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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711094956.2 (22)申请日 2017.11.06 (71)申请人 青岛农业大学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700号青岛农业大学 (72)发明人 王建琳江之瑶尹燕博王守春 (74)专利代理机构 青岛高晓专利事务所(普通 合伙) 37104 代理人 张世功 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多 重PCR方法 (57)摘要 本发。
2、明涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I 群的纳米多重PCR方法， 根据GenBank公布的4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列， 设计 合成各型特异性引物； 提取基因后进行纳米多重 PCR扩增， PCR反应条件为95预变性5min， 94 30s， 53退火1min， 721min49s， 30个循环； 72 延伸10min； 纳米多重PCR扩增反应结束后， 取 PCR产物， 以DL2000为Maker， 1琼脂糖凝胶电 泳， 观察扩增片段大小， 确定病毒的血清型。 本发 明方法明显缩短检测时间； 加入纳米颗粒， 在同 时检测到四种血清型病毒的情况下， 敏感性较普 通多重PCR至少。
3、提高10倍； 特异性强、 敏感性高、 稳定性好， 能快速、 敏感、 准确地对我国主要流行 血清型的禽腺病毒I群进行分型。 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 CN 107841575 A 2018.03.27 CN 107841575 A 1.一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法， 其特征在于按照以下步骤操 作： 第一步， 纳米多重PCR引物设计： 根据GenBank公布的4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群六邻体 基因序列， 设计合成各型特异性引物； 4型禽腺病毒I群引物F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 -AAGAGGCCCGGGCAATGC-3 。
4、； 8a型禽腺病毒I群引物F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 - AATGTTTGACGAGCTGATGGG-3 ； 8b型禽腺病毒I群引物F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 - ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG-3 ； 11型禽腺病毒I群引物F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 - ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG-3 ； 第二步， 基因的提取： 取4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群标准毒株 细胞研磨液400 L于1.5mLEP管中， 加入400 L氯仿、 600 L裂解液， 混匀后4沉淀10min。
5、， 之 后12000r/min离心， 取上清600 L， 加入异丙醇800 L,4沉淀30min后12000r/min离心， 弃 上清后干燥， 用20 L去离子水溶解； 所述裂解液的组成为： 硫氰酸胍9.456g， 硫氰酸胺 3.044g， 醋酸钠13.60g， 甘油5ml， 苯酚38ml， 水57ml； 第三步， 纳米多重PCR扩增:1、 PCR反应 体系： 2Nano-QPCRmix6 L， Taq enzyme 0.2 L， 上、 下游混合引物各1 L， 模板0.5 L， 去离 子水3.3 L； 所述上、 下游混合引物同第一步； 2、 PCR反应条件： 95预变性5min， 9430s，。
6、 53 退火1min， 721min49s， 30个循环； 72延伸10min； 第四步， 琼脂糖凝胶电泳： 纳米多重 PCR扩增反应结束后， 取PCR产物8 L， 以DL2000为Maker， 质量百分比为1的琼脂糖凝胶电 泳， 观察扩增片段大小， 确定病毒的血清型； 扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群， 扩增片 段为1045bp为8a型禽腺病毒I群， 扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群， 扩增片段为674bp 为11型禽腺病毒I群。 2.根据权利要求1所述的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法， 其特 征在于在4、 8a、 8b和11型四种血清型病毒都同时检出的情。
