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒，由球形金纳米颗粒和超支化聚乙烯亚胺。
10、通过硫金键结合在一起；所述的聚乙烯亚胺分子量为30030000，所述的球形金纳米颗粒和聚乙烯亚胺的质量比为11001001。0007所述的一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒的制备方法，请参阅中国发明专利，申请号为2008100514118。0008本发明提供的一种超支化聚乙烯亚胺球形金纳米颗粒用于荧光标记的方法的步骤和条件如下0009取人宫颈癌细胞HELA细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞、非洲绿猴肾细胞COS7细胞或胚胎成纤维细胞3T3细胞，在CO2体积百分含量为5的37的孵箱中，用含质量百分数为10的小牛血清培养液连续培养；0010取AUPEI加水溶解，配置成浓度为10MG/ML的溶液，用孔。
11、径为022M的微孔滤膜过滤除菌；用去离子水配制浓度为01MG/ML的质粒DNA水溶液；按照AUPEI与质粒DNA的质量比为201601，将AUPEI的水溶液和质粒DNA的水溶液等体积混合，把该溶液在室温放置30分钟，得到AUPEI/质粒DNA水溶液；0011取六孔板，在六孔板中种细胞，每孔10106个，在37孵箱中培养24小时，加入上述得到的AUPEI/质粒DNA水溶液，使质粒DNA为每孔50G，继续培养5小时后，取出细胞，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗5遍，然后用05G/ML的4，6二脒基2苯基吲哚简称DAPI对细胞核避光标记12分钟，再用磷酸缓冲溶液冲洗5遍，用甘油封片，进行激光共聚焦扫描。001。
12、2如图2所示，以AUPEI13为例说明，在波长为400450NM最佳激发波长为430NM的紫外光激发时，产生发射波长在720800NM范围内的红光；用DAPI标记的细胞核在此波长的紫外光激发时，产生发射波长在460NM左右的蓝色荧光。在370NM波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在600NM左右的黄光。0013有益效果本发明的超支化聚乙烯亚胺纳米金球形颗粒用于荧光标记时，其激发和发射波长有效范围都比较宽，在波长为400450NM最佳激发波长为430NM的紫外光激发时，产生发射波长在720800NM范围内的红光；用DAPI标记的细胞核在此波长的紫外光激发时，产生发射波长在460NM左右的蓝色荧。
13、光。在370NM波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在600NM左右的黄光。其克服了有机物荧光材料峰值有效范围比较窄的弱点，使AUPEI的适用性更强，并且可产生比较强比较清晰的荧光，是一种良好的荧光材料。附图说明0014图1为超支化聚乙烯亚胺纳米金粒子的光谱图。图中，A为AUPEI13的激发和发射光谱图；B为AUPEI15的激发和发射光谱图；A和C分别为AUPEI13和AUPEI15的激发光谱；B和D分别为AUPEI13和AUPEI15的发射光谱。0015图2为AUPEI13的激光共聚焦扫描图，图中，细胞核为DAPI标记的蓝色，AUPEI13产生的为红色。说明书CN102021225ACN10。
14、2021239A3/4页5具体实施方式0016实施例1超支化聚乙烯亚胺金纳米材料的制备0017超支化聚乙烯亚胺金纳米材料，按中国发明专利，申请号为2008100514118提供的方法制备。0018AUPEI13和AUPEI15的荧光谱图以及不同颜色的荧光如图1所示。0019图1中A和C分别表示AUPEI13和AUPEI15的激发荧光扫描图；B和D分别表示AUPEI13和AUPEI15的发射荧光扫描图。A为AUPEI13的荧光扫描谱图及所观察到的红光；B为AUPEI15的荧光扫描谱图及所观察到的黄光。AUPEI13在400450NM最佳激发波长为430NM波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在7。
15、20800NM范围内的红光；AUPEI15在370NM波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在600NM左右的黄光。0020实施例2超支化聚乙烯亚胺纳米金粒子的荧光标记的应用0021取人宫颈癌细胞HELA细胞，在CO2体积百分含量为5的37的孵箱中，用含质量百分数为10的小牛血清培养液连续培养。0022取AUPEI加水溶解，配置成浓度为10MG/ML的溶液，用孔径为022M的微孔滤膜过滤除菌；用去离子水配制浓度为01MG/ML的质粒DNA水溶液，按照AUPEI与质粒DNA的质量比为201601，将AUPEI的水溶液和质粒DNA水溶液等体积混合，把该溶液置室温放置30分钟，得到AUPEI/质粒DN。
16、A水溶液；取六孔板，在六孔板中种细胞，每孔10106个，在37孵箱中培养24小时，加入上述得到的AUPEI/质粒DNA水溶液，使DNA每孔50G，继续培养5小时后，取出细胞，用磷酸缓冲溶液轻轻冲洗5遍，然后用05G/ML的DAPI对细胞核进行避光标记12分钟，再用磷酸缓冲溶液冲洗5遍，用甘油封片，进行激光共聚焦扫描。0023如图2所示，AUPEI13在400450NM最佳激发波长为430NM波长的紫外光激发时，产生发射波长峰值在720800NM范围内的红光。用DAPI标记的细胞核在此波长激发时，产生发射波长在460NM左右的蓝色荧光。0024实施例3超支化聚乙烯亚胺纳米金粒子的荧光标记的应用0。
17、025其用于中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞的具体方法和步骤，同实施例2所述用于人宫颈癌细胞HELA细胞的具体方法和步骤。0026实施例4超支化聚乙烯亚胺纳米金粒子的荧光标记的应用0027其用于非洲绿猴肾细胞COS7细胞的具体方法和步骤，同实施例2所述用于人宫颈癌细胞HELA细胞的具体方法和步骤。0028实施例5超支化聚乙烯亚胺纳米金粒子的荧光标记的应用0029其用于胚胎成纤维细胞3T3细胞的具体方法和步骤，同实施例2所述用于人宫颈癌细胞HELA细胞的具体方法和步骤。0030本发明涉及的参考文献00311GLOVERDJ，LIPPSHJANDDAVIDAJ，TOWARDSSAFE，NONVIRALT。
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23、OFNANOCRYSTALSINBIOLOGICALDETECTIONNATBIOTECHNOL2004224752004414MICHALET，X；PINAUD，FF；BENTOLILA，LA；TSAY，JM；DOOSE，S；LI，JJ；SUNDARESAN，G；WU，AM；GAMBHIR，SS；WEISS，SQUANTUMDOTFORLIVECELLS，INVIVOIMAGING，ANDDIAGNOSTICSSCIENCE2005307538544004515KIRCHNER，C；LIEDL，T；KUDERA，S；PELLEGRINO，T；JAVIER，AM；GAUB，HE；STOLZLE，S；FERTIG，N；PARAK，WJCYTOTOXICITYOFCOLLOIDALCDSEANDCDSE/ZNSNANOPARTICLESNANOLETT20055331338004616PAN，Y；NEUSS，S；LEIFERT，A；FISCHLER，M；WEN，F；SIMON，U；SCHMID，G；BRANDAU，W；JAHNENDECHENT，WSIZEDEPENDENTCYTOTOXICITYOFGOLDNANOPARTICLESSMALL，2007319411949。说明书CN102021225ACN102021239A1/1页7图1图2说明书附图CN102021225A。