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1、(10)授权公告号 CN 101731458 B (45)授权公告日 2012.11.21 CN 101731458 B *CN101731458B* (21)申请号 200810217587.6 (22)申请日 2008.11.10 C07K 14/76(2006.01) (73)专利权人 胡文锋 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号华南农业大学嵩山区 55 栋 102 房 (72)发明人 胡文锋 张炜阳 李岩 吴同山 胡斌 (74)专利代理机构 深圳市博锐专利事务所 44275 代理人 张明 孙鑫 US 5989584 A,1999.11.23, M. E. Cook.。
2、Antibodies Alternatives to antibiotics in improving growth and feed efficiency.full.J. Appl. Poult. Res .2004,106-119. 徐文华 . 猪胆囊收缩素 _33 基因同向四串 联体的构建与表达 .四川大学学报 ( 自然科学 版 ) .2007,1115-1120. (54) 发明名称 一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗 体的卵黄粉及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种含有抗猪胆囊收缩素 / 肠 道细菌脲酶的双效价卵黄抗体 (Immunoglobulin yolk。
3、， IgY) 的卵黄粉。其制备方法包括以下步骤 ： 1) 将纯化的猪胆囊收缩素 39 肽 (CCK39)/ 脲酶 B 亚基 (UreB) 融合蛋白与弗氏佐剂混匀制成疫 苗， 免疫健康开产母鸡， 用酶联免疫试验测定卵黄 IgY 效价并收集高免蛋 ； 2) 从高免蛋中分离蛋黄， 制成卵黄粉。由本发明所述方法制备的含双效价 IgY的卵黄粉添加到饲料中喂猪， 由于IgY中和猪 肠道分泌的 CCK， 使猪不产生或延迟产生饱感， 提 高采食量 ； IgY 还能中和肠道细菌分泌的脲酶从 而减少氨气的产生， 既保护猪肠道和呼吸道， 也减 少饲料蛋白的浪费， 改善养殖环境。 (51)Int.Cl. (56)对比。
4、文件 审查员 唐宁 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体的卵黄粉的制备方法， 包括以下步骤 ： 1） 将纯化浓缩的猪胆囊收缩素 39 肽即 CCK39/ 肠道细菌脲酶 B 亚基即 UreB 融合蛋白 与弗氏佐剂混合均匀制成疫苗， 所述纯化浓缩的 CCK39/UreB 融合蛋白与弗氏佐剂等体积 混合制成疫苗， 所述CCK39/UreB融合蛋白对应的核酸序列为SEQ ID NO.1， 用该疫苗免疫健 康开产。
5、母鸡， 用酶联免疫检测试验进行效价测定并收集高免鸡蛋 ； 2） 从高免鸡蛋中分离蛋黄， 制成卵黄粉。 2. 根据权利要求 1 所述的一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体的卵黄粉的制 备方法， 其特征在于 ： 所述免疫步骤具体为 ： 步骤 1） 首先在健康开产蛋鸡胸肌两侧分别注 射100L浓度为1mg/mL的含弗氏完全佐剂疫苗 ； 10天后胸肌两侧再分别注射200L浓度 为1mg/mL的含弗氏不完全佐剂疫苗 ； 25天后再分别注射300L浓度为1mg/mL的含弗氏不 完全佐剂疫苗 ； 55 天后注射 400L 浓度为 1mg/mL 的不含佐剂疫苗 ； 85 天后再注射 500L 。
