鉴定待测小麦是否为PINAD1B缺失型小麦的方法及其应用.pdf

本发明公开了一种鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法及其应用。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对，为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有776bp条带的待测小麦为候选的Pina-D1b缺失型小麦；所述Pina-D1b缺失型小麦是基因组DNA中缺失序列表的序列3所示核苷酸的小麦。本发明中的特异引物对能取代传统SDS-PAGE和双向电泳技术，直接在分子水平上进行Pina-D1b类型的检测，准确度和可信度大大提高，将大大加快籽粒硬度基因型的筛选效率和准确度，对小麦籽粒硬度的基因工程改良起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。

1.  一种辅助鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法，包括如下步骤：
1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有776bp条带的待测小麦为候选的Pina-D1b缺失型小麦；所述Pina-D1b缺失型小麦是基因组DNA中缺失序列表的序列3所示核苷酸的小麦。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Pina-D1b缺失型小麦为如下品种小麦中的任意一种：陕253、藁城8901、墨299、墨293、墨215、墨191、墨181、墨272、RDWG/MILAN和CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN。

3.  权利要求1或2所述方法在辅助筛选PINA蛋白缺失型小麦中的应用。

4.  一种辅助鉴定待测小麦是否为非Pina-D1b缺失型小麦的方法，包括如下步骤：
1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中没有776bp条带的待测小麦为候选的非Pina-D1b缺失型小麦；所述非Pina-D1b缺失型小麦是基因组DNA中具有序列表的序列3所示核苷酸的小麦。

5.  如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述非Pina-D1b缺失型小麦为中国春或豫农202。

6.  权利要求4或5所述方法在辅助筛选非PINA蛋白缺失型小麦中的应用。

7.  序列表的序列1所示核苷酸和序列表的序列2所示核苷酸组成的特异性引物对。

8.  权利要求7所述特异性引物对在制备如下a)或b)或c)三种试剂盒中的应用：
a)鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的试剂盒；
b)鉴定待测小麦是否为非Pina-D1b缺失型小麦的试剂盒；
c)辅助筛选硬麦的试剂盒。

9.  一种辅助筛选硬麦的方法，包括如下步骤：
1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对，为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有776bp条带的待测小麦为候选的硬麦。

10.  如权利要求9所述的方法，其特征在于：所述硬麦为如下品种小麦中的任意一种：陕253、藁城8901、墨299、墨293、墨215、墨191、墨181、墨272、RDWG/MILAN和CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN。

鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法及其应用。
背景技术
籽粒硬度是国际上小麦市场分级和定价的重要依据，影响小麦的润麦加水量、出粉率、面粉颗粒大小、破损淀粉粒数量和食品加工品质等，是重要的育种目标之一。按胚乳质地可把普通小麦分为硬质麦、混合麦和软质麦。籽粒硬度主要由位于染色体5D短臂(5DS)上的一对主效基因Pina和Pinb(统称为puroindoline)控制。自从一组分子量约为13kD的蛋白多肽在普通小麦中被发现和命名(friabilin)之后，籽粒硬度在分子水平上研究进程大大加快。研究表明，puroindol ine基因a和b(分别简称为Pina和Pinb)是形成小麦籽粒硬度的分子遗传基础。当Pina和Pinb同为野生型时，籽粒表现为软质，Pina和Pinb中的任一基因缺失或突变，籽粒表现为硬质。目前已经有多种突变类型被发现。Chen等研究表明，三种最为常见的突变类型之中，Pina-D1b类型硬度值最高，其磨粉品质和馒头、面条以及面包加工品质均劣于Pinb-D1b类型。而陈锋等研究表明，Pina-D1b类型在CIMMYT硬质麦中一直占据有主导地位，同时在我国春麦区尤其是东北春麦区也占有很高的比例，这对我国小麦的品种改良较为不利。而由于Pina-D1b类型其包括编码区在内的基因片段缺失较大，很难直接利用PCR技术直接用于鉴定和分析该类型，因此，目前常用改进的SDS-PAGE和双向电泳技术对其检测，也有利用Pina基因的全长引物作为标记进行检测，利用负向结果(即不能扩增出来的为该类型)对Pina-D1b类型进行鉴定。但上述检测方法均有一定局限性，也即是蛋白电泳技术则只能检测到Pina基因不表达的类型，而造成不表达的原因很多，Pina-D1b类型只是其中一种，而用Pina基因的全长引物作为标记利用负向结果进行检测，其没有扩增产物则有可能是由于DNA质量不合格或人为误差等多种因素造成的，Pina-D1b类型也只是其中一种情况。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法及其应用。
本发明保护序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对。所述特异性引物对为与小麦籽粒硬度Pina基因有关的分子标记，特别为一种可鉴定小麦籽粒硬度主效基因Pina缺失类型(Pina-D1b)的分子标记。
上游引物：5’-AATACCACATGGTTCTAGATACTG-3’(序列表的序列1)；
下游引物：5’-GCAATACAAAGGACCTCTAGATT-3’(序列表的序列2)。
本发明提供的辅助鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法，包括如下步骤：
1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有776bp条带的待测小麦为候选的Pina-D1b缺失型小麦；所述Pina-D1b缺失型小麦是基因组DNA中缺失序列表的序列3所示核苷酸的小麦。
所述Pina-D1b缺失型小麦可为如下品种小麦中的任意一种：陕253、藁城8901、墨299、墨293、墨215、墨191、墨181、墨272、RDWG/MILAN和CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN。
Pina-D1b缺失型小麦引起小麦中PINA(Pina)蛋白不能表达，所以所述方法可应用于辅助筛选PINA蛋白缺失型小麦。
本发明提供的辅助鉴定待测小麦是否为非Pina-D1b缺失型小麦的方法，包括如下步骤：
1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中没有776bp条带的待测小麦为候选的非Pina-D1b缺失型小麦；所述非Pina-D1b缺失型小麦是基因组DNA中具有序列表的序列3所示核苷酸的小麦。
所述非Pina-D1b缺失型小麦可为中国春或豫农202。
所述方法可应用于辅助筛选非PINA蛋白缺失型小麦。
所述特异性引物对可应用于制备鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的试剂盒。所述特异性引物对还可应用于制备鉴定待测小麦是否为非Pina-D1b缺失型小麦的试剂盒。所述特异性引物对也可应用于制备辅助筛选硬麦(硬质麦)的试剂盒。
