技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及CAPRI细胞及其制备方法。
背景技术
肿瘤的生物治疗现已被广泛作为除手术、放疗及化疗之外的第四种疗法。目前比较常见的疗法有树突状细胞(DC)疗法、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法等。
DC疗法的方案是从患者的外周血淋巴细胞中分离出DC细胞前体即单核细胞，经IL-4、GMCSF及TNF等细胞因子激活，获得有抗原呈递功能的DC，在DC成熟的过程中可加入患者肿瘤溶解物或合成肿瘤多肽或肿瘤细胞系溶解物或肿瘤抗原mRNA等肿瘤信息分子，终产品DC为携带肿瘤信息的抗原呈递细胞。在临床应用时，可将DC作为疫苗接种给患者，诱导患者的免疫防御，从而达到在体内活化激活肿瘤特异性杀伤细胞的作用。
CIK疗法的方案是从患者外周血PBMC中分离出以T细胞为主的淋巴细胞，通过液相中的小鼠抗人CD3抗体激活T淋巴细胞，并使用IL-2等能够维持T细胞高速大量增殖的细胞因子获得大量以CD56+/CD3+表型的NKT细胞，通常以50ml外周血中的淋巴细胞作为起始，经过14-20天的培养，获得十亿以上的细胞，这些细胞通过静脉回输给肿瘤患者，以提高肿瘤患者免疫功能，通过以非特异性杀伤为主的杀伤作用抑制肿瘤及微小转移。现在也有将DC技术结合CIK技术的报道，方案为在DC培养成熟后(7-10天)加入单独培养的CIK细胞再次培养(7-10天)，培养后的DC及CIK混合物再回输患者。
然而，肿瘤的以下特性会为肿瘤的细胞治疗方案造成困难：1、 肿瘤的多样性造成各瘤种的特异性抗原不同，从而对依赖于特异性抗原的细胞培养方法造成影响。2、肿瘤在其形成、生长及转移的过程中，细胞表面所表达的肿瘤抗原会产生突变。3、肿瘤本身具有异质性。4、肿瘤在体内能够分泌诸如IL-6、IL-4、IL-10等能够诱导免疫抑制或Th2、Th17等不利于细胞免疫的细胞因子，造成肿瘤杀伤免疫应答的不足。
以上几个肿瘤特性均对DC疗法的方案造成了不利的影响，首先，由于肿瘤的多样性及肿瘤抗原的突变造成DC疗法中选取普适的肿瘤抗原成为不可能完成的任务，其次，随着肿瘤恶性程度的发展及从原发肿瘤到转移肿瘤的病情发展过程，肿瘤的抗原在不断改变，使得在DC制备过程中加入的原发肿瘤抗原、细胞系抗原、合成多肽等失去其作用，因为载有以上抗原的DC诱导的杀伤细胞的攻击对象在患者体内不复存在，而大量不表达以上抗原的变异转移肿瘤细胞又不能被识别杀伤。此外，DC方案依赖于患者本身的免疫应答，而患者往往由于肿瘤所分泌的细胞因子及肿瘤术后的放化疗，处于免疫抑制状态。DC在进入患者体内后，往往不能有效诱导免疫应答。
对于非特异性杀伤的治疗方案，例如CIK疗法，其不足在于，以NK及NKT为主的杀伤会受到自体MHC-C分子的抑制。在自体系统内，NK及NKT细胞不能杀伤表达MHC分子的肿瘤细胞，大量的临床试验表明，超过80％的肿瘤细胞表面表达MHC分子，少量晚期肿瘤细胞由于染色体丢失、甲基化或其他分子生物学改变才会有MHC-C分子不表达的情况，在对60例自体肿瘤的CIK细胞杀伤试验中，发现平均杀伤率为7.35±1.66％，仅2例杀伤率超过30％。而在MHC不配型的异体系统的杀伤率则可高达85％。因此在CIK疗法中MHC-C对非特异性杀伤的抑制作用是其主要缺陷。此外在CIK疗法中细胞是从新鲜培养物中获取直接回输患者，造成制备安全性及临床配合度方面的困扰。而且，传统疗法均需长期(一般超过14天)的细胞培养，不仅增 加了工作量，设备占用率高，提高了细胞培养成本，而且细胞培养物的污染几率倍增。
发明内容
本发明的目的是提供一种耗时短、方便简洁并且不需要另外加入抗原成分的体外激活和诱导方法，从而获得级联式细胞因子诱导激活的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞(CAPRI细胞)。
为了实现本发明目的，本发明提供的CAPRI细胞的制备方法，该方法包括外周血单核细胞体外激活以及CAPRI细胞扩增的步骤；
所述外周血单核细胞体外激活是将外周血单核细胞用OKT3抗体(抗CD3抗体)进行初级刺激后，在存在细胞因子组合I的情况下进行体外激活培养；细胞因子组合I包括rhIL-2(重组人白细胞介素-2)和rhIFN-γ(重组人干扰素-γ)，以及rhIL-4(重组人白细胞介素-4)、rhGM-CSF(重组人粒细胞集落刺激生物因子)、rhTNF-α(重组人肿瘤坏死因子-α)、PGE-2(前列腺素E2)中的至少一种；