6、浓度为1mg/mL的不含佐剂疫苗， 共免疫5次， 之后用酶联免疫检测试验进行效价测定， 当双 效价卵黄抗体效价达 1 ： 1600 以上时收集高免鸡蛋以制备高免卵黄粉。 3. 根据权利要求 1 所述的一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体的卵黄粉的制 备方法， 其特征在于 ： 步骤 2） 所述卵黄粉制备步骤具体为 ： 分离卵清与卵黄， 收集卵黄， 均 质后喷雾干燥， 或真空冷冻干燥， 或均质后与吸附剂等质量混合， 于 40-50干燥即成卵黄 粉。 4.根据权利要求 1所述的一种含有抗猪CCK/Urease的双效价卵黄抗体的卵黄粉的制 备方法， 其特征在于 ： 所述吸附剂为玉米淀粉。
7、、 轻质碳酸钙或二氧化硅。 5. 由权利要求 1 所述制备方法制备的含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗 体的卵黄粉。 6. 权利要求 5 所述含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉作为饲 料添加剂的应用。 权 利 要 求 书 CN 101731458 B 2 1/8 页 3 一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体的卵黄粉及 其制备方法 技术领域 0001 本 发 明 涉 及 生 物 制 剂 领 域，尤 其 涉 及 一 种 含 有 抗 猪 胆 囊 收 缩 素 (Cholecystokinin， CCK)/ 肠道细菌脲酶 (Urease)。
8、 的双效价卵黄抗体 (Immunoglublin yolk， IgY) 的卵黄粉及其制备方法。 背景技术 0002 如何提高畜禽采食量、 改善养殖环境， 降低氨对环境的冲击一直是急待解决的问 题。目前提高畜禽采食量的途径常见有以下几种 ： (1) 选用优质和易于消化的原料 ； (2) 确 定日粮合适的营养水平 ； (3) 哺乳期补料 ； (4) 饲喂液体饲料与发酵饲料 ； (5) 使用诱食调 节剂 ； (6) 改善畜禽养殖环境等。利用现代生物工程技术和产品提高动物采食量是目前研 究的热点， 而利用抗 CCK 卵黄抗体从动物生理调节的角度调节动物的采食量是其中的方法 之一。 0003 另一方面，。
9、 随着养殖业规模化、 集约化程度的提高， 畜禽自身代谢过程以及废弃物 所产生的氨也大量增加， 对养殖场及周边环境带来极大的负面冲击。畜禽养殖场的氨主要 是由于畜禽胃肠道蛋白质代谢过程产生的尿素和尿酸在微生物脲酶 (Urease) 作用下的水 解产物， 并导致蛋白质的浪费， 降低了饲料效率 ； 氨气的积累不仅会危害畜禽的健康， 降低 其生产性能， 还会污染周边环境。 因此， 畜禽生产过程中必须采取相应措施控制氨气的产生 和排放。 0004 目前可采用脲酶抑制剂来抑制脲酶活性， 从而减少氨的产生。此类抑制剂包括重 金属盐类、 天然类固醇萨酒皂角苷 (Yucca Sapanion)、 二胺、 三胺类。
10、化合物、 氧肟酸类化合 物等。 这些抑制剂或者价格昂贵， 或者对畜禽本身的生长有负面作用， 或者没有被批准用于 畜禽养殖等， 因此开发一种安全、 新型脲酶抑制剂很有必要。 发明内容 0005 本发明提供一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体 IgY 的卵黄粉的制备方 法， 该卵黄粉能提高猪只的采食量、 降低其料肉比以及减少氨的排放。 0006 本发明的第二个目的在于提供一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体 IgY 的卵黄粉。 0007 为达到上述目的， 本发明的技术方案为 ： 0008 一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价 IgY 的卵黄粉的制备方法， 包。
