技术领域
本发明属于医药学技术领域，尤其涉及一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法。
背景技术
漆酶(EC 1.10.3.2)是一种多铜氧化酶，从底物吸收电子，传递给氧气生成水，具有环保和高效的特点。漆酶底物范围很广，包括邻苯二酚、对苯二酚、多酚、甲氧基替代酚、氮羟基化合物、苯胺和呈现还原性的有机化合物。因为环保高效且具有广泛的底物谱，漆酶在很多领域都有巨大的应用潜力，如生物修复、生物合成、生成检测和生物质能源等等。在漆酶催化的反应往往需要在有机介质中进行，一般来说,在有机介质中酶催化反应具有以下优点:(1)增加反应物的溶解度；(2)使反应平衡发生移动；(3)分离简单。
然而，有机介质往往使漆酶的稳定性和活性较低，因此,需要对野生型漆酶进行改造，筛选耐受有机溶剂的漆酶突变体，
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法，旨在解决有机介质使漆酶的稳定性和活性降低的问题。
本发明是这样实现的，一种耐受有机溶剂漆酶衍生物，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQ ID NO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQ ID NO2。
本发明的另一目的在于提供一种所述耐受有机溶剂漆酶衍生物制备的漆酶。
本发明的另一目的在于提供一种耐受有机溶剂漆酶衍生物的制备方法，其包括以下步骤：
引物的设计：把待突变的氨基酸的核苷酸序列换成突变后的核苷酸序列，再加上突变位点前后各6个氨基酸的核苷酸序列组成正向引物，再把正向引物反向互补得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO3；T480A的反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO4；T480F的正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO5；T480F的反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO6；
Dpn Ⅰ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，扩增条件:94度,5分钟；94度,1分钟；68度,30秒；72度,1分钟；循环30次；72度,5分钟；冷却到4度；
退火：将酶切后产物混合，72℃反应10min后室温退火；
纯化回收：将退火后的产物用试剂盒纯化回收；
转化：将回收产物转化到感受态DH5α中；
测序：将转化平板中的菌落送去测序验证，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株。
进一步，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株后还需进行突变体蛋白的纯化；突变体蛋白的纯化方法包括：
(1)离心收集过夜诱导的菌体，重悬浮于50mMNaCl,25mMTris-HCl pH 8.0的Buffer中，超声破碎；
(3)将破碎后的菌体12000rpm离心30min，将上清液进行GST亲和层析，并在亲和柱中加入PPase过夜酶切，以去除融合蛋白中的GST标签；
(4)将PPase酶切后的突变体蛋白进行Resource Q和Mono Q的离子交换纯化。
进一步，所述突变体蛋白的纯化前需进行蛋白的培养；蛋白的培养方法包括：
1)将保存在-80℃的突变体菌株划线到LB固体平板中，37℃过夜活化；
2)从活化好的固体平板中挑起单菌落于10ml有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化做种子液；
3)按0.5％的接种量将种子液接种于1L有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm培养；
4)当OD600为0.6时，加入IPTG使终浓度为0.2mM，加入硫酸铜使终浓度为0.25mM，18℃、180rpm过夜诱导。
本发明提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物及其制备方法，通过Dpn Ⅰ法构建突变体，最终获得CotA的突变体T480A和T480F。CotA、T480A和T480F在乙醇、甲醇、乙腈和DMSO这四种有机溶剂中对底物ABTS的酶活，有三个趋势：第一，在水溶液条件下，T480A的酶活比野生型蛋白提高60％；第二，在30％的乙醇溶液中，T480A仍能保持比野生型在水溶液中的活性高19％的水平，而野生型蛋白活性则降低了18％；第三，在40％的甲醇溶液中，T480A仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，而野生型蛋白活性则降低了32％；第三，在30％的乙腈溶液中，T480A仍能保持相当于野生型在水溶液中71％的活性，而野生型蛋白活性则只有水溶液中活性的46％。第四，在20％的DMSO溶液中，T480A仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，而野生型蛋白活性则只有水溶液中活性的68％。本发明利用定点突变，得到了突变体T480A和T480F，T480A在30％的乙醇溶液中，仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，T480A在40％的甲醇溶液中，仍能保持相当于野生型在水溶液中的活性水平，为T480A应用于工业生产中奠定了基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的CotA WT、T480A和T480F在乙醇中对底物ABTS的酶活图；
图3是本发明实施例提供的CotA WT、T480A和T480F在甲醇中对底物ABTS的酶活图；
图4是本发明实施例提供的CotA WT、T480A和T480F在乙腈中对底物ABTS的酶活图；
图5是本发明实施例提供的CotA WT、T480A和T480F在DMSO中对底物ABTS的酶活图。
图6是本发明实施例提供的野生型CotA及其突变体(T480A和T480F)纯化后的SDS-PAGE电泳示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明实施例提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物，该耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体为T480A和T480F；所述T480A的核苷酸序列为SEQ ID NO1；所述T480F的核苷酸序列为SEQ ID NO2。
如图1所示，本发明实施例提供的耐受有机溶剂漆酶衍生物制备方法，包括以下步骤：
S101：引物的设计：把待突变的氨基酸的核苷酸序列换成突变后的核苷酸序列，再加上突变位点前后各6个氨基酸的核苷酸序列组成正向引物，再把正向引物反向互补得到反向引物；T480A的正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO3；T480A的反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO4；T480F的正向引物核苷酸序列为SEQ ID NO5；T480F的反向引物核苷酸序列为SEQ ID NO6；
S102：Dpn Ⅰ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，并将得到的产物用Dpn Ⅰ酶在37℃下酶切5h；
S103：退火：将酶切后产物混合，72℃反应10min后室温退火；
S104：纯化回收：将退火后的产物用试剂盒纯化回收；
S105：转化：将回收产物转化到感受态DH5α中；
S106：测序：将转化平板中的菌落送去测序验证，得到耐受有机溶剂漆酶衍生物的突变体T480A菌株和T480F菌株。
所述S101中，SEQ ID NO3为：
5’-GTCCTGAGAATCGCGGCGGCATTCGGTCCGTACAGCGGAC-3’；
SEQ ID NO4为：
5’-GTCCGCTGTACGGACCGAATGCCGCCGCGATTCTCAGGAC-3’；
SEQ ID NO5为：
5’-GTCCTGAGAATCGCGGCGTTCTTCGGTCCGTACAGCGGAC-3’；
SEQ ID NO6为：
5’-GTCCGCTGTACGGACCGAAGAACGCCGCGATTCTCAGGAC-3’。
步骤S102中：Dpn Ⅰ酶切消化：分别用正反向引物对pGEX6P-1-CotA质粒进行扩增，扩增条件:94度,5分钟；94度,1分钟；68度,30秒；72度,1分钟；循环30次；72度,5分钟；冷却到4度。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述.