所述CAPRI细胞扩增是将未经上述体外激活处理的外周血单核细胞与经过上述体外激活处理的外周血单核细胞混合孵育，在存在细胞因子组合II的情况下进行CAPRI细胞扩增培养；细胞因子组合II包括rhIL-2和rhIFN-γ，以及rhIL-7(重组人白细胞介素-7)和/或IL-15(白细胞介素-15)。
本发明所述CAPRI细胞由自体同源的或同种异体的细胞构成。
前述的方法，未经体外激活处理的外周血单核细胞与经过体外激活处理的外周血单核细胞按1∶10-10∶1的比例混合，优选按1∶1的比例混合。
前述的方法，在进行初级刺激之前，先从患者外周血中分离、纯化单核细胞，具体方法为：抽取患者外周血，加肝素抗凝处理，然后分装至离心管中1500g离心20分钟，弃上清，向离心管中加入RPMI1640培养基100-200ml，制成淋巴细胞悬液，然后加入到预置有淋巴 细胞分离液的离心管中，离心后将淋巴细胞层转移至另一离心管中，加RPMI 1640培养基重悬，750g离心5-12分钟，弃上清，重复以上重悬、离心操作1次，向获得的单核细胞中加完全培养液，制成淋巴细胞悬液；或者，采用白细胞分离技术从患者外周血中获得单核细胞，向获得的单核细胞中加完全培养液，制成淋巴细胞悬液。
所述完全培养液的制备方法为：全血于1500g离心20分钟，弃上清，4℃静置过夜，再于1500g离心15分钟，取上清作为培养基中添加的血浆；向RPMI 1640培养基中加入血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v％自身血浆的完全培养液。
所述外周血单核细胞体外激活的具体方法为：
1)细胞培养瓶处理：用pH8.6的PBS缓冲液配制浓度为2μg/ml的OKT3抗体包被液，向75cm2细胞培养瓶中加入12ml包被液，4℃过夜处理，使用前去掉包被液，用生理盐水洗1-2次，然后每瓶加入18ml完全培养液；
2)体外激活：向上述培养瓶中加入含6×107个单核细胞的淋巴细胞悬液12ml，于38℃，6％CO2培养箱中培养3小时，进行初级刺激；3小时后加入激活培养基I 0.5ml，继续培养3小时，获得体外激活的外周血单核细胞。
其中，所述激活培养基I中含rhIL-2 10-2000IU/ml、rhIFN-γ10-2000IU/ml、rhIL-4 10-800IU/ml、rhGM-CSF 200-400IU/ml、rhTNF-α200-500IU/ml及PGE-2 1-5μg/ml，以水配制。
所述CAPRI细胞扩增的具体方法为：向体外激活的外周血单核细胞中加入含3×107-6×107个单核细胞的淋巴细胞悬液12ml，于38℃，6％CO2培养箱中孵育16小时，然后于750g离心8分钟，弃上清，用RPMI1640培养基重悬细胞，800g离心5分钟后，弃上清，用RPMI 1640培养基或完全培养液重悬细胞，使细胞浓度达到1×106-5×106个/ml，加入激活培养基II，于38℃，6％CO2培养箱中培养72小时，进行CAPRI 细胞扩增。
其中，所述激活培养基II中含rhIL-2 100-2000IU/ml、rhIFN-γ100-2000IU/ml、rhIL-7 10-200IU/ml及IL-15 10-300IU/ml，以水配制。
前述的方法，还包括CAPRI细胞收获、冻存及复苏的步骤，具体如下：
CAPRI细胞收获的方法为：将CAPRI细胞扩增培养物800g离心10分钟，弃上清，用生理盐水重悬细胞，同时取样送质量控制检测；
冻存的方法为：将生理盐水重悬的细胞800g离心10分钟，弃上清，并用4ml冷冻液A重悬，置于冰上，加入4ml预冷的冷冻液B，分装后保存于液氮或-80℃冰箱中；
复苏的方法为：将待复苏的细胞于37℃水浴中解冻，并转移到预置有10ml细胞复苏液的离心管中，750g离心5分钟，然后用生理盐水重悬细胞，再750g离心5分钟，重复以上重悬、离心操作步骤3次；最后用2ml细胞复苏液重悬，准备回输。
其中，所述冷冻液A的制备方法为：向浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液100ml中加入100ml pH7.0的PBS缓冲液，混匀后于-20℃保存。