11、括以下步骤 ： 0009 1) 将纯化浓缩的猪胆囊收缩素 39 肽 (CCK39)/ 肠道细菌脲酶 B 亚基 (UreB) 融合 蛋白与弗氏佐剂混合均匀制成疫苗， 用该疫苗免疫健康开产母鸡， 用酶联免疫检测试验测 定卵黄中 IgY 效价并收集高免鸡蛋 ； 0010 2) 从高免鸡蛋中分离蛋黄， 制成卵黄粉。 0011 纯化浓缩的 CCK39/UreB 融合蛋白与弗氏佐剂等体积混合。 说 明 书 CN 101731458 B 3 2/8 页 4 0012 所述免疫步骤具体为 ： 0013 步骤 1) 首先在健康开产蛋鸡胸肌两侧分别注射 100L 浓度为 1mg/mL 的含弗氏 完全佐剂疫苗 ； 。
12、10 天后胸肌两侧再分别注射 200L 浓度为 1mg/mL 的含弗氏不完全佐剂 疫苗 ； 25 天后再分别注射 300L 浓度为 1mg/mL 的含弗氏不完全佐剂疫苗 ； 55 天后注射 400L 浓度为 1mg/mL 的不含佐剂疫苗 ； 85 天后再注射 500L 浓度为 1mg/mL 的不含佐剂 疫苗， 共免疫 5 次。之后用酶联免疫检测试验进行效价测定， 当双效价卵黄抗体效价达 1 ： 1600 以上时收集高免鸡蛋以制备高免卵黄粉。 0014 步骤 2) 所述卵黄粉制备步骤具体为 ： 分离卵清与卵黄， 收集卵黄， 均质后喷雾干 燥， 或真空冷冻干燥， 或均质后与吸附剂等质量混合， 于 。
13、40-50干燥等即成卵黄粉。 0015 所述吸附剂为玉米淀粉、 轻质碳酸钙或二氧化硅。 0016 一种由上述制备方法制备的含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗体的 卵黄粉。 0017 由上述方法制备的含有抗 CCK39/UreB 融合蛋白的双效价卵黄抗体就可以分别中 和猪只 CCK 和肠道细菌脲酶。此双效价卵黄抗体作为饲料添加剂添加到猪饲料中的应用。 0018 由本发明所述方法制备的含有抗 CCK/Urease 的双效价 IgY 的卵黄粉添加到饲料 中饲喂猪只， 一方面利用抗 CCK39 作用中和胃肠道内的 CCK， 使猪只不产生或延迟产生饱 感， 从而提高其采食量 ； 另一。
14、方面， 该双效价 IgY 还能与猪肠道中大肠菌群产生的脲酶特异 性结合， 从而抑制肠道微生物的脲酶活性， 阻止尿素和尿酸转化成氨气， 减少氨气的产生， 既能降低养殖场所氨气的浓度， 改善养殖环境， 又能减少了蛋白质的流失、 浪费， 提高饲料 效率。 附图说明 0019 图1是CCK39基因PCR产物电泳分析图， 1 ： DNA marker DL2000 ； 2-7 ： CCK39PCR产 物 ； 0020 图 2 是 UreB 基因 PCR 产物电泳分析图， 1 ： DNAmarker DL2000 ； 2-5 ： UreB PCR 产 物 ； 0021 图 3 是本发明 CCK39/Ure。
15、B 双基因融合表达载体的构建流程图。 具体实施方式 0022 实施例 1 CCK39/UreB 融合蛋白的表达与疫苗的制备 0023 ( 一 ) 模板制备 0024 (1)CCK39 cDNA 的制备 ： 收集新鲜猪十二指肠， 按照 RNA 提取试剂盒提取猪十二指 肠总RNA， 检测证实其具备完整性后， 按照cDNA合成试剂盒要求将该总RNA逆转录为相应的 cDNA， 置于 -20保存备用。 0025 (2) 产脲酶大肠菌群质粒 DNA 的制备 ： 从新鲜猪粪中分离培养出产脲酶大肠菌群 单菌落， 过夜扩大培养， 然后收集该新鲜培养物， 按照质粒回收试剂盒提取该大肠菌群质 粒， 溶于 TE bu。
16、ffer 中并置于 -20保存备用 0026 ( 二 )CCK39 基因的获得 0027 根据 GenBank 上公布的序列 gi ： 47523555， 利用 Primer Premier5.0 设计引物 说 明 书 CN 101731458 B 4 3/8 页 5 设计一对特异引物 ( 引物由上海英骏生物技术有限公司合成， 以下同 )， 0028 上游引物如序列 SEQ ID NO ： 2 所示 ： 0029 5 -GATGGATCCTACATCCAGCAGGCTCGAAAAGC-3， 含有 BamHI 酶切位点 ； 0030 下游引物如序列 SEQ ID NO ： 3 所示 ： 0031。
