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一种快速筛选加氧酶微生物或加氧酶基因的方法
    技术领域 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种快速筛选加氧酶微生物或者加氧酶基 因的方法。
     背景技术 生物催化以其高度的化学、 区域、 立体选择性和反应条件温和， 后处理容易， 能耗 低等优势成为当今化工生产和相关技术领域的发展潮流， 并已成功应用于许多领域。生物 酶是生物催化技术的核心， 新型高效催化酶的获得成为该领域的技术瓶颈。 目前， 加氧酶的 开发利用还非常有限， 其中重要的原因之一就是传统加氧酶的筛选方法存在许多局限， 使 得很难筛选到高效、 高选择性的加氧酶菌株和基因。
     本发明提到的加氧酶， 包括环氧化酶和芳环双加氧酶， 如萘双加氧酶等， 目前其筛 选方法主要有三类。一类是通过利用唯一碳源筛选菌株。由于环境样品可利用同一碳源的 微生物种群非常丰富， 这种方法在筛选过程中往往会得到大量的微生物， 而目标产加氧酶 菌株很难从中筛选到， 特别是在处理特殊环境样本时， 如加氧酶丰富的活性污泥， 极易受到 其他功能微生物的干扰， 如琼脂利用型细菌， 假阳性率很高。一类是直接用薄板层析、 高压 液相或气相等分析手段检测所筛目标加氧酶的催化产物， 如苯乙烯环氧化酶筛选中， 通过 测定产物苯乙烯环氧的生成来检测酶的存在 ( 例如， Park et al.(2005)Korean J.Chem. Eng.， 22(3)， 418 ～ 424)。这种方法通量低， 耗时长， 更重要的是， 由于采用天然底物， 其氧 化产物在微生物体内往往会被下游多个酶迅速连续代谢， 很难捕捉到中间的目标加氧酶的 催化产物， 导致漏检率极高。第三类是根据加氧酶氧化其他易检测的底物来间接证明酶的 存在， 如加氧酶 ( 环氧化酶， P450 单加氧酶等 ) 筛选中可用 1- 氢吲哚为底物， 通过检测颜 色生成来获知加氧酶的存在 ( 如， Hellemond et al.(2007)Appl.Environ.Microbiol.， 73(18)， 5832 ～ 5839)。这种方法已被应用于重组酶的筛选， 而针对环境样本筛选天然源微 生物则尚未见报道。此方法较为直观简便， 但以 1- 氢吲哚为底物， 显色时间长， 多达 4 天以 上， 而且产物为靛蓝和靛玉红的混合物， 导致形成的蓝色浅， 产物摩尔吸光系数较低， 与大 肠杆菌菌体的黄色混合后呈黄绿色， 不易识别， 极易造成加氧酶有益资源的漏筛。 有文献报 道 4- 取代吲哚经氧化偶联后由于 4 位的位阻原因无法生成 4， 4’ - 二取代靛玉红， 只能生成 单一的产物 4， 4’ - 二取代靛蓝， 这个特点显示出 4- 取代吲哚在显色反应方面的应用潜力 优于 1- 氢吲哚 (Polychronopoulos et al.(2004)J.Med.Chem.， 47， 935 ～ 946 ； Wu etal. (2005)Chem.Biodivers.， 2， 51 ～ 65)。在重组酶细胞色素 P4502A6 的定向进化研究中， 报 道了利用 4- 氯吲哚开展突变子筛选的方法， 但是迄今为止， 也尚未见报道针对环境样品筛 选天然源微生物。
     发明内容
     本发明目的是提供一种从环境样品中快速筛选加氧酶的方法， 即在筛选培养基中 加入 4- 取代吲哚， 经加氧酶氧化生成可直接观察的蓝色物质 4， 4’ - 二取代靛蓝， 从而简便、快速、 灵敏的从环境样品中筛选出目的加氧酶。
     本发明的具体方案是 ：
     1. 环境样品中筛选产加氧酶菌株
     产加氧酶菌株筛选包括以下步骤为 ：