所述冷冻液B的制备方法为：向160ml pH7.0的PBS缓冲液中加入40ml二甲基亚砜，混匀即得。
所述细胞复苏液的制备方法为：向95ml无菌生理盐水中加入浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液5ml，混匀后用0.22μm滤器过滤，即得。
本发明方法的细胞培养流程图见图1。
本发明还提供根据上述方法制备的CAPRI细胞，用于肿瘤患者术后的治疗。
本发明还提供根据上述方法制备的CAPRI细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述CAPRI细胞可通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述 肿瘤内部或周围给药，以每次注射50万-3000万细胞的剂量给药。
本发明进一步提供根据上述方法制备的CAPRI细胞的鉴定方法及标准：
通过流式细胞仪检测成品细胞表面白细胞分化抗原，通常用于荧光染色的抗体包含以下几组：
(1)CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PECy5，鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+细胞≥90％,CD3+/CD4+细胞≥40％,CD3+/CD8+细胞≥40％；
(2)CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PECy5，鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+/CD56+细胞≥10％,CD3-/CD56+及CD3-/CD16+细胞≥5％；
(3)Lin-FITC/CD83-PE/CD1a-PECy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：Lin-/CD83+/CD1a+细胞≥1％；
(4)FoxP3-FITC/CD25-PE/-CD4-PE Cy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：FoxP3+/CD25+/-CD4+细胞≤1％；
(5)CD3-FITC/CD14-PE/CD19-PECy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3-/CD14+细胞≤1％,CD3-/CD19+细胞≤1％。
其他质量鉴定及合格标准：
细胞培养终产品要求按照《中国生物制品规程》中的《生物制品无菌试验规程》进行实验，细胞终产品应经革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌培养结果为阴性；经真菌培养鉴定结果为阴性；经支原体检测结果为阴性；经梅毒检测结果为阴性；经乙肝抗原检测结果为阴性；内毒素检测结果为阴性。
本发明通过体外抗淋巴细胞分化抗原抗体及细胞因子组合刺激，经两步活化获得大量能够识别肿瘤特异性抗原的T淋巴细胞。经激活和诱导的肿瘤特异性细胞可在患者体内对肿瘤细胞进行杀伤，从而达到配合放化疗或单独抑制原发肿瘤生长的作用；通过杀伤微小转移肿 瘤灶、清除循环转移肿瘤或肿瘤干细胞，从而达到延缓复发和转移，延长患者生存期，提高患者生存质量的作用。
本发明具有以下优点：
(一)在细胞体外激活阶段使用了rhIL-2、rhIFN-γ、rhIL-4、rhGM-CSF、rhTNF-α及PGE-2的特殊因子组合，从而为经CD3抗体激活的T淋巴细胞分泌DC细胞成熟提供必须的细胞因子，并在外源细胞因子组合的共同作用下，快速使细胞混合物中的单核细胞成熟为DC细胞。
(二)在细胞扩增阶段使用了rhIL-2、rhIFN-γ、rhIL-7及IL-15的细胞因子组合，使得经DC活化的T淋巴细胞大量扩增，并使细胞群体中的记忆T杀伤细胞数量得到提升，从而保证了终产品的肿瘤特异性杀伤活性。
(三)本方法采取两步法进行T淋巴细胞激活和扩增，第一步快速获得DC细胞，第二步通过DC激活T细胞，由于肿瘤患者的单核细胞在体内接触过肿瘤细胞抗原，因此能在培养体系中成熟为携带肿瘤抗原的DC，并刺激活化肿瘤特异性T淋巴细胞。