本发明还保护一种试剂盒，所述试剂盒包括所述特异性引物对。所述试剂盒可用于鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦或鉴定待测小麦是否为非Pina-D1b缺失型小麦或辅助筛选硬麦(硬质麦)。
本发明还保护一种辅助筛选硬麦的方法，包括如下步骤：
1)以待测小麦的基因组DNA为模板，用特异引物对进行PCR扩增；所述特异引物对为序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列组成的引物对；
2)检测PCR扩增产物，扩增产物中有776bp条带的待测小麦为候选的硬麦。
所述硬麦可为如下品种小麦中的任意一种：陕253、藁城8901、墨299、墨293、墨215、墨191、墨181、墨272、RDWG/MILAN和CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHTO/3/MILAN。
本发明提供的特异引物对(分子标记)能够取代传统的SDS-PAGE和双向电泳技术，直接在分子水平上进行Pina-D1b类型的检测，准确度和可信度大大提高，这将大大加快籽粒硬度基因型的筛选效率和准确度，对小麦籽粒硬度的基因工程改良起到重要作用，同时也有助于小麦籽粒硬度的遗传和分子生物学的进一步研究，对优良小麦品种的培育也具有重大意义。
附图说明
图1为测定Pina-D1b类型缺失片段大小的引物步移法19对引物设计图。
图2为SDS-PAGE电泳图；从左向右依次为：陕253、藁城8901、CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN、墨299、墨293、RDWG/MILAN和中国春。
图3为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，1、3、5、7、9、11、13、15、18泳道为Pinb全长引物扩增结果，2、4、6、8、10、12、14、16、19泳道为Pina全长引物扩增结果，17泳道为DNA 1adder DL2000；1、2：陕253；3、4：藁城8901；5、6：CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN；7、8：硬粒小麦Langdon(对照)；9、10：墨299；11、12：墨293；13、14：RDWG/MILAN；15、16：豫农202；18、19：中国春。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
中国春：河南农业大学；Xia L Q，Chen F，He Z H，Chen X M，Morri s C F.Occurrence of puroindoline alleles in Chinese winter wheats.CerealChemistry，2005，82：38-43。“中国春”是中国四川的一个地方品种，是目前世界上最常用的野生型普通小麦对照品种。
豫农202：河南农业大学；孙继冰.小麦新品种豫农202最佳播期研究.种业导刊，2009，6：20-21。“豫农202”河南农业大学农学院小麦分子育种室2007年育成的小麦品种。
陕253：河南农业大学；Xia L Q，Chen F，He Z H，Chen X M，Morris C F.Occurrence of puroindoline alleles in Chinese winter wheats.CerealChemistry，2005，82：38-43。“陕253″是西北农林科技大学农学院小麦所2002年育成的小麦品种。
藁城8901：河南农业大学；Xia L Q，Chen F，He Z H，Chen X M，Morris C F.Occurrence of puroindoline alleles in Chinese winter wheats.CerealChemistry，2005，82：38-43。“藁城8901”是河北藁城农科所2002年培育的小麦品种。
实施例1、不同小麦品种籽粒硬度的测定
检测12个小麦品种的籽粒硬度(硬粒小麦Langdon、中国春、豫农202、陕253、藁城8901、CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN、墨299、墨293、墨215、墨191、墨181、墨272、RDWG/MILAN)。籽粒硬度测定方法：用单粒谷物硬度仪(SKC84100，瑞典Perten公司)测定300粒小麦样品的硬度值，根据测定结果确定籽粒的硬度级别，同时记录千粒重和籽粒直径。设置三次重复实验，结果取平均值。
SKCS分析结果表明，12个小麦品种中，中国春属于软麦，其余11个小麦品种均为硬麦(硬度均在60以上)。SKCS硬度平均值分别为：中国春为12，豫农202为60，陕253为79，藁城8901为79，CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHT O/3/MILAN为74，墨299为76，墨293为81，墨215为76，墨191为73、墨181为77，墨272为75，RDWG/MILAN为74。
实施例2、特异性引物对的发现
以陕253和藁城8901为例采用引物步移法进行目的片段扩增。引物设计如图1所示。其中第1、2、3、4、5和19对引物能够扩增出目标片段，而第6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18对引物则不能扩增出目标片段，表明缺失片段发生在第5对引物的下游和第19对引物的上游序列之间，然后在第5对引物和第19对引物之间重新设计特异性引物对进行扩增，得到了776bp的片段。将片段进行测序后，与野生型Ha位点(NCBI编号：CT009735)的同序列对比，发现Pina-D1b类型Ha位点序列缺少了15380bp，缺失片段为自Pina基因第+23位核苷酸(相对于起始密码子ATG)至+15403位核苷酸，缺失片段核苷酸序列见序列表3。
特异性引物对如下：
上游引物：5’-AATACCACATGGTTCTAGATACTG-3’(序列表的序列1)；
下游引物：5’-GCAATACAAAGGACCTCTAGATT-3’(序列表的序列2)。
实施例3、应用特异性引物对鉴定Pina-D1b缺失型小麦
12个小麦品种：中国春(软麦)、豫农202(硬麦)、陕253(硬麦)、藁城8901(硬麦)、墨299(硬麦)、墨293(硬麦)、墨215(硬麦)、墨191(硬麦)、墨181(硬麦)、墨272(硬麦)、RDWG/MILAN、CMH82A.1294/2*KAUZ//MUNIA/CHTO/3/MILAN(硬麦)。
分别将12个小麦品种进行如下鉴定：
一、SDS-PAGE鉴定各个小麦品种是否属于PINA蛋白缺失类型
1、提取籽粒蛋白
每个品种的小麦取一粒种子，分别按下述步骤提取籽粒蛋白：1)研磨后放入一个2mL离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液和0.15mL 12％Triton-X114(Sigma公司)，混合后4℃放置12-24h；2)12000rpm离心3分钟，移上清至1.5mL离心管中，37℃温育半小时；3)12000rpm离心5min，弃上清，移下层至一新的离心管中，加入1mL预冷的TBS溶液，37℃温育30min；4)12000rpm离心3min，弃上清，加入900μL预冷的丙酮，涡旋后在-20℃冰箱中放置30min；5)12000rpm离心2min，弃上清，用丙酮再洗一遍后置于空气中进行干燥，得到小麦籽粒蛋白。
2、SDS-PAGE电泳鉴定
1)向步骤1提取的籽粒蛋白中加入150μL样品缓冲液(含7.57mg/mL Tris，10％甘油，0.02mg/mL SDS，0.0125mg/mL溴酚兰)；