     ①富集环境样品 ： 环氧化酶富集采用苯乙烯或环己烯或对溴苯乙烯或甲基苯乙烯 为唯一碳源 ； 萘双加氧酶富集选用萘或者蒽为唯一碳源 ； 并添加无机盐， 30℃震荡培养富 集环境样品 5 ～ 15 天。
     ②以无机盐、 唯一碳源、 4- 取代吲哚以及 0.01％～ 0.1％的酵母粉制备琼脂固体 培养基， 富集的环境样品涂布于培养基上， 生长 1 ～ 5 天， 出现蓝色菌落， 将蓝色菌落以相同 组分的培养基分离， 纯化， 获得产目标加氧酶的微生物菌株。
     无机盐可为常用的 M9 无机盐 ( 分子克隆实验指南， 中文版， 第三版， 下册， 页 码： 1595 ～ 1596) 或者文献报道的 M12 无机盐 (Hartmans et al.(1989)Appl.Environ. Microbiol.， 55(11)， 2850 ～ 2855)。
     唯一碳源的浓度为 0.05 ～ 8mM。
     4- 取代吲哚浓度为 0.05 ～ 1mM， 4- 取代吲哚为 4- 甲基吲哚或 4- 吲哚甲酸甲酯或 4- 氯吲哚或 4- 溴吲哚或 4- 氟吲哚或 4- 甲氧基吲哚。 2. 环境样品构建的元基因组库中筛选加氧酶基因包括以下步骤 ：
     ①构建环境样品的元基因组文库 ： 以 CTAB 法从环境样品中提取总 DNA， 并纯化， 将 纯化好的总 DNA 酶切， 经 0.8％琼脂糖凝胶电泳后， 回收 1 ～ 10Kb 之间的片段 ； 载体质粒以 相同酶酶切， 并用去磷酸化酶 (CIP) 处理。 将回收得到 1 ～ 10Kb 之间的 DNA 片段连入载体， 连接产物经醇沉处理， 用去离子水溶解， 电转化大肠杆菌感受态细胞， 构建环境样品元基因 组文库。
     ②从元基因组文库中筛选加氧酶基因 ：
     将元基因组文库质粒转入宿主大肠杆菌， 涂布于固体筛选平板上。 培养基组分为 ： LB 固体培养基中加入 4- 取代吲哚、 IPTG 0.2 ～ 1mM 和载体相应的抗生素。转化子在筛选 平板上生长 1 ～ 2 天或者于 4℃再放置 1 ～ 5 天， 可出现蓝色重组菌落， 挑出， 得到含有加氧 酶基因的重组子。
     环境样品基因组文库可以是环境样品基因组总 DNA 直接构建的文库， 也可以是经 样品富集后构建的目标加氧酶文库。
     文库构建中选用的载体为 pBluescript SK 或 pBluescript KS 或 pUC18 或 pUC19 或 pKK233 或 pKK223 或 pET-28 或 pET-32 载体 ； 文库筛选中宿主大肠杆菌为 DH1 或 DH5α 或 DH10B 或 JM109 或 MC1061 或 BL21(DE3) 或 XL-Blue。
     本发明利用许多加氧酶可以将 4- 取代吲哚氧化， 生成单一的深蓝色物质 4， 4’ -二 取代靛蓝， 其产物单一， 摩尔吸光系数高， 因此大大提高了筛选灵敏度。可以高通量， 简便， 快速， 灵敏的筛选环境样品中存在的加氧酶资源。本方法可用于筛选环氧化酶和芳环双加 氧酶， 如萘双加氧酶等多种加氧酶。
     附图说明
     图 1 为筛选平板 ；图 2 为纯化平板 ；
     图 3 为筛选菌株进化树 ；
     图 4 为筛选菌株环氧化酶进化树 ；
     图 5 为整细胞转化 4- 取代吲哚后的萃取物照片， 其中 (1) 为 4- 溴吲哚， (2) 为 4- 氟吲哚， (3) 为 4- 吲哚甲酸甲酯， (4) 为 4- 甲氧基吲哚， (5) 为 4- 甲基吲哚， (6) 为 4- 氯 吲哚。 具体实施方式
     实施例 1 以 4- 氯吲哚为底物筛选产环氧化酶菌株