(四)本方法采取特殊的刺激环境，因此能在短时间内(6小时)将细胞群中的单核细胞活化成熟为DC细胞，第二步扩增仅用4天，抗原呈递细胞在体内所吞噬的肿瘤抗原还未降解，因此采用本方法获得肿瘤抗原特异性效应细胞的过程中，无需额外加入肿瘤抗原肽或肿瘤抗原mRNA。
(五)本方法的细胞培养流程仅需5天，而现有CIK、NK或DC-CIK等细胞培养方法耗时约14-20天，随着培养时间的缩短实验设备占用率的下降，按照一套运行设备(包括一台超净工作台，两台恒温培养箱)计算，本方法可处理细胞样品60份，而CIK、NK或DC-CIK方法等仅能处理细胞样品20份。
(六)采用本方法培养的CAPRI细胞对于自体肿瘤细胞的杀伤效 率比CIK方法显著提高。
(七)本方法培养的细胞能够冻存，成品细胞能全部鉴定合格后使用，保证了细胞的安全性及临床配合度。
(八)培养细胞所需培养基的用量(约500ml)大大低于其他培养方法(约2000-3000ml)，节约了生产成本。
附图说明
图1为本发明方法的细胞培养流程图。
图2为本发明实施例2中CAPRI细胞、CIK细胞对自体乳腺癌细胞细胞毒体外实验结果；其中，A从左至右依次为CAPRI细胞作用前的肿瘤细胞、CAPRI细胞及CAPRI细胞作用后的肿瘤细胞；B从左至右依次为CIK细胞作用前的肿瘤细胞、CIK细胞及CIK细胞作用后的肿瘤细胞。
图3为本发明实施例2中效应细胞与靶细胞比例为5:1-40:1的条件下，CAPRI细胞及CIK细胞对自体肿瘤细胞杀伤率的Cr51释放实验定量比较结果(5例乳腺癌患者平均值)。
图4为本发明实施例3中分别经CIK细胞(A)及CAPRI细胞(B)处理的负荷大肠癌肿瘤的裸鼠经4周后的瘤体直径比较结果，A中瘤体直径约7mm，B中瘤体直径约3mm。
图5为本发明实施例3中分别经CIK细胞(对照组)及CAPRI细胞处理的负荷大肠癌肿瘤的裸鼠45天生存曲线，其中，实线为CIK组(对照组)，虚线为CAPRI组。CAPRI组裸鼠平均生存时间为43.0±1.7天，CIK组为29.7±1.9天，p＜0.01，表示显著性差异。
图6为本发明实施例4中CAPRI细胞对恶性黑色素瘤患者的疗效，其中，A为患者在接受CAPRI细胞治疗前的两个病灶情况，B为患者在接受第24次CAPRI细胞治疗前的两个病灶情况，C为患者在接受第36次CAPRI细胞治疗后两个病灶被完全治愈。
图7为本发明实施例5中CAPRI细胞对非小细胞肺癌患者的疗效， 其中，A为患者治疗前病灶处CT影像，B为患者经CAPRI细胞治疗后CT影像。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 级联式细胞因子诱导激活的肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞(CAPRI细胞)的制备
1.外周血单核细胞采集
1.1方法1：人外周血采集：使用肝素抗凝，手工采血120ml-400ml，经分离纯化后，单核细胞数目约1.5×108-5.0×108。
1.2方法2：通过白细胞分离技术获得患者外周血单核细胞，单采循环量150-500ml，经纯化后单核细胞数目约1.5×108-5.0×108。
2.试剂及溶液配制
2.1包被液配制
2.1.1配制pH7.0-7.4的1×磷酸盐缓冲液(PBS)
2.2.2用1N氢氧化钠溶液将上述PBS缓冲液调pH至8.6
2.2.3用0.22μm无菌滤器过滤
2.2.4向100ml pH8.6的无菌磷酸盐缓冲液中加入0.2ml浓度为1mg/ml的小鼠抗人CD3单克隆抗体(OKT3)，OKT3抗体浓度为2μg/ml。
2.2培养液配制
2.2.1无血清培养基：RPMI 1640培养基。
2.2.2.完全培养液：全血于1500g离心20分钟，弃上清，4℃静置过夜，再于1500g离心15分钟，取上清作为培养基中添加的血浆；向RPMI 1640培养基中加入血浆，并按100U/ml浓度加入庆大霉素，制成含10v/v％自身血浆的完全培养液。
2.3冷冻液A：向浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液100ml中加入100ml pH7.0的PBS缓冲液，混匀后于-20℃保存。
2.4冷冻液B：向160ml pH7.0的PBS缓冲液中加入40ml二甲基亚砜(DMSO)，混匀即得。