17、 5 -GATAAGCTTAAAATCCATCCAGCCCATGTAGTC-3， 含有 HindIII 酶切位点， 且不含终 止密码子。 0032 以 CCK39 cDNA 为模版， PCR 扩增猪十二指肠 CCK39 目的基因， 反应 ： 94 5min， 94 30s， 53 30s， 72 30s， 72 10min， 30 个循环。PCR 产物电泳后进行凝胶成像系统分 析， 参阅图 1。 0033 ( 三 )pET43a(+)/CCK39 原核表达质粒的构建 0034 回收纯化上述扩增产物 CCK39 目的基因后， BamH I 和 Hind III 分别双酶切扩增 产物和 pET43。
18、a(+) 原核表达质粒， 凝胶回收。16连接过夜， 再转化 E.coli DH5， 氨苄青 霉素抗性筛选， 挑 6 个阳性菌落， 分别进行 PCR 和 BamH I、 Hind III 双酶切鉴定， 符合预期 结果的菌株编号为 E.coliDH5/pET43a(+)/CCK39， 送往上海英骏生物技术有限公司进行 测序， CCK39 基因的序列如 SEQ ID NO ： 6， 结果在 GenBank 的 Blastn 比对， 分析其同源性。 0035 ( 四 )UreB 基因获得 0036 根据 GenBank 上公布的序列 gi ： 148150， 利用 Primer Premier5.0 。
19、设计引物设 计一对特异引物， 0037 上游引物如序列 SEQ ID NO ： 4 所示 ： 0038 5 -GGGAAGCTTATGATCCCCG GTGAAATTAA-3 ， 含有 Hind III 酶切位点， 0039 下游引物如序列 SEQ ID NO ： 5 所示 ： 0040 5 -AAA GCGGCCGC TTAATTCTCACTCTCTAA-3 ， 含有 Not I 酶切位点 ； 0041 以产脲酶大肠杆菌质粒 DNA 为模版， PCR 扩增 UreB 目的基因， 反应 ： 94 5min， 94 30s， 53 30s， 72 30s， 72 10min， 30 个循环。PC。
20、R 产物电泳后进行凝胶成像系统 分析， 参阅图 2。 0042 ( 五 )pET43a(+)/CCK39/UreB/ 双基因融合表达质粒的构建 0043 请参阅图 3， 回收纯化上述扩增产物 UreB 目的基因后， Hind III 和 Not I 分别双 酶切扩增产物和pET43a(+)/CCK39原核表达质粒， 凝胶回收。 16连接过夜， 再转化E.coli DH5， 氨苄青霉素抗性筛选， 挑 6 个阳性菌落， 分别进行 PCR 和 Hind III、 Not I 双酶切 鉴定。符合预期结果的菌株编号为 E.coli DH5/pET43a(+)/CCK39/UreB， 送往上海英骏 生物技。
21、术有限公司进行测序， CCK39/UreB 双融合基因的序列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 结果在 GenBank 的 Blastn 进行比对， 分析其同源性。 0044 ( 六 )CCK39/UreB 融合蛋白的表达及疫苗的制备 0045 将培养至对数生长期的表达工程菌 E.coli BL-21(DE3)/pET43a(+)/CCK39/UreB 按 1 (V/V) 的比例接种于含氨苄青霉素的发酵培养基 2YT 液体培养基中， 28培养 4h 后， 当发酵液 A600 0.8 时， 加入 200g/L 的乳糖至终浓度为 10g/L， 28诱导 5h 后， 4、 10000r/min 。