2)将加入样品缓冲液的籽粒蛋白在70℃下温育15min，取25μL进行SDS-PAGE电泳。电泳条件为：用浓缩胶(浓度T为4％，胶联度C为2.67％)在40mA下电泳，待指示剂到达分离胶(浓度T为13.5％，胶联度C为2.6％)后将电压功率转换成12W，待指示剂到达分离胶底部后再电泳30min。为减少蛋白的扩散，用10％甘油代替水配制分离胶。凝胶配制时用PDA(Piperiazine diacrylamide)代替甲叉以使背景更为清晰，胶更加结实和富有弹性。按Morris等(Morris C F，Massa A N.Puroindoline genotype of the U.S.national institute of standards &technology reference material 8441，wheat hardness.Cereal Chemistry，2003，80：674-678)的方法进行染色(用三氯乙酸和甲醇固定、银染显色，用柠檬酸停止显色)。
SDS-PAGE电泳结果表明，除中国春和豫农202具有PINA蛋白，其余材料均属于PINA蛋白缺失类型。部分样品电泳结果见图2。
二、PCR鉴定各个小麦品种是否属于Pina-D1b缺失型小麦
每个品种的小麦取一粒种子，提取基因组DNA作为模板，采用Pina基因全长引物对进行PCR扩增(用Pinb基因全长引物对进行PCR扩增作为对照)，以保证DNA质量。
扩增Pina基因全长引物对：
引物3(上游)：5’-CATCTATTCATCTCCACCTGC-3’；
引物4(下游)：5’-GTGACAGTTTATTAGCTAGTC-3’。
控制DNA质量所用的Pinb基因全长引物对：
引物5(上游)：5’-GAGCCTCAACCCATCTATTCATC-3’；
引物6(下游)：5’-CAAGGGTGATTTTATTCATAG-3’。
PCR反应体系的组成：1.5mmol/L MgCl₂，0.3mmol/L dNTP，上、下游引物各10pmol，模板DNA 200ng，0.5UTaq酶，加1×PCR缓冲液(含10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，50mmol/L KCl，1.0％Triton X-100)定容至25μL。
PCR反应程序：先94℃预变性5min；然后94℃变性50s，58℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后，72℃延伸5min。
PCR扩增结束后，取上述两种PCR扩增产物各10μL分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(采用1×TAE缓冲液；溴化乙锭(EB)染色，160V，1.5小时)，电泳结束后用凝胶成像系统(MultiGenius Gel Documentation and Analysis System)扫描成像并用计算机进行分析，部分样品扩增图见图3。
分析结果表明：12个小麦品种采用Pinb基因全长引物对进行PCR扩增，均可以得到597bp条带；中国春(野生型)和豫农202(Pinb-D1b类型)采用Pina基因全长引物对进行PCR扩增可以得到524bp条带，其余10个小麦品种采用Pina基因全长引物对进行PCR扩增不能得到条带。证明中国春和豫农202以外的10个小麦品种中，PINA蛋白缺失是由包括Pina基因在内的大片段缺失造成的。
三、应用特异性引物对鉴定Pina-D1b缺失型小麦
1、特异性引物对的制备
人工合成如下特异性引物对：
上游引物：5’-AATACCACATGGTTCTAGATACTG-3’(序列表的序列1)；
下游引物：5’-GCAATACAAAGGACCTCTAGATT-3’(序列表的序列2)。
2、应用特异性引物对鉴定Pina-D1b缺失型小麦
每个品种的小麦取一粒种子，提取基因组DNA作为模板，采用特异性引物对进行PCR扩增(用Pinb基因全长引物对进行PCR扩增作为对照)，以保证DNA质量。
结果表明：除中国春和豫农202没有任何扩增产物外，其余10个小麦品种中，均能扩增出776bp片段。
四、测序验证
每个品种的小麦取一粒种子，提取基因组DNA进行测序验证，并将测序结果与野生型5D染色体上的Ha序列(NCBI编号：CT009735)进行比对，结果表明，除中国春和豫农202外，10个小麦品种的Ha位点均有15380bp片段的缺失，属于Pina-D1b类型。
序列表
<110>河南农业大学
<120>鉴定待测小麦是否为Pina-D1b缺失型小麦的方法及其应用
<130>CGGNARY102013
<160>3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
aataccacat ggttctagat actg    24
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
gcaatacaaa ggacctctag att                                            23
<210>3
<211>15380
<212>DNA
<213>3
<400>3
actgcttgct ctggtagcga gcaccgcctt tgcgcaatat agcgaagttg ttggcagtta    60
cgatgttgct ggcgggggtg gtgctcaaca atgccctgta gagacaaagc taaattcatg    120
caggaattac ctgctagatc gatgctcaac gatgaaggat ttcccggtca cctggcgttg    180
gtggaaatgg tggaagggag gttgtcaaga gctccttggg gagtgttgca gtcggctcgg    240
ccaaatgcca ccgcaatgcc gctgcaacat catccagggg tcaatccaag gcgatctcgg    300
tggcatcttc ggatttcagc gtgatcgggc aagcaaagtg atacaagaag ccaagaacct    360
gccgcccagg tgcaaccagg gccctccctg caacatcccc ggcactattg gctattactg    420
gtgatgtagc ttccatttat gactagctaa taaactgtca cataccactg cgtgtgacaa    480
ataaaagtgg tcatggaata atttatgaat aaaatttcag catgtgcctg cgcgaggtgt    540
ctatagcaaa catttcagta tgcctatata tgttaatcaa gatagcaatg ttcacataca    600
cccagaataa tagtttgtgt aattagttgt gtatgttctt ggtggtggtt tgtgtacaga    660
tttgccttcc ttctaacaaa atatgaatac atggagctgt tcaagcctta aacatggaag    720
ataagagaat gaaacgagcc atccaattaa attactatga gtttgccgtg aggataccat    780
tgttagttca acaaatgact taaaataatt ccattttatt tcctgacatg ttaacaagaa    840
tgatatgcac caaccacttc atgtatcttg tgcacaagca tcatcataat catcaatcta    900
acaacttgca caagatgaca aatctagttt cacagaaaaa ttaaatctag aacaaaccac    960
taggcctgaa cgacatctaa atacaagaca aaaaacaaca cagctcaaac agggtggcat    1020
ttaaaaaaaa tggtgtatat taattagata tgctagagtt tattactacc tctgtaccga    1080
aatataagac gtttttgtac ggaaattgct tttggaggcc gagctccatg caggccttca    1140