     于某污水处理厂取活性污泥样品， 富集于含有 M12 无机盐和苯乙烯 ( 浓度为 2mM) 的培养基中， 30 ℃， 225rpm 培养 10 天。将富集培养液稀释至筛选平板上 (M12+ 苯乙烯 2mM+4- 氯吲哚 0.1mM+0.01％酵母粉 +1.5％琼脂粉 ) 于 30℃培养 3 天， 每支平板上可见多 个成片蓝色菌斑 ( 图 1)， 挑出， 继续纯化 ( 图 2)， 得到 11 株纯菌株。
     实施例 2 以 4- 甲基吲哚为底物筛选产环氧化酶菌株
     样 品 及 富 集 方 法 同 实 施 例 1， 将 富 集 培 养 液 稀 释 至 筛 选 平 板 上 (M9+ 苯 乙 烯 2mM+4- 甲基吲哚 0.2mM+0.05％酵母粉 +1.5％琼脂粉 ) 于 30℃培养 3 天， 出现蓝色菌斑， 继 续纯化， 得到 15 株纯菌株。
     实施例 3 以 4- 引哚甲酸甲酯为底物筛选产环氧化酶菌株
     样 品 及 富 集 方 法 同 实 施 例 1， 将 富 集 培 养 液 稀 释 至 筛 选 平 板 上 (M9+ 苯 乙 烯 3mM+4- 引哚甲酸甲酯 0.3mM+0.06％酵母粉 +1.5％琼脂粉 ) 于 30℃培养 4 天， 出现蓝色菌 斑， 继续纯化， 得到 12 株纯菌株。
     实施例 4 以 4- 溴吲哚为底物筛选产环氧化酶菌株
     取自另一污水处理厂样品， 富集方法同实施例 1， 将富集培养液稀释至筛选平板上 (M9+ 苯乙烯 3mM+4- 溴吲哚 0.2mM+0.05％酵母粉 +1.5％琼脂粉 ) 于 30℃培养 4 天， 出现深 蓝色菌斑， 继续纯化， 得到 10 株纯菌株。
     实施例 5 筛选菌株碳源利用情况
     实施例 1、 2、 3、 4 筛选的菌株， 分别以苯乙烯和苯乙烯环氧为唯一碳源培养， 分别 为 M12+ 苯乙烯 5mM ； M12+ 苯乙烯环氧 3mM。24h 后， 所有菌株均能在两种培养基中生长， 即 筛选菌株能以苯乙烯和苯乙烯环氧为唯一碳源， 具有苯乙烯至苯乙烯环氧这一代谢途径， 因此可产生这一途径所需的环氧化酶。
     实施例 6 产环氧化酶菌株的 16S rRNA 鉴定
     实 施 例 1、 2、 3、 4 筛 选 的 菌 株 是 可 利 用 苯 乙 烯、 苯 乙 烯 环 氧 为 唯 一 碳 源 生 长， 并 使 4- 取 代 吲 哚 变 蓝 的 菌 株。 为 验 证 这 些 菌 株 为 目 的 菌 株， 对 其 进 行 16S rRNA 鉴 定。 以 细 菌 通 用 引 物 扩 增 16S rRNA 序 列。 引 物 为 F ： 5’ -AGAGTTTGATCCTCGCTCAG， R： 5’ -GGTCTACCTTGTTACGACTT， 得到扩增片段大小为 1498bp。经比对， 其基因序列有数十个碱 基差异。其中， 实施例 1 有三种 16S rRNA 序列不同的菌株， 实施例 2、 3 所得菌株与实施例 1 完全相同 ( 实施例 1 和 2、 3 来自同一活性污泥样品 )， 而实施例 4 则有二种 16S rRNA 序 列不同的菌株。经比对分析， 所筛菌株全部为假单胞菌属。选择实施例 1、 2、 3 筛选的 16S rRNA 序列不同的三株菌 WLS1-1、 WLS1-5、 WLS1-8 和实施例 4 筛选的 WLS4-1、 WLS4-9 作进化树分析。图 3 为筛选菌株进化树， 其中 Pseudomonas sp.VLB 120 为已报道的具有环氧化酶 功能的假单胞菌， 所筛菌株与 VLB 120 菌株已报道的 16S rRNA 基因序列相似度均＞ 99％， 证明采用本发明筛选的菌株为产环氧化酶的假单胞菌。
     实施例 7 环氧化酶基因特征片段的验证
