检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法及其专用试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法及其专用试剂盒。
背景技术
水稻是我国乃至全世界最重要的粮食作物之一，是世界上食用人口最多、历史最悠久的农作物。随着生物技术的发展，转基因技术正广泛地应用于农作物品质改良，已有多个转基因水稻品系进行了环境释放，申请商业化种植。科丰6号是转双价抗虫基因的转基因水稻品系，所导入外源基因是Bt/CpTI。CpTI即豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，在植物基因工程中的应用已有十余年。转CpTI基因水稻的获得使栽培水稻的抗虫能力和抗虫范围有了新的扩展。
在转基因生物安全受到越来越广泛关注的当今社会，以生物技术为基础的转基因检测方法成了监管转基因植物及食品的有效手段。实时荧光PCR(Real time PCR)就是其中一个最常用最有效的方法。实时荧光PCR是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析，具有高特异性和高灵敏度的优点。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法及其专用试剂盒。
本发明提供了针对CpTI基因的特异性引物对和特异性探针。
所述特异性引物对是由序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对。
特异性引物对：
上游引物：5’-GATGACTCAAGCGATGAACC-3’；序列表的序列1；
下游引物：5’-GTACAATGGCATTGAGGAGG-3’；序列表的序列2。
所述特异性探针可为TaqMan荧光探针，其核苷酸序列如序列表的序列3所示。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，报告荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭荧光基团连接在探针的3’末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
所述特异性探针的5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。所述报告荧光基团可为Fam(FAM)、Hex(HEX)、Tet(TET)、Joe(JOE)、Vic(VIC)、Fite(FITE)、Cy3(CY3)或Cy5(CY5)。所述淬灭荧光基团可为Tamra(TAMRA)、Rox(ROX)、Dabcy(DABCY)、Bhq1(BHQ1)或Bhq2(BHQ2)。特异性探针的核苷酸序列：5’-TTCAGAACCATGCTGCGATTCA-3’。所述特异性探针中，所述报告荧光基团具体可为FAM荧光基团，所述淬灭荧光基团具体可为TAMRA荧光基团。
所述特异性引物对和/或所述特异性探针可应用于制备检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的试剂盒。
本发明同时保护一种检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的试剂盒，它包括所述特异性引物对和/或所述特异性探针。
所述试剂盒可应用于检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻。
本发明同时保护一种检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法，是以待测水稻的基因组DNA(总DNA)为模板，其特征在于：所述方法为用所述特异性引物对和所述特异性探针进行实时荧光PCR检测，确定待测水稻是否为转CpTI基因水稻。
所述实时荧光PCR的PCR体系中，反应起始时，所述特异性引物对中的两条引物的浓度均可为0.2μmol/L，所述特异性探针的浓度可为0.1μmol/L。
所述实时荧光PCR的参数具体如下：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min，共40个循环。
所述应用，所述试剂盒，所述方法中，所述CpTI基因的核苷酸序列具体可如GENBANK ACCESSION NUMBER：EU088405.1所示。
所述应用，所述试剂盒，所述方法中，所述转CpTI基因水稻具体可为转基因水稻品系科丰6号。
本发明提供的特异性引物对和特异性探针是根据CpTI基因序列设计的，检测特异性好，用于检测实时荧光PCR灵敏性高。本发明提供的检测方法，准确性高、反应灵敏，所需时间短。本发明提供的试剂盒使用非常方便。本发明提供的特异性引物对、特异性探针、试剂盒和方法，可以快速检测待测生物样品是否含有CpTI基因(如检测待测水稻是否为携带外源基因CpTI的转基因水稻品系科丰6号)，为转基因安全提供好了保证。
【附图说明】
图1为实时荧光PCR检测CpTI结果；1：科丰6号。
图2为本发明检测方法灵敏度实验结果。
【具体实施方式】
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
转基因水稻品系科丰6号(GMO+)(转CpTI基因水稻)：中国检验检疫科学研究院；戎俊，宋志平，苏军，夏辉，王锋，卢宝荣.Bt/CpTI转基因稻及其非转基因亲本对照在间隔种植条件下的转基因漂移.生物多样性，2006，14(4)：309-314。科丰6号由中国水稻研究所王渭霞提供，是1994年由福建省农业科学院生物技术研究所王锋和中国科学院遗传与发育生物学研究所朱祯共同培育的。