aatgcaaaat tcaaaattca tgaaaattca tatttttaca tttaaaaaat tctaaaaaat    1200
agagacatac atgaaggcat aatgcacaag tgtgtaaata ttcaggacga aatacgttga    1260
aatgagggct gtgcaaaaat aaatctgaga cttgatacta ttcatcctcc cagaccatga    1320
atttgtcttt tttgtatagg tggcatttca atgtatttga tcctgaaatt ttacacacat    1380
acaactcaca cccttgttta cttgtgcaga ttttttcaga ttttttgaaa tcgataattt    1440
caaaattcaa aattttcaaa atatggcctc catggaggcc gagatccaaa acgtcgtact    1500
catttttgta ggctaaacta gcctactaaa atgtcttata ttttgatatg gaggggatac    1560
aatcttgcaa agttagttct aacacggagc tgggctatcc cttgcttagt acaccatcac    1620
tccagacctc acacaagtat ttagttaaac caagtaatat ttagttcaga catggctatg    1680
ttagtcggga gggcattggt acgcccagtc caccagagtt caagccctaa atttagcgct    1740
ttggtgtatc ataaaagtgg aaaattcttt ataaaaggag tcaagtattt acaaaaagca    1800
gggatggaga tacagtaaac aaatggaacg ggctgacaaa ttcatcttgt cgggccgttg    1860
gacacctttg atctttcaac gagatccacc tgcggagcag cagcctggtc gtggtgggcc    1920
gagcagggtg cgtgtgtgac ttggcaaaaa aaaaaggcgg aagccagaag tgagactatc    1980
ggcatttcct atttggcgcg tttagcactc gttattttgc attttgcaaa cgggcacaca    2040
ctccccctcc gcattgggcc gacccatttg cttttttctg tttaaactat agaaaaggtg    2100
tgctcgccct gactcgaact cgtgatctct tcattgagta taaaccacat taaccactat    2160
gacaacttag cgcttgttcc ttcttacttt ttaaaaattt tagttcgcag aaagcccccg    2220
gtagcttccc aacctagttt tttccacttt gctggacagg tttcagacgg ttcttaattg    2280
gcttttcttc ctttttattt tttcttgttt ctttgttttt tattttttct ggtttttttc    2340
cttttcatat tttatttttt tgtttttctt aaatgcacga ttttgtttca aaattgatga    2400
cattttcaat tcacgaactt ttcttcaaaa ttgatgaact ttttatcaaa atccttgaac    2460
ttttttcaaa atcaatgaac atttttcaag attatgaact ttttcaattt tgtacacttt    2520
tttcaaaatt gatgaacttt ctttcaaaat agatcaactt tttaaaaaaa attgatgaac    2580
tttttatcaa atccaatgaa cttctttcaa aatcgtagac tattttaaaa ttcgtgaact    2640
ttttttagtt tgttaccctt tttcaaaatc catgaaatgt tttaaattcg tgatgttttt    2700
caatttttgt gattttttaa atattttttc attttctcga aaagacaaca gttgaccggt    2760
caaccatttt agcgaaaaac caactgcgtc tggcgagggg actacactgt taatggttaa    2820
tgggccggcc cagtgctgta gcttagtggg caccagtctc ctagctggtg cataaggcgc    2880
ctgccgagac agtcgggagg cttggactgt tgacaagtgt gatcggactg ctagagagca    2940
tccacccgaa gaaaaggccg gtagcaagct caagttattc cgggaggccg tgggtggctt    3000
agttttacta tttttcaact catagtactc tctccatttg gtattaaagg gtcaccgagt    3060
aggatttgaa tttgtgaggc cgatgttatt atggagcagt gatttctcta caccccttcc    3120
ccctcccata tgtgccttga ttcattattt ttgagggttc gaatcaaaac ccggatgaac    3180
aaagtggtgc caagcttctt gaataagaga gtgccccaaa aggtaaaagt cgtgttctat    3240
aggatgaaga ttcgaccctc attattgaat gatggttaac taaaaggcga cacaggatga    3300
agattcgacc ctcattattg agtgatggtt aactaaaaga cgacacaaga tgaagattcg    3360
accctcatta ttgagtgatg gttaactaaa agacgacatg tgtagagtta ggtgttggac    3420
gtaatagagt tagtgtagcc ctaattgaag agaagtctta tccgacaaca acgattaaag    3480
cgggttgata atgtcaaaaa aggtcaatat agaccaaact tgagaggagg ccataaaggg    3540
ggggtaagag tatcaccaaa agccgacgag ttgatttcag gatcacatgg gtttaagctc    3600
ttaagcacca gcttgttggg aggctttgtt gatctcttta tcctttgaat caaaaaggac    3660
ctgaccaaaa tttcttattt ctgaaaatgt tcatcccttc ctctaaaaac taactgcagg    3720
ttttaaaacg accattacaa attctatagg gaggttccag aaatatgcta cagtgcgatt    3780
ttgctgtctt ttataagagc agttttttca ttgaccaaag ggatttccgt aaacggaaag    3840
agctggggag ctaaccccac ccagccgaga cgccgaaaca gatataatac tgtcgcattg    3900
tacagaaaac tattccctcc gtcccataat ataagagcgt ttttgacact agtgcagtgt    3960
caaaaacgct cttatattat gggacggagg gagtacaacc tatatatgac aagtaaaata    4020