7、况下， 纳米多重PCR的敏感性比普 通多重PCR至少提高10倍。 3.根据权利要求1所述的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法， 其特 征在于应用该方法分别对传染性支气管炎病毒、 减蛋综合症病毒、 H9亚型禽流感病毒和新 城疫的cDNA进行检测， 验证该方法的特异性， 试验结果均未扩增出条带， 仅扩增出4、 8a、 8b 和11型四种血清型禽腺病毒I群的特异性条带。 4.根据权利要求1所述的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法， 其特 征在于取实验室分离保存的、 并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株， 进行纳米多 重PCR分型检测， 检测结果显示， 纳米多重P。
8、CR分型结果与测序结果相一致， 表明本研究建立 的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107841575 A 2 一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法 技术领域: 0001 本发明涉及一种纳米多重PCR方法， 特别是涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群 的纳米多重PCR方法， 属于动物病毒检测技术领域。 背景技术： 0002 禽腺病毒(Fowl adenovirus， FAdV)I群主要包括12个血清型， Changjing Li等 (2016)对我国2006年-2016年来临床禽腺病毒I群的分离毒株Hexon基因进行了测序分析， 表明。
9、我国主要流行的血清型有4、 8a、 8b和11型， 禽腺病毒I群对肉鸡的高感染率和高死亡率 给养鸡业造成了严重的经济损失。 这四种血清型禽腺病毒均引起肉鸡出现严重的肝脏炎症 反应， 引起的临床症状极为相似， 这为临床不同血清型禽腺病毒I群感染的检测带来困难。 此外， 不同血清型禽腺病毒 群之间不能形成交叉保护， 故建立临床禽腺病毒 群感染的检 测方法并对感染病毒进行分型， 对禽腺病毒 群感染的预防与控制具有十分重要的意义。 0003 血清学检测方法是禽腺病毒I群分型的常规方法， 但缺乏标准抗血清， 使得本方法 应用受限。 目前主要通过分子生物学方法进行分型， 主要包括： PCR结合测序， 通过。
10、比较分析 基因序列对毒株进行基因分型； 根据病毒基因组限制性酶切图谱分析分为不同的基因型； 高分辨熔解曲线的基因进行分型。 这三种方法中， 其中第一种为目前最常用的分型方法， 但 这三种方法都需要通过PCR对基因进行扩增后， 进行测序、 酶切和荧光等相关分析， 故由于 费时、 需要特殊仪器及价格昂贵等原因， 不适合于临床大量样品中禽腺病毒I群的分型鉴 定。 0004 建立简便、 快速的临床禽腺病毒I群感染的分型检测方法， 关键在于缩短检测时 间、 去除繁琐的后续分析、 且能一次性准确确定感染病毒的血清型。 目前， 有关禽腺病毒I群 的通用检测方法已有报道， 但现有方法中中尚未见有对我国主要流行。
11、的4、 8a、 8b和11型禽 腺病毒I群的快速简便的分型检测方法的公开。 0005 多重PCR分型方法可通过一次PCR扩增即可确定血清型， 是一种快速、 准确的分型 方法。 为提高普通多重PCR检测的敏感性， 加入纳米颗粒， 建立纳米多重PCR分型方法， 可用 于临床禽腺病毒I群的分型确定。 发明内容： 0006 本发明的目的在于克服现有禽腺病毒I群分型方法中的繁琐、 需特殊仪器、 敏感性 差等方面存在的缺陷， 寻求提供一种快速、 简便、 准确的区分四种血清型禽腺病毒I群的纳 米多重PCR方法。 鉴于目前我国禽腺病毒I群主要流行的为4、 8a、 8b和11型， 建立针对这四种 血清型的多重P。
12、CR区分方法可以快速简便进行分型， 为进一步提高分型方法的敏感性， 将多 重PCR分型方法中加入纳米颗粒， 建立纳米多重PCR的分型方法， 以提高检测的敏感性。 0007 为了实现上述目的， 本发明的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方 法按照以下步骤操作： 0008 一、 纳米多重PCR引物设计： 说明书 1/5 页 3 CN 107841575 A 3 0009 根据GenBank公布的4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列， 设计合成各型 特异性 引物 ； 4型禽腺病毒I群 引物 (F:5-CAARTTCAGRCAGACGGT-3R:5- AAGAGGCCCGG。
13、GCAATGC-3 )； 8a型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 - AATGTTTGACGAGCTGATGGG-3 )； 8b型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 - ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG-3 )； 11型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 - ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG-3 )； 0010 二、 基因的提取： 0011 取4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群标准毒株(购自中国兽药监察所)细胞研磨液400 L 于1.5mLEP。
14、管中， 加入400 L氯仿、 600 L裂解液， 混匀后4沉淀10min， 之后12000r/min离 心， 取上清600 L， 加入异丙醇800 L,4沉淀30min后12000r/min离心， 弃上清后干燥， 用20 L去离子水溶解； 所述裂解液的组成为： 硫氰酸胍9.456g， 硫氰酸胺3.044g， 醋酸钠13.60g， 甘油5ml， 苯酚38ml， 水57ml； 0012 三、 纳米多重PCR扩增: 0013 1、 PCR反应体系： 2Nano-QPCRmix6 L(上海户实医药科技有限公司)， Taq enzyme 0.2 L(大连宝生物工程有限公司)， 上、 下游混合引物各1 L。