转基因水稻品系Bt63：中国检验检疫科学研究院；赵卫东，郑文杰，贺艳.荧光PCR方法定性和定量检测BT63转基因大米[J].食品研究与开发，2009，(03)：133-135。
非转基因水稻品系明恢86(GMO-)：中国检验检疫科学研究院；张建新，郑家团，谢华安，罗家密，黄显波，邓则勤，吴兰英.水稻新种质明恢86及其系列组合的选育研究[J].植物遗传资源科学，2001，2(1)：32-36。
转基因番茄品系华番1号：中国检验检疫科学研究院；黄文胜，陈红运，赵文军，等.转基因延熟番茄“华番一号”地品系特异性检测方法[J].植物检疫，2005，19(6)：321-325。
转基因棉花品系中棉41：中国检验检疫科学研究院；刘生荣，夏志明，刘党培.双价抗虫棉中棉所41丰产稳产性及其简化栽培技术研究[J].中国农学通报，2005，(03)：166-168。
转植酸酶基因玉米品系BVLA430101：中国检验检疫科学研究院；Rumei Chen，Guangxing Xue，Yunliu Fan et al.，Transgenic maize plants expressing a fungalphytase gene.Transgenic Res(2008)17：633-643。
实施例1、试剂盒的制备
在NCBI上获得CpTI基因的全序列(GENBANK ACCESSION NUMBER：EU088405.1)，设计筛选特异性引物对和特异性探针，用于制备试剂盒。
试剂盒由如下特异性引物对和特异性探针(TaqMan探针)组成。
特异性引物对：
CpTI-F(上游引物)：5’-GATGACTCAAGCGATGAACC-3’；
CpTI-R(下游引物)：5’-GTACAATGGCATTGAGGAGG-3’。
特异性探针5’端用报告荧光基团FAM标记，3’端用淬灭荧光基团TAMRA标记，核苷酸序列为：5’-TTCAGAACCATGCTGCGATTCA-3’。
实施例2、试剂盒的特异性检测
用实施例1制备的试剂盒分别检测科丰6号、明恢86、华番1号、Bt63、中棉41和BVLA430101是否携带CpTI基因，以验证试剂盒的特异性。每个样品采用相同的检测方法，包括样本总DNA的提取和实时荧光PCR两个步骤。
一、样品总DNA的提取
1、取样品叶片约0.1g于研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状。
2、将叶片粉末迅速转入到事先加入700μl CTAB缓冲液的2ml离心管中，轻轻混匀后，65℃水浴保温30分钟。每隔十分钟小心摇晃混匀。
3、取出离心管，待冷至室温后(25℃)，加入等体积酚(350μl)/氯仿(350μl)700μl。上下颠倒充分混合，抽提5分钟。
4、室温下，12000rpm离心10分钟，用剪去头部的1ml枪头将上清转移到另一个新的离心管中。加2μl RNaseA(10mg/ml)。
5、加入与上清等体积的氯仿700μl，上下颠倒充分混合，抽提5分钟。
6、室温下，12000rpm离心10分钟，吸取上清到另一新的离心管中。
7、加入等体积的异丙醇(700μl)，充分混匀，常温放置10分钟后可见沉淀。为沉淀完全，可在-20℃放置1-2小时。
8、室温下，12000rpm离心10分钟，沉淀积于管底。弃尽上清液。
9、加入700μl 70％(体积百分含量)乙醇水溶液清洗30分钟。
10、倒去离心管中的乙醇水溶液，使DNA沉淀在管中自然晾干。
11、加入适量TE(50μl)溶解，放入-20℃冰箱保存备用。
二、实时荧光PCR
实时荧光PCR反应体系：将12.5μl AB TaqMan Gene Expression Master Mix、5μlDNA模板、5μl灭菌超纯水、1μl试剂盒中的上游引物(RB-F)、1μl试剂盒中的下游引物(RB-R)和0.5μl试剂盒中的特异性探针混合，得到25μl的反应体系；反应体系中，反应初始时，上下游引物的浓度均为0.2μmol/L，探针的浓度为0.1μmol/L。
实时荧光PCR反应参数：50℃、2min；95℃、10min；95℃、15s，60℃、1min，共40个循环。
反应结束后根据扩增曲线判定结果。
结果见图1。只有科丰6号有荧光信号，其他样本均无荧光信号。
实施例3、试剂盒的灵敏度检测
以科丰6号种子粉末和明恢86种子粉末为试材，将两种种子粉末不同配比混合，得到系列样本(科丰6号种子粉末在样本中所占的重量百分含量依次为5％、1％、0.5％、0.1％和0.01％)。
提取各个样本的总DNA，以20ng总DNA为模板进行实时荧光PCR反应。样品总DNA的提取和实时荧光PCR的方法同实施例2。
结果见图2。结果表明，本发明的方法至少可检测0.01％的转基因水稻品系科丰6号(2×10-3ng)。
【序列表】
<110>中国检验检疫科学研究院
<120>检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法及其专用试剂盒
<130>CGGNARY92747
<160>3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
gatgactcaa gcgatgaacc 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gtacaatggc attgaggagg 20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ttcagaacca tgctgcgatt ca 22