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1、10申请公布号CN101974500A43申请公布日20110216CN101974500ACN101974500A21申请号201010531024122申请日20101024C12N9/28200601C12R1/12520060171申请人津市市新型发酵有限责任公司地址415400湖南省津市市双剂路85号72发明人唐建唐雪峰韩少中74专利代理机构常德市长城专利事务所43204代理人张启炎54发明名称高纯中温淀粉酶的生产方法57摘要高纯中温淀粉酶的生产方法，包括种子培养、发酵产酶和后处理提纯各阶段，步骤如下一、材料准备，购买枯草芽孢杆菌的甘油管菌种，准备发酵培养基和种子培养基；二、种子培养。
2、，开始时进行平皿培养，然后进行摇瓶培养，最后在种子罐中培养；三、发酵产酶，发酵温度为3135，PH为6668，通风比10406；基础料加补料工艺及脉冲进氨；四、后处理提纯，即发酵液第一次絮凝处理第二次絮凝处理板框压滤超滤成品加稳定剂、防腐剂处理二次升温成品。本发明有效的解决产品收得率低、易沉淀及微生物指标不合格的问题，使产品质量抽检合格率100，使发酵活力提高近2倍，发酵酶活达到1300U/ML以上，纯度提高了3倍，并且产品质量稳定。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图3页CN101974504A1/1页21高纯中温淀粉酶的生产方法，包括种。
3、子培养、发酵产酶和后处理提纯各阶段，其特征在于，步骤如下一、材料准备，购买枯草芽孢杆菌的甘油管菌种，该菌株呈短杆状、两端钝园、单独或成链状，在淀粉培养基菌落园形，表面光滑湿润、有粘性、产孢子较少；发酵培养基各成分重量比例如下豆饼粉35、玉米浆12、玉米淀粉1620、磷酸氢二钾0204、磷酸二氢钾0102、硫酸镁005015、硫酸锰001003、消泡剂0204，其余为水；种子培养基各成分重量比例如下蛋白胨0515，牛肉膏0204，酵母膏0103，葡萄糖005015，氯化钠005015，其余为水；二、种子培养，开始时进行平皿培养，然后进行摇瓶培养，最后在种子罐中培养，种子罐01MPA灭菌2040分。
4、钟，培养条件PH6370，温度3135，2530HR，转速240转/分，通风比102，种子生长进入对数期，镜检菌丝密集，大部分断裂成两联菌，无杂菌，PH上升至高峰向下回落01时即可移入发酵罐；三、发酵产酶，工艺条件，发酵温度为3135，PH为6668，通风比10406；基础料加补料工艺及脉冲进氨；流加通氨调节PH至菌丝生长代谢最佳值，流加补料，在补料中加入含氮源的营养基，发酵罐转速160转/分，发酵过程中，当PH下降至65时开始通液氨，DE值下降至20，PH不再下降，有上升趋势，开始流加补料，每小时流加补料一次，将DE值控制在1020之间，发酵至4555小时，细胞空胞率达80以上时，PH值上升。
5、到72，酶活力不再增长，镜检菌丝大部分死亡时，即可结束发酵，发酵酶可达12501350U/ML，发酵结束转入后处理提纯；四、后处理提纯，即发酵液第一次絮凝处理第二次絮凝处理板框压滤超滤成品加稳定剂、防腐剂处理二次升温，一次升温7278、保温时间30分钟，二次升温6268、保温时间60分钟，成品。2根据权利要求1所述的高纯中温淀粉酶的生产方法，其特征在于，后处理提纯步骤，首先用氯化钙溶液进行第一次絮凝处理，用硅藻土、磷酸盐和石灰水对发酵罐进行第二次絮凝处理，然后压入消毒空气，形成压力缸，进行一次板框压滤，得滤饼和清液，再进行二次板框压滤，又得清液，即超滤循环液，然后进入冷却器，加冷却水，进行超滤。
6、，超滤后进行一次理化检测，然后用盐、糊精和醋酸钠进行调配，调配后升温至75，30分钟，然后用冷却水降温，再用硅藻土过滤，进入二次升温桶升温至65，60分钟，再用冷却水降温后，用硅藻土进行成品精过滤，装入成品储罐，再进行一次理化检测，合格后进行无菌包装、入库。权利要求书CN101974500ACN101974504A1/3页3高纯中温淀粉酶的生产方法技术领域0001本发明涉及酶制剂行业，即一种高纯中温淀粉酶的生产方法。背景技术0002发酵法生产中温淀粉酶在我国生产时间较长，中温淀粉酶是经枯草芽孢杆菌经液体深层培养，提取工艺精制而成，能在较低温度条件下随机水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中14葡萄苷健。