2.5激活培养基I：rhIL-2 10-2000IU/ml、rhIFN-γ10-2000IU/ml、rhIL-4 10-800IU/ml、rhGM-CSF 200-400IU/ml、rhTNF-α200-500IU/ml及PGE-2 1-5μg/ml，以水配制。
2.6激活培养基II：rhIL-2 100-2000IU/ml、rhIFN-γ100-2000IU/ml、rhIL-7 10-200IU/ml及IL-15 10-300IU/ml，以水配制。
2.7淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypaque。
2.8细胞复苏液：向95ml无菌生理盐水中加入浓度为200g/L的人血清白蛋白溶液5ml，混匀后用0.22μm一次性滤器过滤。
3.细胞培养准备工作
3.1细胞培养瓶的包被
向75cm2细胞培养瓶中加入12ml包被液，4℃过夜。
3.2淋巴细胞纯化
3.2.1将手工采血或白细胞分离技术产物(100～120ml)用RPMI1640培养基稀释至200ml，制成淋巴细胞悬液。
3.2.2将上述200ml淋巴细胞悬液按照每管25ml的量分装到8个离心管中(离心管体积为50ml，每个离心管预置有13ml淋巴细胞分离液)，加入时应小心地加入到淋巴细胞分离液上，840g离心23分钟，小心吸出淋巴细胞层并将所有细胞置于50ml离心管中，加RPMI 1640培养基至总体积50ml，750g离心12分钟。
3.2.3弃上清，用45ml RPMI 1640重悬(用培养基将细胞混匀)淋巴细胞，取样计数。平均分装于2支50ml离心管中，离心。
3.2.4弃上清，用48ml完全培养液(或无血清培养基，培养基量为24ml/管)，将细胞重悬后分成两管。其中一管用于第一步外周血单核 细胞体外激活，另一管用于第二步CAPRI细胞扩增。
3.3细胞培养瓶处理
取包被过夜的细胞培养瓶，吸出包被液，并每瓶加入20ml生理盐水，摇匀并静置2分钟，吸出生理盐水。每瓶加入18ml完全培养液。
4.外周血单核细胞的体外激活
4.1向上述培养瓶中加入12ml淋巴细胞悬液(每75cm2培养瓶约3×107-6×107个单核细胞)，于38℃，6％CO2恒温培养箱中培养3小时。
4.2完成3个小时培养后，向培养物中加人激活培养基I(每瓶0.5ml)，继续培养3小时。
5.CAPRI细胞扩增培养
5.1向上述经体外激活的培养物中加入12ml淋巴细胞悬液(约含3×107-6×107个单核细胞)，于38℃，6％CO2恒温培养箱中培养16小时。
5.2将经16小时培养的培养物收集到50ml离心管中，750g离心8分钟，弃上清，用50ml RPMI 1640重悬细胞，计数，然后800g离心5分钟，弃上清。
5.3用无血清培养基或完全培养液将所有细胞重悬至240ml，细胞浓度达到约1×106-5×106个/ml，加入激活培养基II 0.5ml，将细胞悬液分装于175cm2培养瓶中，每瓶约120ml(或3个75cm2培养瓶，每瓶80ml)。
5.3将培养瓶卧平，于38℃，6％CO2恒温培养箱中培养72小时。
6.CAPRI细胞的收获及冻存
6.1将细胞培养物离心弃上清，并用生理盐水重悬计数，同时取样送质量控制检测。
通过流式细胞仪检测成品细胞表面白细胞分化抗原，通常用于荧光染色的抗体包含以下几组：
(1)CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PECy5，鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+细胞≥90％,CD3+/CD4+细胞≥40％,CD3+/CD8+细胞 ≥40％；
(2)CD3-FITC/CD16-PE/CD56-PECy5，鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3+/CD56+细胞≥10％,CD3-/CD56+及CD3-/CD16+细胞≥5％；
(3)Lin-FITC/CD83-PE/CD1a-PECy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：Lin-/CD83+/CD1a+细胞≥1％；
(4)FoxP3-FITC/CD25-PE/-CD4-PE Cy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：FoxP3+/CD25+/-CD4+细胞≤1％；