15、， 模板(制备的DNA溶液)0.5 L， 去离子水3.3 L； 所述上、 下游混合引物同第一步； 0014 2、 PCR反应条件： 95预变性5min， 9430s， 53退火1min， 721min49s， 30个循 环； 72延伸10min； 0015 四、 琼脂糖凝胶电泳： 0016 纳米多重PCR扩增反应结束后， 取PCR产物8 L， 以DL2000为Maker， 质量百分比为 1的琼脂糖凝胶电泳， 观察扩增片段大小， 确定病毒的血清型； 扩增片段为2193bp为4型禽 腺病毒I群， 扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群， 扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群， 扩增片段为6。
16、74bp为11型禽腺病毒I群。 0017 纳米多重PCR特异性试验： 应用上述建立的纳米多重PCR方法分别对传染性支气管 炎病毒(IBV)、 减蛋综合症病毒(EDSV)、 H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和新城疫(NDV)的cDNA 进行检测， 验证该方法的特异性。 试验结果均未扩增出条带， 仅扩增出4、 8a、 8b和11型四种 血清型禽腺病毒I群的特异性条带， 说明引物特异性良好。 0018 敏感性试验： 应用4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群标准毒株六邻体全基因建立的阳性 质粒为模板， 进行10倍系列稀释， 进行纳米多重PCR和普通多重PCR最小检测浓度测定。 在四 种血清型病毒都。
17、同时检出的情况下， 纳米多重PCR的敏感性比普通多重PCR至少提高10倍。 0019 临床样品检测： 取实验室分离保存的、 并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床 毒株， 进行纳米多重PCR分型检测。 检测结果显示， 纳米多重PCR分型结果与测序结果相一 致， 表明本研究建立的纳米多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。 0020 本发明与现有技术相比， 采用简便的多重PCR分型方法， 无需对PCR产物进行繁琐 的特殊处理和特殊仪器分析， 明显缩短检测时间； 加入纳米颗粒， 在同时检测到四种血清型 病毒的情况下， 敏感性较普通多重PCR至少提高10倍； 且不能扩增传染性支气管炎病毒、 减 蛋。
18、综合症病毒、 H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒等临床感染鸡的主要病毒。 纳米多重PCR方 法特异性强、 敏感性高、 稳定性好， 能快速、 敏感和特异性地对我国主要流行血清型的禽腺 病毒I群进行分型。 说明书 2/5 页 4 CN 107841575 A 4 附图说明： 0021 图1为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的单一纳米PCR预设条件确定图； 0022 图2为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR反应条件优化图； 0023 图3为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的特异性检测图； 0024 图4为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的多重PCR的敏感性检测图； 0025 图5为。
19、本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的敏感性检测图； 0026 图6为本发明的四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR的稳定性检测图。 具体实施方式： 0027 下面结合附图并通过具体实施例对本发明方法作进一步阐述。 0028 实施例1、 0029 一、 纳米多重PCR引物合成： 0030 根据表1中设计的4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群分型检测引物序列， 合成各型特异 性引物； 4型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 -AAGAGGCCCGGGCAATGC- 3 )； 8a型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGG。
20、T-3 R:5 -AATGTTTGACGAGCTGATGGG- 3 )； 8b型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 -ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG- 3 )； 11型禽腺病毒I群引物(F:5 -CAARTTCAGRCAGACGGT-3 R:5 -ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG- 3 )； 0031 二、 基因的提取： 0032 取4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群标准毒株(购自中国兽药监察所)细胞研磨液400 L 于1.5mLEP管中， 加入400 L氯仿、 600 L裂解液， 混匀后4沉淀10min； 之后12000r/。
