一种提高漆酶生产强度的方法 【技术领域】
本发明涉及一种提高漆酶生产强度的方法，特别是一种通过添加表面活性剂提高漆酶生产强度的方法。
背景技术
漆酶(benzenediol：oxygen oxidoreductase，EC 1.10.3.2)，是一种含铜的多铜氧化酶，氧化多种酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物，催化去除由酚或芳香氨基提供的一个电子或质子，分别形成苯氧基自由基和氨基自由基。在高效介质的协助下，如2，2′-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(简称ABTS)，漆酶还可以氧化非酚类化合物。由于具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在有毒化合物的降解、生物制浆、生物漂白、芳香化合物转化和生物传感器构建等方面具有重要的应用价值，在酚类污染物的处理方面，真菌漆酶作为生物催化剂已显示了良好的应用前景。
由于漆酶巨大的应用价值，漆酶产生菌的分离筛选一直是漆酶研究的热点之一，但是效果并不明显。从现有报道看，漆酶最主要来源于白腐真菌，这些菌也是目前报道最有效的芳香族类化合物的降解菌。但白腐真菌发酵周期一般较长，生产强度较低。生产强度是指单位时间内单位罐体积的产物积聚量，对于酶制剂来说其因次为U/(L·h)。生产不能只单纯的追求高产量(单位为U/L)，而不顾产品的生产强度，生产强度是衡量产品经济性能的重要指标。因此，开发新的漆酶生产菌、提高漆酶生产强度、探讨其应用潜力势在必行。
表面活性剂是一类分子中含有亲水基和亲油基，双亲结构的有机化合物，这两种特殊结构使表面活性剂表现出多种多样的实用功能。在发酵工程领域，国内外报道多数集中在表面活性剂作为发酵促进剂应于应用于氨基酸、酶、胶质、新型材料、药物的生产中提高了目的物的产量，而未见表面活性剂能够明显缩短发酵周期、提高生产强度的报道。在同样微生物生产能力的前提下，发酵周期的缩短意味着人力、物力成本大大降低，符合节能、减排、环保型社会的发展趋势。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种提高漆酶生产强度的方法。在拟青霉菌(Paecilomyces sp.)(CCTCC M 209240)发酵过程中添加非离子型表面活性剂Tween 80，发酵周期由8天缩短为6天，明显缩短了发酵时间，提高了漆酶的生产强度。
为解决上述问题，本发明的技术方案是将保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC M 209240的拟青霉菌(Paecilomyces sp.)接种于斜面培养基，30℃条件下，培养6-7天，备用；将培养的菌株，用无菌生理盐水制备为孢子悬浮液，取2mL孢子悬液接种于种子培养基中，置摇床上以旋转转速为200rpm、30℃培养32小时，即制得液体种子培养物。将制得的液体种子培养物以5％(v/v)接种量接入发酵产酶培养基中，150rpm、30℃培养3-4天后，加入0.5-1.5g/L Tween 80，培养6-8天，每天取样测定漆酶活力。
斜面培养基需利于真菌的生长，其中优选斜面培养基组成为：土豆浸出液200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。种子培养基需利于真菌的生长繁殖，其中优选种子培养基组成为：葡萄糖40g/L，NaNO3 3g/L，KH2PO4 1g/L，豆饼粉5g/L。产酶培养基需利于漆酶的生产，其中优选组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，CuSO4 100μM，初始pH 6.5。
漆酶活力的测定方法是：发酵液8000g离心10min后，取上清液备用。以ABTS为底物，测定30℃时，反应液在420nm处吸光值的变化。1mL反应液中含有1mM ABTS，0.1mL发酵上清液，0.8mL 100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.4)。每分钟氧化1μmol ABTS所需的酶量定义为一个酶活单位。由于酶是蛋白质，不同类型表面活性剂可能会导致酶活力下降。但Tween 80对菌体量及漆酶活力均有一定得改善，其中当浓度为1.5g/L时，发酵周期由8天缩短为6天，酶活力相应提高。
本发明具有如下特点
提供一种通过在发酵培养过程中加入表面活性剂缩短微生物发酵周期从而提高漆酶生产强度的方法，非离子型表面活性剂Tween 80特别适合应用于酶制剂的发酵过程，在对酶活影响不大的情况下，明显缩短了微生物的培养时间，提高了生产强度，降低了漆酶的生产成本，具有明显的经济优势。
本发明提供的方法提高了漆酶生产的经济指标，工艺简单，原料来源丰富，缩短了漆酶的生产时间，胞外漆酶的生产强度提高了53％，漆酶产量提高了15％，具有诱人的工业应用前景。
【具体实施方式】
实施例1
1、种子液的制备
将拟青霉菌(CCTCC M 209240)接种于斜面培养基，30℃条件下，培养6-7天，备用；将培养好的菌株，用无菌生理盐水制备为孢子悬浮液，取1mL孢子悬液接种于种子培养基中，置摇床上以旋转转速为200rpm、30℃培养32小时，即制得液体种子培养物。斜面培养基组成为：土豆浸出液200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。种子培养基组成为：葡萄糖40g/L，NaNO3 3g/L，KH2PO4 1g/L，豆饼粉5g/L。
2、发酵产酶
将制得的液体种子培养物以5％(v/v)接种量接入发酵产酶培养基中，150rpm、30℃培养3天后，加入0.5g/L的Tween 80，培养6-8天，每天测定漆酶活性。发酵产酶培养基组成为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，CuSO4 100μM，初始pH 6.5。
结果表明，通过在发酵第3天加入较高浓度的表面活性剂0.5g/L的Tween 80，酶活在第7天达到最高4814U/L，明显缩短了发酵周期；同时，其胞外漆酶量及生产强度与未添加相比分别提高了20％和37.4％。
实施例2
1、种子液的制备。
同实施例1，
2、发酵产酶
将制得的液体种子培养物以5％(v/v)接种量接入发酵产酶培养基中，150rpm、30℃培养3天后，加入1g/L的Tween 80，培养6-8天，每天测定漆酶活性。发酵培养基组成为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，CuSO4 100μM，初始pH 6.5。
结果表明，通过在发酵第3天加入较高浓度的表面活性剂1g/L的Tween80，酶活在第7天达到最高4683U/L，明显缩短了发酵周期；同时，其胞外漆酶量及生产强度与未添加相比分别提高了17％和33.8％。
实施例3
1、种子液地制备
同实施例1。
2、发酵产酶
将制得的液体种子培养物以5％(v/v)接种量接入发酵产酶培养基中，150rpm、30℃培养3天后，加入1.5g/L的Tween 80，培养6-8天，每天测定漆酶活性。发酵培养基组成为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，CuSO4 100μM，初始pH 6.5。
结果表明，通过在发酵第3天加入较高浓度的表面活性剂1.5g/L的Tween 80，酶活在第6天达到最高4583U/L，明显缩短了发酵周期；同时，其胞外漆酶量及生产强度与未添加相比分别提高了15％和53％。
实施例4
1、种子液的制备
同实施例1。
2、将制得的液体种子培养物以5％(v/v)接种量接入发酵产酶培养基中，150rpm、30℃培养4天后，加入1.5g/L的Tween 80，培养6-8天，每天测定漆酶活性。发酵培养基组成为葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉2g/L，CuSO4 100μM，初始pH 6.5。
结果表明，通过在发酵第4天加入较高浓度的表面活性剂1.5g/L的Tween 80，酶活在第6天达到最高3769U/L，明显缩短了发酵周期；虽然其胞外漆酶量下降了4.6％，但是由于发酵周期的缩短生产强度与未添加相比分别提高了25.6％。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。