gccaagccga tccaaaccac tagactagac aaggagcaac acagtaaaag catttcttga    4080
agtgaagtaa cgcgcgcggg gtggatgcgg gtgactcaaa gcagacatgt gtaacagatt    4140
agcacacttc taaatcacct ccatcgtcta cgtacgtcat ctcagtcttt agtcatctcc    4200
gtcctcttcg gcatcgtcct cactgatctc ggagtcatct tcaagatccc cactcgtctc    4260
agagtcatct ccatcccctt caagatcctc gctcatctcg gaggcatcat catctccatc    4320
ttcaagttcc tccagacctg cacaaagaaa caatgatcca tgattgggat agcaatcatt    4380
tgtgttatga aattccttta gccagcagac ccaataaatg aaaaaaacat tccccactga    4440
aagcattgga ataaaccagt ttagtagatc tcctacatac caatctcatg caattcagga    4500
caccacctga ataaattgaa acaaggtcgc attcattagg ttttgaaaca aaaaaagact    4560
tctataatgc aacaagcgga tgtttctaga gtaaagcaac atatactgca acaacaaatc    4620
tatacacatg agtgaagaac aagttcacct gtctgtagca gcaatcactt catcatggaa    4680
atcctccacc gagtcatatt gattcaggaa ataaaccacc gtgggatccg acacgtcagt    4740
tccttgagat taatcataga tatatttagt gctggtgaaa tttaaaatcc cggcaatata    4800
gtgatcaatt aactaatgaa atgcagttga agcatcatat tttcagcgtg caagttgggt    4860
acaatcttag aaataagatg tcaacttaaa aagacaaaga tctaatcaag ctggacaacg    4920
atctcataaa taagatatca tatgaagctg gacaacaatc ttagaaataa gatgatgtct    4980
gtacatgaag ttccaaactg tgttccagac tgaacagact tttccacatt gtgctgacct    5040
tattgattca ctctgcatgt ataggttgaa tagacagaga gacgctcctt ttggtttcat    5100
gaatgaggat aaatgtaaag gattaaaata gctttgtggt agcaggatat atatagaaga    5160
tttattaata tattttgatg gctgaatgta aagtaaatac atgtgggatc tggggcagcg    5220
catgcatgtg tggcttaaaa aacattgtcg cctggcaaaa tgctggcacg agaagcttgc    5280
tggacatgct tgcatggaac tctgacgaat gaagctatgc ctttggattg cgctataaaa    5340
gtgcaagttt tgttgtctga gtcttcctgt ttggaggatt gagggaaggg gatcagaggg    5400
gcaaaaaaga tgaggggtcg cagcggaagg ccaggaatag aggtaacgga ggaaaaaaaa    5460
gttttgactc cagcggctcg ccacagctga caggtcacca agaatttcag tccaagctta    5520
catgaagaac aatgactgct tcgggtaaga gaacagaggc gtgtggatga gggatcgatg    5580
tgagagaaaa gtggtggacg gttactttaa aacgtgtcat taagtaagta aattggattg    5640
ttacacaagc caagctgtag gaacataata gagtgaattt caagcataat ggactgatgt    5700
aaacaagaaa tgtcttcaaa ctgtgtcaga acagcctaat aacaacatat acaagacagg    5760
ccaccaccaa gtatatatgg tgcattctct gttacagagc accacaaggc tgccttggct    5820
caccttcaag cagcggtgtg tgtcgccgtt gaatgtggac ggcgcaaagg gcagctcgtg    5880
ttgtacatgc gggaacttga tttggtgaag caccggttta tcgtcgaagg ggtcgcaggc    5940
aagtacacag taggagaagt cgaaccacca gagcaaacct tgatgggtga gaacgccgtc    6000
accgcgccac acttgtttat ccaagatttt cgagcagtcg ggctccttct cgacccacga    6060
gtacaagtcg accgtgcaga agagcgtgaa gaagacaacc tcttcggaaa agcacgggtt    6120
gagatcggcc accatgagaa gcctgcggtt gtgatcgcgg atgaggccga cgcagtggcg    6180
gcagttgaag ccgccgtcgt gggggaagat gcccgtcgtc ctgcggaaga acggatcgca    6240
gatgtagacg gcgagcccga aggaggcgta accgcatagc agaaggtggc cgctgcggtc    6300
ggcggccgcg atgtaggggt actcgacgag tccggcgggg ctggcgacgc tgctctcgac    6360
gaataggcgg gaaggtagcg gaaccttgtt gaaggtgaag accgcgttgg ggaatttcgg    6420
gggcttcatg aaatcttccg acacatccgg aacagcgtac atgatgtacc actgctcctc    6480
ctgcgccgcc ggggccattg ctcctaggga tggggatggg agggaggagt tggatcggtt    6540
agggttccct gagatgtgtg cggggacgtg caatgtggtc gatgggagtt ggtttttttt    6600
taggggggaa atcttgccgc tttatattta actaaacaaa gtttgggatc tcatccgaaa    6660
ttatatcaag aataaagtct ggtggagaat ccacccaaac aacacttctt tctcctactc    6720
ctaccctagc aagcttatgc acggcagtat tcccagtacg acgaacccaa gacactttgt    6780
actccgtgaa agagttaagc atctcgttga tctcctgaac ccatggtcca acggcagaca    6840
aattccgagt aggttgattt atcatctgca caaccgactt gctgtcgagt tccacatgca    6900