22、离心 10min， 收集沉淀， 沉淀经 PBS 洗涤和重悬菌体后， 超声破碎 (300W、 超声时 间6s， 间隔时间7s， 共超声40次)， 4、 10000r/min离心15min， 收集裂解上清。 经Ni2+-NTA 镍柱纯化后 SDS-PAGE 凝胶电泳分析， 再经透析、 浓缩， 然后采用 Bradford 检测法测定融合 说 明 书 CN 101731458 B 5 4/8 页 6 蛋白含量。按体积比 1:1 的比例与弗氏佐剂混合制成浓度为 1mg/mL 的疫苗。 0046 实施例 2 免疫方法 0047 选 22 周龄开产健康产蛋母鸡， 设免疫组和对照组两组， 并留取免疫前的鸡蛋作。
23、对 照， 按该种属鸡饲养要求进行饲养。将已纯化的重组 CCK39/UreB 融合蛋白与等体积弗氏佐 剂混合均匀制成疫苗， 采用胸部多点肌肉注射的方式进行免疫。免疫程序与接种剂量如表 1 所示。 0048 表 1 蛋鸡免疫程序与免疫剂量 0049 免疫时间 ( 天 ) 疫苗免疫途径接种量 / 只 1d CCK39/UreB 融合蛋白 + 弗氏完全佐剂 胸肌多点100g 10d CCK39/UreB 融合蛋白 + 弗氏不完全佐剂 胸肌多点200g 25d CCK39/UreB 融合蛋白 + 弗氏不完全佐剂 胸肌多点300g 55dCCK39/UreB 融合蛋白胸肌多点400g 85dCCK39/U。
24、reB 融合蛋白胸肌多点500g 0050 实施例 3 高免鸡蛋的处理 0051 首免后开始每日收集鸡蛋并编号， 4保存备用。取卵黄时先磕开蛋壳， 分离蛋黄 与蛋清， 用灭菌蒸馏水反复冲洗蛋黄表面， 尽量去除蛋清， 用针头刺破蛋黄膜， 吸出蛋黄， 测 量蛋黄体积， 加入 9 倍灭菌蒸馏水稀释， 并用 HCl 调节 pH 值至 5.0-5.5 之间， 稀释液于 4 静置 6h 以上， 待出现明显分层后， 吸取上清 ； 4、 12000r/min 离心 30min， 取上清， 计量体 积， 加入 0.01硫化汞， 小分装， -20保存。 0052 实施例 4 间接 ELISA 检测 0053 1、。
25、 酶标抗体工作浓度的测定选择 0054 用 0.05moL/L pH9.6 的碳酸盐缓冲液将鸡抗 CCK39/UreB 阳性 IgY 作 1:10、 1:20、 1:40、 1:80、 1:160、 1:320、 1:640、 1:1280 稀释， 包被酶标板第 1-8 列， 100L/ 孔， 37恒温 1h 后转入 4过夜 ； 洗涤、 封闭后， 用 pH7.4PBS 将酶标抗体做 1:200、 1:400、 1:800、 1:1000 稀释后， 分别加入酶标板第 1-4 行， 37水浴 1h 后， 按间接 ELISA 方法进行检测， 测定各孔 OD490的值， 当 OD490值为 1.0 左。
26、右且鸡抗 CCK39/UreB 阳性 IgY 稀释度最大时所对应的酶标 抗体浓度， 作为酶标抗体最佳工作浓度。最佳酶标抗体浓度工作稀释度为 1:12800。 0055 2、 CCK39/UreB 抗原最适包被浓度及阴阳性 IgY 的最佳稀释度的确定 0056 用 0.05mol/LpH9.6 的碳酸盐缓冲液将抗原作 1:20、 1:40、 1:80 和 1:160 的稀释， 包被酶标板第 1-4 行， 100uL/ 孔， 37 1h 后转入 4过夜 ； 洗涤、 封闭后， 将 CCK39/UreB 阳 性、 阴性 IgY 都同时做 1:20、 1:40、 1:80、 1:160、 1:320 稀。
27、释， 然后将阳性 IgY 分别加入到 酶标板的第 1、 3、 5、 7、 9 列， 阴性 IgY 加入到酶标板第 2、 4、 6、 8、 10 列， 第 11 列加入 IgY 稀 释液 (pH7.4PBS) 作空白对照， 37水浴 1h 后， 按间接 ELISA 方法进行检测。当阳性血清 说 明 书 CN 101731458 B 6 5/8 页 7 的 OD490值接近 1.0， 而阴性血清小于 0.2， 且 P/N 值最大时， 所对应的抗原稀释度为最佳包 被浓度， 对应的阴阳性血清的稀释浓度为最佳阴阳性 IgY 工作浓度， 抗原最适包被浓度为 3.125g/mL。 0057 3、 间接 EL。