突变体的构建
1、原理
来源于常规大肠杆菌的模板质粒，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
2、突变体构建结果
通过Dpn Ⅰ法构建突变体，最终获得CotA的突变体T480A和T480F。
二、CotA和突变体蛋白的纯化
1、蛋白的培养
(1)将保存在-80℃的突变体菌株划线到LB固体平板中，37℃过夜活化。
(2)从活化好的固体平板中挑起单菌落于10ml有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜活化做种子液。
(3)按0.5％的接种量将种子液接种于1L有氨苄抗性的液体LB培养基中，37℃、200rpm培养。
(4)当OD600为0.6时，加入IPTG使终浓度为0.2mM，加入硫酸铜使终浓度为0.25mM，18℃、180rpm过夜诱导。
2、蛋白的纯化
(1)离心收集过夜诱导的菌体，重悬浮于50mMNaCl,25mMTris-HCl pH 8.0的Buffer中，超声破碎。
(3)将破碎后的菌体12000rpm离心30min，将上清液进行GST亲和层析，并在亲和柱中加入PPase过夜酶切，以去除融合蛋白中的GST标签。
(4)将PPase酶切后的突变体蛋白进行Resource Q和Mono Q的离子交换纯化。
3、蛋白纯化结果
经SDS-PAGE电泳检测,野生型CotA及其突变体T480A和T480F的纯度达到95以上,可以用于有机溶剂耐受性实验。
如图6所示，野生型CotA及其突变体(T480A和T480F)纯化后的SDS-PAGE电泳图。
三、CotA及其突变体(T480A和T480F)在四种有机溶剂中对底物ABTS的酶活
方法：将0.1M磷酸氢二钠-柠檬酸(pH 4.0)Buffer和相应浓度的有机溶剂试剂混合后加入10ul的20mM ABTS底物后再加入1ul或2ul的酶构成200ul的反应体系，用酶标仪在40℃条件下每5s读取一个420nm吸光值，然后经过线性拟合算出最大反应速率Vmax，单位为u mol/u mol/min，数据及结果如下：
1、CotA WT、T480A和T480F在乙醇中对底物ABTS的酶活
下图是CotA WT、T480A和T480F在乙醇中对底物ABTS的酶活，分别用酶活的百分数表示，如图2。
百分数的图是将没有有机溶剂条件下的野生型酶活定100％,其余测试与之比较得到相应的百分比做的图，在图中都可以看出T480A的酶活要高于其他两个。
从图中可以看出：三个蛋白在乙醇中对底物ABTS酶活有一个先升后降的过程，也就是说低浓度的乙醇有增加酶活的作用，大概在乙醇浓度为20％时酶活最高(T480A有点例外)，之后随着乙醇浓度的增加酶活降低。
2、CotA WT、T480A和T480F在甲醇中对底物ABTS的酶活
如图3所示，从图中可以看出：三个蛋白在甲醇中对底物ABTS酶活有一个先升后降的过程，也就是说低浓度的甲醇有增加酶活的作用，在甲醇浓度为20％时酶活最高(T480A有点例外)，之后随着甲醇浓度的增加酶活降低。
3、CotA WT、T480A和T480F在乙腈中对底物ABTS的酶活
如图4所示，从图中可以看出：随着乙腈浓度的逐渐上升，三个蛋白对底物ABTS酶活逐渐降低，但在乙腈浓度为40％或50％时酶活有点反弹，之后随着乙腈浓度的增加酶活降低。
4、CotA WT、T480A和T480F在DMSO中对底物ABTS的酶活
如图5所示，从图中可以看出：三个蛋白在DMSO中对底物ABTS酶活有一个先升后降的过程，也就是说低浓度的DMSO有增加酶活的作用，大概在DMSO浓度为10％或20％时酶活最高(T480F有点例外)，之后随着DMSO浓度的增加酶活降低。
综合CotA、T480A和T480F在乙醇、甲醇、乙腈和DMSO这四种有机溶剂中对底物ABTS的酶活，可以看出三个趋势：第一，在没有有机溶剂和四种有机溶剂中T480A的酶活最高；第二，低浓度的有机溶剂乙醇、甲醇和DMSO有增加酶活的作用，而乙腈没有；第三，三个蛋白对四种有机溶剂的耐受性有差异，最耐受的是甲醇，最不耐受的是DMSO。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。