ctctcggtac ctgtctctcc agcgccatct ggatcacctt cctgcaagcg aggacttccg    6960
cagcttctgg atcgatgatg tgtgggtaga actgacaagc ccccactata tatgcttctt    7020
gatgatctct caacaccgct ccgcctccac ctttgtcatt atgccgagaa accgcaccgt    7080
ccacctttgt cattatgccg agaaaccgca ccgtcggcgt tgagcttaat ccatccctca    7140
tctggtggtt cccatcgctg tatcaccatc ggctccggga ccggcctgct cttctcatgc    7200
gccagcttcc attctgcaag gtgtagctta acctccatcg ctatttcatg tggtgcgcca    7260
ttctcttccc atccctcgct tcgttcctcg caagccacag actatagaca gcctggatca    7320
tgagctcctt ctccttccca gccgcccaga cgaaccagcc caatagccaa gaggcaactg    7380
cattctggga gtgaatctgg cacagcggga tctccaccgc tgctcccaat tccgaacaca    7440
atgccttcca gaactggatt gaatgctggc atgtccaaaa acggtgaacc accgtctctt    7500
ctcgtccaca tgccgcacaa aaaacaaccg gtttgatccg acgatgaaac aactccgacc    7560
caactgctag accattgcga ataaggcgct acatgtggat cttggtcttc cccggagcac    7620
tagtttccca caatgccatg aaacccttgt gtctgtggac tgaagaagag gactccggcc    7680
gtccggacct cgtttggttt attcacatac gcaggtggta cgcactctga accgagaaaa    7740
caccattctt cgtcatgttc cacgctaaaa aatcatcctc tccgtggcct tcgattgcaa    7800
tctgctgaat atctgctgca tctcccgggg tgaacatggc atccacacgg gcttcattca    7860
gccagcccca tcgggcagga ggagatctgc cactttcgtt actcccggca tatatgtttg    7920
tcccaaaggc ttcgtactcc cctctcgtgg tatccaagga tcatgatgga tgttaattct    7980
ggttccattc ccaattctcc atatgagtcc ttcccggagt agatctctcc catgcagcac    8040
actcctgaac gtgtaggacc ccgaagacgg acatgaagtc gtaaggatag agtcatcctt    8100
gaaataaagt gctttgagca cccgtgcaca taacgagtta ggctcctata ggatgcgcca    8160
agcttgcttg gccagaaggg cttggttgaa agcttccggg tcacgaaaac ccatgccacc    8220
atccctctta ctagcacaca tcttcttcca cgatatcaat gaaccttcca ttcaccattc    8280
attgcgcccc accagaattt agaagagaca gaagtcaggt tccggtacat cttctttgag    8340
aggcgaaaac aactcatggt ataggtaggt gtcgactggt ggccagattt tatcaaaaca    8400
tctcttgctg cctttgagag gccttgacat ttccatccac tcacttttcc tttcgagctt    8460
tccgtaacat gcttaaaaac cccatctttt gatcttctaa ccagtgttgg aagaccaaga    8520
tatctctcac taagagcttc agattgaatg ccacaaatat ttttgacttg tgtcttggtc    8580
tgctctatgc atcccttccc aaagaaaata gaggactttt ttcaagttaa ttttttgtcc    8640
agaagctttt tcatacttga tcaatatctc acacaaagtc tccatatttt ccttggttcc    8700
ttccaggaac acaatgctgt catccgcaaa taggagatgt gttatatggg ggccagtgct    8760
cccaaacgac acacctttca gatttttgtc ctcctttgct ttattgagaa gagcagagaa    8820
accctccaca caaaataaga ataagtacgg tgaaagcggg ccaccctgcc tgagtcctcg    8880
cgtgggcttg aatctcctcg atagaccacc atttaacttg acagcaaatt gcgtcgacgt    8940
aacacacctc atcaccatag ccaccccaca taggatgaaa accatactgt accatcatct    9000
gttcaagaaa aacccaccgc accctatcgt aggccttcat catgtccagt tttaccgcac    9060
aaagagtctt tttcctctta cgagtccgga tagcatgaac acactcatac gctacaagga    9120
cattatccgt aatgaggcga cccggaacaa aggcactctg ttcctcagag ataagaatag    9180
ggagtatccc tttcaatctg ttagcaagaa cctttgtcgc cattttatac agaacattac    9240
acaggctaat ggggcgaaac tgtgatagca gctccggcga gtttactttg gggatcatca    9300
caatgatagt ggcgttgaac tcctccggtg ttgctgctcc attcaagaag tcacgaaccg    9360
cctgacacac atcgttttct accagtggcc agtgcctctg ataaaacagt gcgggaagcc    9420
cgtccggccc cggggccttt gtagggccca tctgaaaaag tgccacctct atttcatcat    9480
cagtgatagg tgaggtgagc ttatgattca tctccggagt gactaagagt gcaatgttct    9540
gtaacagccc ttcggtgtcc actgacccct cggatttgaa caagtgttca taaaaactca    9600
cagccatctc tctcatatcc tcatctaccg tgcaccttgt gccatcatcc ttcctcaaag    9660
ccttcacagt gtttttcctc ttgcgatgag aagcacggtt ttgaaagtac ttagggtttt    9720