     经实施例 6 鉴定， 筛选菌株为假单胞菌。为进一步证实这些菌株含有环氧化 酶基因序列， 将上述 5 株筛选菌扩增环氧化酶基因 styA 部分特征片段。根据 NCBI 基 因 库 中 报 道 的 假 单 胞 菌 环 氧 化 酶 序 列， 设 计 引 物， F： 5’ -ATGAAAAAGCGTATCGGTATTG ； R： 5’ -TTCTCGAAGGGCGAGTTTTC， PCR 扩增得到 488bp 片段， 命名为 styAsp。图 4 为筛选菌株特 征片段 styAsp-1 和 styAsp-2 与已报道的假单胞菌来源的环氧化酶的相似度分析， 其相应 片段相似度为 97％～ 100％。因此， 采用本发明筛选的菌株为产环氧化酶 ( 苯乙烯单加氧 酶 ) 的假单胞菌菌株。
     实施例 8 以 4- 甲基氧吲哚为底物筛选产萘双加氧酶的菌株
     样 品 来 源 同 实 施 例 1， 富 集 于 含 有 M12 无 机 盐 和 萘 ( 浓 度 为 7mM) 的 培 养 基 中， 30 ℃， 225rpm 培 养 12 天。 将 富 集 液 稀 释 至 筛 选 平 板 上 (M12+ 萘 7mM+ 甲 氧 基 吲 哚 0.6mM+0.06％酵母粉 +1.5％琼脂粉 ) 于 30℃培养 7 天， 平板上有蓝色菌斑出现， 分离、 纯化 得到 23 株纯菌株 ( 编号为 NPCL-1 至 NPCL-23)。 实施例 9 以 4- 氟吲哚为底物筛选产萘双加氧酶的菌株
     样 品 来 源 同 实 施 例 4， 培 养 方 法 同 实 施 例 8， 筛 选 底 物 为 4- 氟 吲 哚 ( 浓 度 为 0.3mM)， 将蓝色菌斑分离纯化得到 15 株菌株 ( 编号为 NPF-1 至 NPF-15)。
     实施例 10 筛选菌株以萘为唯一碳源生长情况
     实施例 8、 9 筛选的菌株以萘为唯一碳源培养， 即 M12+ 萘 5mM， 结果显示所有菌株均 能以萘为唯一碳源生长， 可产萘双加氧酶。
     实施例 11 产萘双加氧酶菌株的 16S rRNA 鉴定
     为验证实施例 8 和 9 得到的菌株为产萘双加氧酶的菌株， 任选其中标号为 NPCL-2、 NPCL-5、 NPF-7、 NPF-11 的 4 株进行 16S rRNA 鉴定。其中 NPCL-5 鉴定为铜绿假单胞菌属细 菌， NPCL-2、 NPF-7、 NPF-11 为伯克霍尔德菌属细菌。这两类菌均有产萘双加氧酶的报道， 进 一步证明采用本发明方法筛选到的菌株为产萘双加氧酶的菌株。
     实施例 12 萘双加氧酶基因特征片段的验证
     对 实 施 例 11 所 述 的 4 株 菌 的 萘 双 加 氧 酶 基 因 进 一 步 验 证， 分别扩 增 PAH 基 因， 该 基 因 为 革 兰 氏 阴 性 细 菌 降 解 PAHs 类 化 合 物 的 环 羟 基 化 双 加 氧 酶 (ring-hydroxylating-dioxygenase， RHD)α 亚基的部分基因。
     PAH 基 因 扩 增 采 用 简 并 引 物， F： 5’ -GAGATGCATACCACGTKGGTTGGA ； R： 5’ -AGCTGTTGTTCGGGAAGAYWGTGCMGTT， 扩增片段长度为 306bp。
     表 1 筛选菌株 PAH 基因片段验证
     进 一 步 扩 增 假 单 胞 菌 属 的 NPCL-5 中 nahAc 基 因 ( 假 单 胞 菌 萘 双 加 氧 酶 基 因 ) 的 保 守 序 列。NahAc 基 因 扩 增 采 用 简 并 引 物， F： 5’ -CCCYGGCGACTATGTTACC ； R： 5’ -CTCRGGCATGTCTTTTTCGAC。