28、ISA 检测 0058 间接 ELISA 检测具体操作流程如下 ： 0059 抗原包被洗板封闭洗板加待检样洗板加酶标抗体洗板底物显 色终止反应判定结果 0060 本研究所研制的双效价 IgY 的抗体最高效价达 1:51200 以上。 0061 实施例 5 含有抗猪 CCK39/UreB 融合蛋白 ( 即抗猪 CCK/Urease) 的双效价卵黄抗 体的卵黄粉制备。 0062 选取符合条件的免疫鸡蛋， 分离卵清与卵黄， 收集卵黄， 通过均质后喷雾干燥， 或 真空冷冻干燥， 或均质后与吸附剂等质量混合， 于 40-50干燥即成卵黄粉。 0063 所述的吸附材料为玉米淀粉、 轻质碳酸钙， 以及二氧化。
29、硅中的任意一种。 0064 该卵黄粉中含有所述的能够提高猪的采食量与减少猪舍氨的排放量的双效价卵 黄抗体。 0065 实验例 含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉饲喂仔猪试 验 0066 ( 一 ) 试验动物与设计 0067 1、 试验选择 54 头出生体重相近 ( 约 20kg) 的二元杂仔猪， 采用单因子试验设计， 共分 3 个处理， 每个处理 3 个重复， 每个重复 6 头的仔猪 ； 0068 A、 处理 1 ： 空白对照组 ( 基础日粮 ) ； 0069 B、 处理 2 ： 基础日粮 + 阴性鸡蛋， 即阳性对照组 0070 C、 处理 3 ： 基础日粮 + 。
30、含抗 CCK/Urease 卵黄抗体的阳性鸡蛋， 即试验组。 0071 2、 试验日粮 0072 该猪场自配粉料 ： 1000g 粉料中， 玉米 ： 290g， 豆粕 ： 145g， 预混料 ： 65g。 0073 3、 试验方法 0074 I ： 采食量测定 0075 1)饲养场地进行定期清洁消毒。 试验仔猪自由饮水， 每天饲喂5次， 根据每个重复 具体采食情况添补饲料。从早上 8:30 到下午 6:30， 每 2h 检查采食情况 1 次， 每天记录每个 处理的耗料量， 试验周期为 22d。试验开始、 结束时， 仔猪空腹 24h 后称个体重， 每个星期统 计每重复的总耗料量， 计算仔猪平均日。
31、增重、 平均日采食量以及料重比等。 0076 2) 数据处理 0077 数据表示为平均数 标准差， 采用 SAS 统计软件对数据进行 ANOVA 方差分析和 DUNCAN 多重比较。 0078 4、 饲喂含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉对仔猪生长性 能及饲料利用率的影响 0079 试验组猪只采食量分别较阳性对照组和空白对照组提高 6.24和 15.29。猪只 平均日增重以试验组 ( 处理 3 组 ) 最高， 显著高于阳性对照组 ( 处理 2 组 ) 和空白组 ( 处 理 1 组 )， 分别提高 16.07和 23.98； 试验组、 阳性对照组和空白对照组的料肉比。
32、分别为 说 明 书 CN 101731458 B 7 6/8 页 8 1.6755、 1.8200 和 1.8167， 分别降低了 7.97和 7.77， 参见表 2。 0080 在为期 30 天的试验期间， 三个处理组的死淘率为零， 且没有发生腹泻。除因天气 寒冷和空气潮湿致使空白对照组、 阳性对照组和试验组各一只猪发生关节炎外， 没有发生 其他疾病。 0081 表 2 含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄粉对仔猪生长性能 及饲料利用率的影响 0082 空白对照组阳性对照组试验组 初始仔猪头数303030 最后仔猪头数303030 仔猪平均始重 (kg/ 头 )6.。