(5)CD3-FITC/CD14-PE/CD19-PECy5鉴定培养细胞终产品合格标准为：CD3-/CD14+细胞≤1％,CD3-/CD19+细胞≤1％。
其他质量鉴定及合格标准：
细胞培养终产品要求按照《中国生物制品规程》中的《生物制品无菌试验规程》进行实验，细胞终产品应经革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌培养结果为阴性；经真菌培养鉴定结果为阴性；经支原体检测结果为阴性；经梅毒检测结果为阴性；经乙肝抗原检测结果为阴性；内毒素检测结果为阴性。
6.2细胞离心并用4ml冷冻液A重悬，充分混匀，置于冰上，缓慢加入4ml预冷的冷冻液B。
6.3充分混匀，分装于6支冷冻管中，细胞保存于液氮或-80℃低温冰箱，24小时后转入液氮保存。
7.CAPRI细胞的复苏
7.1将需复苏的细胞冷冻管于37℃恒温水浴中解冻，并移入预置10ml细胞复苏液的离心管中，离心，并用10ml生理盐水重悬，再离心，重复以上重悬、离心操作步骤3次。
7.2取样，进行台盼蓝染色，并计数。
7.3用2ml细胞复苏液重悬，准备回输CAPRI细胞，用于肿瘤患者术后的治疗。
制备的CAPRI细胞可通过皮内注射、静脉注射、肌内注射或在所述肿瘤内部或周围给药，以每次注射50万-3000万细胞的剂量给药。
采用本方法培养的CAPRI细胞对于自体肿瘤细胞的杀伤效率极高，30例肺癌患者经本方法与CIK方法培养的细胞对自体肿瘤细胞杀伤(铬释放实验)比较结果见表1。
表1 CAPRI细胞与CIK细胞杀伤效果比较
E:T比 CAPRI细胞杀伤 CIK细胞杀伤 40:1 93.74±9.34 9.55±6.89 20:1 72.01±8.45 7.89±5.74 10:1 37.56±7.38 7.03±6.01 5:1 18.78±5.98 6.34±5.22
实施例2 CAPRI细胞对自体乳腺癌细胞细胞毒体外实验
采用实施例1的方法和CIK技术分别培养患者自体CAPRI细胞及CIK细胞，将患者自体乳腺癌细胞系细胞作为靶细胞(经Cr51标记)，进行细胞毒实验。分别通过显微镜镜下观察及Cr51放射性释放量测定杀伤率，结果见图2和图3。
其中，图2A为显微镜下观察自体肿瘤细胞分别与CAPRI细胞及CIK细胞共同孵育20小时后，CAPRI细胞组残留肿瘤数量明显少于CIK细胞组，证明CAPRI细胞在体外对于自体肿瘤细胞有明显的杀伤及抑制作用；但在相同条件下，CIK细胞作用不明显(图2B)。
实施例3 CAPRI细胞活性的体内试验
将大肠癌患者自体肿瘤细胞1×105个通过皮下注射至6-8周龄裸鼠体内，同时按照实施例1方法用该患者外周血单个核细胞培养CAPRI细胞，采用CIK技术制备CIK细胞，分别按每天尾静脉注射含1×106个细胞的0.1ml生理盐水，连续给药一周。21天后或小鼠死亡时测量肿瘤体积并记录小鼠存活时间(共观察45天)，统计学分析结果见表2，图4-图5。
表2裸鼠肿瘤最大直径比较
CAPRI细胞组 CIK细胞组 3.3mm 7.1mm 2.5mm 6.3mm 3.7mm 6.8mm 2.9mm 6.9mm 3.4mm 7.5mm 2.7mm 5.9mm 3.083±0.187mm 6.750±0.234mm
t＝12.26，P＜0.01
实施例4 CAPRI细胞对恶性黑色素瘤患者的疗效
恶性黑色素瘤患者，女性，年龄75岁，患者因其他状况未接受手术及放化疗，经患者同意进行每周3次CAPRI细胞治疗，每次注射CAPRI细胞80×106个，注射方式为肿瘤周边多点皮下注射，注射点距肿瘤边沿5mm，疗程持续12周，结果见图6。
实施例5 CAPRI细胞对不能手术且放化疗不敏感的非小细胞肺癌患者的疗效
非小细胞肺癌患者，女性，年龄65岁，经评估患者不能手术，且肿瘤对放化疗不敏感。2009年8月开始进行CAPRI细胞免疫治疗，到2015年12月2日，共抽血培养4次，回输33次，每次回输细胞量约1亿，期间患者未接受除CAPRI细胞以外的任何治疗。目前病灶稳定，似较前略有缩小，病人一般情况良好，自觉较前改善，结果见图7。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
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