     经测序后比对， NPCL-5 扩增得到的片段长度为 866bp， 与报道的菌株 Pseudomonas putida NCIB 9816-4 的萘降解质粒 pDTG1 上的基因 (AF491307) 完全相同 (100％ )， 而该菌 是研究最早的萘降解菌， 其产生的萘双加氧酶 (NDO) 具有广泛的底物选择性， 可立体选择 催化顺式双羟化反应、 单加氧、 去饱和、 O- 和 N- 脱烃基作用、 磺化氧化， 所能利用的芳烃底 物达 60 余种。
     因此， 所鉴定的上述 4 株菌含萘双加氧酶基因， 本发明涉及的筛选方法可得到萘 双加氧酶微生物菌株。
     实施例 13 环境样品元基因组文库的构建
     1、 活性污泥总 DNA 的提取
     活 性 污 泥 的 提 取 采 用 CTAB 法， 参 见 文 献 Zhou et al.(1996)Appl.Environ. Microbiol.， 62(2)， 316 ～ 322。
     具体步骤为 ： 将缓冲液 (100mM Tris-HCl， pH8.0 ； 100mM EDTA-Na2 ； 100mM 磷酸盐， pH8.0 ； 1.5M NaCl ； 1％ CTAB， m/v)， 蛋白酶 K 和活性污泥样品置于离心管中， 37℃震荡培养 半小时， 加入 20％ SDS 于 65℃处理 2h 后， 低速离心取上清 ； 再次加缓冲液于沉淀中， 加入 20％ SDS 于 65℃处理 15min 后， 低速离心收集上清 ； 向收集的上清液中加入等体积苯酚 - 氯 仿混匀， 低速离心， 收集上清 ( 如果样品杂质较多， 可将此上清加等体积氯仿重洗一次 )， 而 后加入 0.6 ～ 1 倍体积的异丙醇， 温室下静置过夜 ； 小心弃去上清， 加入 200 ～ 500uL ddH2O， 溶解粘附于离心管壁的 DNA 粗提物， 获得总 DNA， -20℃保存。
     2、 活性污泥总 DNA 的纯化
     从活性污泥中提取的总 DNA 含有很多成分复杂的物质诸如腐殖酸等， 会严重影响 后续的分子操作， 在酶切和连接之前， 需要进行纯化。
     总 DNA 经含有 5 ％羟磷灰石 (Fluka， Buchs， Switzerland) 琼脂糖凝胶电泳纯 化 后 (Roh et al.(2005)， ″ In-gelpatch electrophoresis ″ ： A new method for environmental DNA purification.ELECTROPHORESIS， 26(16)， 3055 ～ 3061)， 切胶回收较 纯的总 DNA 再用 TaKaRa RECOCHIP-Chip for DNA Recovery[TaKaRaBiotechnology(Dalia n， China)Co.Ltd.]DNA 凝胶回收试剂盒回收纯化。
     3、 环境 DNA 文库的构建
     纯化好的总 DNA 经 BamHI 酶切， 经 0.8％琼脂糖凝胶电泳后， 用 TaKaRa RECOCHIP 回收 1 ～ 10Kb 之间的片段。pUC19 质粒经 BamHI 酶切后用去磷酸化酶 (CIP) 处理， 防止在 后续连接中的自连。将回收得到 1 ～ 10Kb 之间的 DNA 片段连入 pUC19 载体， 连接产物经醇
     沉处理， 用去离子水溶解， 电转化感受态细胞 DH10B(Bio-Rad MicroPulser 电穿孔仪， 美国 4 Bio-Rad)。得到库容大约 10 的活性污泥元基因组文库。
     实施例 14 从元基因组库中筛选加氧酶基因