gatccccagc ctgtagccag tccacacgtg attgctgttt gtatagtagc tcttcccgcg    9780
cataaatctc ccttagttgc tcctccaaat cccggacctc tagtgaggat ccagtctgaa    9840
ggtctctggt tcgggcatcg agcagttgca ctttgagctt cgctatctgt cgacgaatgg    9900
agccaaaaac ttcccgcgcc catcgctgca tattacctgt cgtcgtgcat aacctactcc    9960
acaccgctat gagcgaatga tcacccgttg ctgccgcttc ccaaacctcc tgaaccatag    10020
catcataatt tttgtgcctc gtccatgctt cctcgaattg gaaagctctc ggtcccctcc    10080
tctcagtacg cggagccgtc tccaacgcct gaatgaggat ggcctgatgg tctgattcct    10140
ccgtgaccaa gtgttcgaca gaggtctctg ggaacatgtc taggaagctc gccatgcacg    10200
tcgccctgtc cagtcggact tggatgttat cctccccatc cctcttatta ttccatgtat    10260
agggctaccc cgaaaaactt aagtccgcaa ggccacaatc agccaagcaa tctcggaaat    10320
cctccatctg tgcaaacggc ctcgggttgc cccccttatg atctgattga aacagggctt    10380
cattatagtc cccagcacaa atccacggca agttgtcttg cgccctcaat tacctgatag    10440
cgtcccaaga ttttttacga agttccgttt ttggctccat gtagaaacca atgaatctac    10500
aggttttgcc ctcccacacc atctccgcat caatgaaata ttggctccat ggcctaatag    10560
tcatagtgac tgagtctctc caccatagtg ccaatcctcc gcgaagcccc acacaatcaa    10620
ctgctactcc ttgcttaaac cctagcctcc actttaatcg ctccattgct ctcgccttct    10680
tcttttgtct cgcaaagaaa aaccaccgcc gggttgtagg accgtatcag gtctcttaat    10740
tcgtcaactg tcgagtccaa ccccaatcct cgacagttcc aggccaagag attcatggcg    10800
tccggcggcc ccccacctcg ggatctgccg atatgtcctg gttttcggag atgcgatcaa    10860
acacagtatt cgttttctgt cgcttatcac gaatgaaagc ctcatttgaa gtctgtctgt    10920
cagggtcatc ctttgccacc caaaattgct tcggccccct cttgcgtcca ccgtaatcat    10980
accttggcag gttcctggca aattgcacct ctctatactc ctgccttggc tttctaacat    11040
agtgcccctt ggtcctgttc ctgccgcgct cctcccctgg cccgaaccgg ctctggtcat    11100
cacctctgaa ttcacccaag ttttgtaacc gtcccgcaaa ccttctctcc ctctccgcat    11160
gccccgggct gccatcatga tagacctgtt gcttctcttg taacttgttc ctcaggtcct    11220
tctctctctt tttttcaagg ccgtgtcgca ggtccagctc cctggcctcc ccccgtcatt    11280
cccagtcctt tatggggttg tttatttccc ccctcattga tctagaacca ccgccagtgc    11340
ggggatccgt cgatcgtgat agttcctcat tcaagttgcg tttaattggt atatcctgtt    11400
ttcctttact ctggcgtccc cggtcgatgt cgccgattct gccactaccc caactgttat    11460
tgctgctcat agactggcca aaggacccct ccttttcatt tcctttcctg ctgagtgatg    11520
ctctaagcca tccgccccat tgagccgatg agtccgttgg aggtacacaa acgcctcccg    11580
catgcactaa ccggccacat tcaaagcaaa aatgagggat tttttcgtaa tgaaaatcaa    11640
accatggccc atccttgtca tcccgtgagg tttgaggtaa aaacctctca ccagaggctc    11700
gaacatagaa attcttgctc tcacccttag attgttgcct ctggccaccc cctcactgtc    11760
acagtcaact cgaacaatgt cccccaacca gttgcctaat gccttaccaa acttttcagt    11820
tctcttatct gggggtagat catccacccg gacccatacc tctatagaat caaaaaccat    11880
ctcagacggt cgtttatttt cttcatattc cttgagaata agcacgctga aattgtactg    11940
ccagggtccg ttgttcattg catgtttata atccccctca cttccaaagt gcacctcaaa    12000
cacattcgat cccaggtctc gaaatcttgc ttctctgtgc agtccccacg ctctcgtcat    12060
cgttcgttcc aaagcgctcc tgatcattgg tctgtttgaa cataccttcc caactgctga    12120
ccatcttgag cttttgggta gcacctcctc ctgatcatca aacaccaaac cttccgcctc    12180
cttatccatc agtaccatcc cacccatcct tgccgaaaga ctcgacatcg gatccggggt    12240
ttttctctca actggggatt ttgaagaacc cctgctcaat gaatctcccg tcttgcgcac    12300
cggcgtagcc atcgcagccc gagttgtacc agccggtgtt ttgttccgct gtgccgacac    12360
ccccggcgcc gtcgccggag gcgcggttcc tcgctggttt gtggagaccg acgccgtagc    12420
cacagatttt ggcatcgaaa aggccatctt ctccttcatc gtagcctcac ccttagcagg    12480
tgtaggccct ccacgtttct gtgagatcgc cgccgccgcc gtagatgcca ttgcccctga    12540
agccgccgtc gtcttctctg gtgctttctc caccatggct ccgcccgcag cagagaggga    12600