21、min离心 10min， 取上清600 L， 加入异丙醇800 L,4沉淀30min后12000r/min离心10min； 弃上清后 干燥， 用20 L去离子水溶解； 所述裂解液的组成为： 硫氰酸胍9.456g， 硫氰酸胺3.044g， 醋酸 钠13.60g， 甘油5ml， 苯酚38ml， 水57ml； 0033 三、 纳米多重PCR扩增: 0034 1、 PCR反应体系： 2Nano-QPCRmix6 L(上海户实医药科技有限公司)， Taq enzyme 0.2 L(大连宝生物工程有限公司)， 上、 下游混合引物各1 L， 模板(制备的DNA溶液)0.5 L， 去离子水3.3 L； 所述上。
22、、 下游混合引物同第一步； 0035 2、 PCR反应条件： 95预变性5min， 9430s， 53退火1min， 721min49s， 30个循 环； 72延伸10min； 0036 4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群单一纳米PCR预设条件扩增结果如图1所示， M: DNAmaker2000； 1:FAdV-8a； 2:FAdV-4； 3:FAdV-11； 4:FAdV-8b； 0037 纳米多重PCR反应条件优化如图2所示， M:2000maker； 1-4:50； 5-8:53； 9-12: 54； 13-16:54； 17-20:56； 0038 四、 琼脂糖凝胶电泳： 0039。
23、 纳米多重PCR扩增反应结束后， 取PCR产物8 L， 以DL2000为Maker， 质量百分比为 1的琼脂糖凝胶电泳， 观察扩增片段大小， 确定病毒的血清型； 扩增片段为2193bp为4型禽 腺病毒I群， 扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群， 扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群， 说明书 3/5 页 5 CN 107841575 A 5 扩增片段为674bp为11型型禽腺病毒I群。 0040 表1. 4、 8a、 8b和11型禽腺病毒 群分型纳米多重PCR引物 0041 0042 实施例2、 纳米多重PCR特异性试验： 0043 应用上述建立的纳米多重PCR方法分别对传染性支气。
24、管炎病毒(IBV)、 减蛋综合症 病毒(EDSV)、 H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)和新城疫(NDV)的cDNA进行检测， 验证该方法的特 异性。 0044 如图3所示， M:2000maker， 1:四种血清型禽腺病毒I群阳性样品混合物， 2:IBV， 3: EDSV， 4:AIV-H9， 5:NDV。 0045 试验结果均未扩增出条带， 仅扩增出四种血清型禽腺病毒-I群的特异性条带， 说 明引物特异性良好。 0046 实施例3、 敏感性试验： 0047 应用4、 8a、 8b和11型禽腺病毒I群标准毒株六邻体全基因建立的阳性质粒为模板， 进行10倍系列稀释， 进行纳米多重PCR和普通多。
25、重PCR最小检测浓度测定。 0048 如图4所示， 多重PCR浓度梯度： M:2000maker， 1： 原浓度质粒， 2： 10101倍稀释质 粒， 3： 10102倍稀释质粒， 4： 10103倍稀释质粒， 5： 10104倍稀释质粒， 6： 10105倍稀释 质粒， 7： 10106倍稀释质粒， 8： 10107倍稀释质粒。 普通多重PCR检测最小浓度分别为： FAdV-4为5.14107拷贝 L-1、 FAdV-8a为2.87107拷贝 L-1、 FAdV-8b为1.71106拷 贝 L-1、 FAdV-11为4.35107拷贝 L-1。 0049 如图5所示， 纳米多重PCR浓度梯度。
26、： M:2000maker， 1： 原浓度质粒， 2： 10101倍稀 释质粒， 3： 10102倍稀释质粒， 4： 10103倍稀释质粒， 5： 10104倍稀释质粒， 6： 10105倍 稀释质粒， 7： 10106倍稀释质粒， 8： 10107倍稀释质粒， 9： 10108倍稀释质粒， 10： 10 109倍稀释质粒。 纳米多重PCR检测最小浓度分别为： FAdV-4为5.14106拷贝 L-1、 FAdV- 8a为2.87104拷贝 L-1、 FAdV-8b为1.71104拷贝 L-1、 FAdV-11为4.35105拷贝 L -1。 0050 结果显示， 在四种血清型病毒都同时检出的。
27、情况下， 纳米多重PCR的敏感性比普通 多重PCR至少提高10倍。 0051 实施例4、 临床样品检测： 0052 取实验室分离保存的、 并进行测序确定血清型的禽腺病毒I群临床毒株， 进行纳米 多重PCR分型检测。 0053 如图6所示， M： 2000maker； 1:四种血清型禽腺病毒I群阳性样品混合物； 2:空白对 说明书 4/5 页 6 CN 107841575 A 6 照； 3、 4： 8a型禽腺病毒I群； 5、 8： 11型禽腺病毒I群； 6、 7、 9、 10、 12、 13： 4型禽腺病毒I群； 11： 8b型禽腺病毒I群。 0054 检测结果显示， 纳米多重PCR分型结果与测序结果相一致， 表明本研究建立的纳米 多重PCR方法能够用于临床大量样本的检测。 说明书 5/5 页 7 CN 107841575 A 7 图1 图2 说明书附图 1/3 页 8 CN 107841575 A 8 图3 图4 说明书附图 2/3 页 9 CN 107841575 A 9 图5 图6 说明书附图 3/3 页 10 CN 107841575 A 10 。