     从实施例 13 所构建的文库中筛选环氧化酶基因。 具体方法为 ： 将文库质粒化学转 化至 DH5α， 以含有 4- 氯吲哚的 LB 平板筛选， LB 平板含有 4- 氯吲哚 0.2mM， IPTG 0.4mM， 氨苄青霉素 50μg/L。将转化细胞直接涂布于上述平板上， 37℃培养 1 天后， 于 4℃放置 2 天后观察， 得到 1 个深蓝色重组子。将其挑出， 再次培养于新鲜的上述平板上， 次日可见生 长菌落全为蓝色。 将重组子送样测序， 其插入片段大小为 4380bp， 经 NCBI 比对， 与假单胞菌 VLB120(AF031161.1) 苯乙烯环氧化酶相应的基因簇序列相似度为 98％。因此， 本发明所述 筛选方法可筛出加氧酶基因。
     实施例 15 产环氧化酶菌株整细胞转化检测环氧化酶
     文献报道以 1- 氢吲哚转化生成靛蓝可检测环氧化酶活力， 因此将实施例 1 筛选的 产环氧化酶菌株以整细胞转化 4- 取代吲哚， 检测酶活力。
     菌株培养条件为 ： M12+0.05％酵母粉 +0.1％葡萄糖 +2mM 苯乙烯， 培养 10 小时后， 菌体生长良好， 取出， 4℃冷冻离心收集菌体， 并以 100mM 磷酸钾缓冲液 (pH7.0) 洗涤菌体 2 次。取菌体 0.2g 加入到含有 1％葡萄糖的 3ml 缓冲液中， 加入 4- 取代吲哚 0.4mM， 240rpm， 37℃反应 20 分钟， 反应液变成深蓝色。因此， 筛选菌株具有较高的环氧化酶活力。 图 5 为 6 株不同菌株全细胞转化不同底物的产物萃取物图。 (1) ～ (6) 代表菌株编 号， 左方样品的反应底物为 1- 氢吲哚， 右边为 4- 取代吲哚， 分别为 ： (1)4- 溴吲哚， (2)4- 氟 吲哚， (3)4- 吲哚甲酸甲酯， (4)4- 甲氧基吲哚， (5)4- 甲基吲哚， (6)4- 氯吲哚 ； 其中 (6) 展 示了两个平行样品。由图可以看出， 不同菌株转化 1- 氢吲哚颜色差异较大， 说明不同菌株 环氧化酶活力差异较大 ； 同一菌株转化 1- 氢吲哚和 4- 取代吲哚， 前者转化产物颜色较浅， 而 4- 取代吲哚转化产物颜色更深， 说明 4- 取代吲哚转化产物摩尔吸光系数更高， 检测灵敏 度更高。
     SEQUENCE LISTING
     <110> 中国科学院成都生物研究所
     <120> 一种快速筛选加氧酶微生物或加氧酶基因的方法
     <130> 说明书
     <160>8
     <170>PatentIn version 3.3
     <210>1
     <211>20
     <212>DNA
     <213>bacteriu
     <400>1
     agagtttgat cctcgctcag 20
     <210>2
     <211>20
     <212>DNA
     <213>bacteriu <400>2 ggtctacctt gttacgactt <210>3 <211>22 <212>DNA <213>bacteriu <400>3 atgaaaaagc gtatcggtat <210>4 <211>20 <212>DNA <213>bacteriu <400>4 ttctcgaagg gcgagttttc <210>5 <211>24 <212>DNA <213>bacteriu <400>5 gagatgcata ccacgtkggt <210>6 <211>28 <212>DNA <213>bacteriu <400>6 agctgttgtt cgggaagayw <210>7 <211>19 <212>DNA <213>bacteriu <400>7 cccyggcgac tatgttacc <210>8 <211>21 <212>DNA <213>bacteriu <400>8 ctcrggcatg tctttttcga20tg2220tgga24gtgcmgtt2819c9