aacaccaccg atccgggact gagtcagcac cgtcgccttc ccgatcctga tcggaatctc    12660
tctcaccccc gtagcgaaaa ccctaaccct agcacgcgag cgcaatcgcc tcacgtcacc    12720
ttagcgtttt cccacgtggt ggaccccggg gagttggttt ctttaaggag tatgtttcaa    12780
gtttattttt ctttctttaa ggagttcttg ttttgaaaat tgttcggaaa cttcaaaaat    12840
gtttgcgctt acaaaaaatt tcaaatttta taaaaatggg tgtgttttca attttttttt    12900
cctaaattca aaaattgttt ccatttttag aatttgtttc ggaatttcta gaaacgttcc    12960
atttttctga aaatgtttgc atgtttttgt tcttgtattg aaaacttgat cacgaattca    13020
agaaatgttc ttctttcaaa ttgttggtca tgtattaaaa atatgttcat gtttcaatct    13080
tgttgggatt ttcagaattg ttctcccttt caaaattgtt ctaaaaattc aaaatatgtt    13140
cgttatttta aaaaaatccc cgttttgaaa acaattctca taacgcgaaa aaagttcatg    13200
tttacaaaaa tgttaagaat attaaaaatt gtccctgttt ataaatgatg ttcacgtttt    13260
aaaaaaatgt ttgggaattt caaaaaatgt tcgtgcttct caaaaattgt tcaacaattc    13320
aaaaaatgtt cccattgtga aaaactgttc agaatattaa aaattgtctc acaaattcag    13380
taatgtttgt gttttcaaaa aatgttcggg aattttgaaa aaagttcaac aattcaaaac    13440
agtaaacagg cactctcgct acagcaccca ctattgggcc ggcccagtca cggggtccct    13500
gtgcgtcggt cgcgtggctg ttcgaggcaa aacgcgtcga ataggagctc ctgagctcct    13560
gtatgacgct tgttagcgtc aaacagaaga gcttccgcac agggctcgcg caaacgagcc    13620
gtcccattga taggccaatg taagaaaaaa agtaacgaac gaaaaatcat agcgctagtt    13680
ggtttccaac ttgcgacctt gcactggata gccacgtcga atgccactcc cgctagcaac    13740
tggtattatt tttaactata tcgtaaactt caagtaccat gtacagcggc agatcggttt    13800
tttaatcttc attcaaaaaa aatgaataat gttttcttga acaaattttg aaactcgaac    13860
aaactgttaa aacatatttt tttaaaactt acaaatcatt gaaaacatga acacaaattt    13920
attacttttt tatatacgat gaatgatttt caaatataca ctgaacattt tttagatgta    13980
cgatgaacaa ttttgaagaa catagtgaac attttcgtga tatacactga acaaaactta    14040
aaacataatg aacatttttg tgatatacca tgaacaaatt ttgaacattc aacattttta    14100
taatataatc tgaacaattt ttaaccacgc attgaacaat tttgtgatat gcgctgaaaa    14160
aacatttaaa tacccattaa cattttgtga tatacactga acaattttaa aattttaaca    14220
aaatttgaaa aagttaataa aattatagaa aactgtgaac gcgttttgaa ataacgaatt    14280
tcgttgggat ttcgaaacat tttcttgaaa acaaagtata aaaatagaaa cgaaaaatga    14340
taaaatgaac ggaaaggaaa atgaaaagaa atacaaacaa aaacagaata aaatagaaat    14400
aaaaaatgaa acagggaaaa accagcaaaa cattgaacat ttttgtaaaa aaatacgctg    14460
gaaatttttt agctaaacat tgaacatttt tgtgatatac actgaacaaa tatttaaata    14520
tacattgaac atttctgtga tatacgatga agaaagtttt gaattgtgac aattttttaa    14580
aaaagtgatt ttttggaaac cattaacatt tttttatatc atgaacaaaa ttatgaattt    14640
caaacttttt gaaaacaaag aataaacaaa tgaaaaagaa cagaagcaga aaaaaaggaa    14700
aaaagaaaac aggcaaaaag ggaaaaccga caaaaagaaa aaaacaaaaa aacccggtta    14760
agggaacctt ctagaaggtt cccaaaattg gttgccagga gctgctttaa acgctcgtta    14820
tgggccagcc catttcgcac gcgcttcagc aaaagcggcg cagctggacg ctcgcgcccg    14880
tcacataggg ttcgcccccc cccccccaag ggcgttttta ggcaaaaaaa atagcgcatg    14940
ttggggttgg ccggtactgt ttttggcgtg ggaggctcgg ggagtttcaa ctcaaattcg    15000
gcacgaattc gttacacttc ggcacaaatt cagcaaagaa taatttttat cgcatagttt    15060
atcacaaata ttagtacaaa tcaaatagtt caacgaagca agcttataat tcgaacacaa    15120
actaaaacac atcaaactag gcgttgcctt tgagcctcca taggtgctcc accagatcgt    15180
gctgcagtcc ttatgcacat atagctctcg gattcctaac gcatattgag gaaggcagcc    15240
catgctaccg gtacctggta atcaacacct gcaatatggt tcagtgtcaa acactggctc    15300
gtcctgctcg ctctcaatga tcatgttgtg caagatgaca catcaattca tcacatccca    15360
catctgagat ttcgaccagg                                                15380