33、06.66.1 仔猪平均末重 (kg/ 头 )17.0018.3719.75 平均总增重 (kg)11.0011.7713.65 平均日增重 (kg/ 头 )0.3670.3920.455 平均日采食量 (kg/ 头 )0.66140.71770.7625 料肉比 (F/G)1.81671.82001.6755 腹泻头次000 0083 II ： 粪便中脲酶活性的测定 0084 分别在0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20和22d收集每个处理的新鲜粪便样置于适 当的容器中备用。采用 pH 增值法测定脲酶活性。 0085 具体操作方法如下 ： 0086 准确称。
34、取 2.0g 样品两份， 分别置于两支 25ml 试管中， 其中一支加入 20ml 磷酸盐 缓冲液， 作为空白试验 (A 管 ) ； 另一支加入 20ml 尿素磷酸盐缓冲液， 作为试验管 (B 管 )， 立 即盖好试管塞并剧烈摇动， 置于 300.5恒温水浴中， 每隔 5min 振摇一次， 准确计时， 保 持 30min 后， 每管立即分别加入 4 滴饱和氯化汞溶液， 以终止反应。分别测定其 pH 值。 0087 结果计算 ： 酶活性 B-A 0088 式中 ： BB 管的 pH 值 0089 AA 管的 pH 值 0090 5、 含有抗猪 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄抗体的卵黄。
35、粉对仔猪肠道微生物 脲酶活性的影响 0091 表 3 列出了不同处理组猪粪样品的微生物脲酶活性。从表 3 可知， 空白对照、 阳性 对照以及添加卵黄抗体的试验组的试管中粪便的 pH 值差分别为 0.342、 0.322 以及 0.269。 由于 pH 值差越大， 脲酶活性越强， 因此添加卵黄抗体组脲酶活性比空白、 阳性对照组分别 下降了 21.35和 16.46。此试验结果说明 ： 添加抗 CCK/Urease 融合蛋白的双效价卵黄 抗体的卵黄粉后对仔猪肠道的细菌脲酶活性有明显的抑制效果， 从而有效的阻止尿素转变 成氨， 减少了氮源的流失， 为提高蛋白质利用率提供了条件。 0092 表 3 各。
36、组试验仔猪粪便中细菌脲酶活性 0093 处理组别脲酶活性 pH 空白对照组0.342 阳性对照组0.322 添加卵黄抗体试验组0.269 0094 SEQUENCE LISTING 说 明 书 CN 101731458 B 8 7/8 页 9 0095 文锋， 胡 0096 一种含有抗猪 CCK/Urease 的双效价卵黄抗体的卵黄粉及其制备方法 0097 6 0098 PatentIn version3.5 0099 1 0100 619 0101 DNA 0102 人工序列 0103 1 0104 0105 2 0106 32 0107 DNA 0108 人工序列 0109 2 0110 。
37、0111 3 0112 33 0113 DNA 0114 人工序列 说 明 书 CN 101731458 B 9 8/8 页 10 0115 3 0116 0117 4 0118 29 0119 DNA 0120 人工序列 0121 4 0122 0123 5 0124 29 0125 DNA 0126 人工序列 0127 5 0128 0129 6 0130 225 0131 DNA 0132 人工序列 0133 6 0134 0135 说 明 书 CN 101731458 B 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101731458 B 11 2/2 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 101731458 B 12 。