7、，使得胶状淀粉的粘度迅速降低，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。该酶广泛应用于纺织、制革、饲料、造纸、酒精、啤酒、白酒等发酵领域。但由于目前的高纯中温淀粉酶生产工艺简单、粗放，产品发酵活力低，质量低下，严重的制约了本行业的发展，妨碍了该酶制剂随着需求的大幅增长。发明内容0003为了克服目前中温淀粉酶生产工艺简单、粗放，产品发酵活力低，质量低下的缺点，本发明通过采取精细的发酵工艺，使发酵活力提高近2倍，使发酵酶活达到1300U/ML以上，优化提取工艺，纯度提高了3倍，并且产品质量稳定。0004这种高纯中温淀粉酶的生产方法，包括种子培养、发酵产酶和后处理提纯各阶段，其特征在于，步骤如下0005一、。
8、材料准备，购买枯草芽孢杆菌的甘油管菌种，该菌株呈短杆状、两端钝园、单独或成链状，在淀粉培养基菌落园形，表面光滑湿润、有粘性、产孢子较少；0006发酵培养基各成分重量比例如下豆饼粉35、玉米浆12、玉米淀粉1620、磷酸氢二钾0204、磷酸二氢钾0102、硫酸镁005015、硫酸锰001003、消泡剂0204，其余为水；0007种子培养基各成分重量比例如下蛋白胨0515，牛肉膏0204，酵母膏0103，葡萄糖005015，氯化钠005015，其余为水；0008二、种子培养，开始时进行平皿培养，然后进行摇瓶培养，最后在种子罐中培养，种子罐01MPA灭菌2040分钟，培养条件PH6370，温度313。
9、5，2530HR，转速240转/分，通风比102，种子生长进入对数期，镜检菌丝密集，大部分断裂成两联菌，无杂菌，PH上升至高峰向下回落01时即可移入发酵罐；0009三、发酵产酶，工艺条件，发酵温度为3135，PH为6668，通风比10406；基础料加补料工艺及脉冲进氨；流加通氨调节PH至菌丝生长代谢最佳值，流加补料，在补料中加入含氮源的营养基，发酵罐转速160转/分，发酵过程中，当PH下降至65时开始通液氨，DE值下降至20，PH不再下降，有上升趋势，开始流加补料，每小时流加补料一次，将DE值控制在1020之间，发酵至4555小时，细胞空胞率达80以上时，PH值上升到72，酶活力不再增长，镜检。
10、菌丝大部分死亡时，即可结束发酵，发酵酶可达12501350U/ML，发酵结束转入后处理提纯；0010四、后处理提纯，即发酵液第一次絮凝处理第二次絮凝处理板框压滤超说明书CN101974500ACN101974504A2/3页4滤成品加稳定剂、防腐剂处理二次升温，一次升温7278、保温时间30分钟，二次升温6268、保温时间60分钟，成品。0011本发明采用连续流加补料、脉冲加液氨工艺发酵产酶，采用二次絮凝、二次升温提纯后处理工艺，有效的解决产品收得率低、易沉淀及微生物指标不合格的问题，使产品质量抽检合格率100，使发酵活力提高近2倍，发酵酶活达到1300U/ML以上，纯度提高了3倍，并且产品质。
11、量稳定。产品生化指标酶活5000U/ML，PH值65，比重12G/ML，菌落总数1000个/ML，无大肠菌群。附图说明0012图1是本发明发酵工艺流程图。0013图2是本发明提取工艺之一流程图。0014图3是本发明提取工艺之二流程图。具体实施方式0015现通过具体实施例结合图1和图2对本发明详细说明如下0016一、材料准备，菌种，购买枯草芽孢杆菌；购自张家港市金源生物化工有限公司，地址，江苏省张家港市乘航老宅路18号，邮编215617，电话8651258670730。该菌株呈短杆状、两端钝园、单独或成链状，在淀粉培养基菌落园形，表面光滑湿润、有粘性、产孢子较少。0017发酵培养基各成分重量比例。
12、如下豆饼粉4、玉米浆15、玉米淀粉18、磷酸氢二钾03、磷酸二氢钾015、硫酸镁01、硫酸锰002、消泡剂03，其余为水；0018种子培养基各成分重量比例如下蛋白胨1，牛肉膏03，酵母膏02，葡萄糖01，氯化钠01，其余为水；0019种子培养和发酵过程如图1所示0020二、种子培养，开始时将甘油管菌种进行平皿培养，然后进行摇瓶培养，最后在种子罐中培养，种子罐01MPA灭菌30分钟，培养条件PH66；温度33；27HR，转速240转/分，通风比102，种子生长进入对数期，镜检菌丝密集，大部分断裂成两联菌，无杂菌，PH上升至高峰向下回落01时即可移入发酵罐；0021三、发酵，工艺条件，发酵温度为3。
13、3，PH为67，通风比106；基础料加补料工艺及脉冲进氨；流加通氨调节PH至菌丝生长代谢最佳值，流加补料，在补料中加入含氮源的营养基，发酵罐转速160转/分，通风比在开始加料的12小时，通风比104，补料时，通风比106，补料结束时通风比104，发酵过程中，当PH下降至65时开始通液氨，DE值下降至20，PH不再下降，有上升趋势，开始疏加补料，每小时流加补料一次，将DE值控制在1020之间，发酵至50小时，细胞空胞率达80以上时，PH值上升到72，酶活不再上升，酶活力不再增长，镜检菌丝大部分死亡，即可结束发酵，发酵酶可达1250U/ML，发酵结束即转入后处理提纯；0022四、后处理提纯，即发酵。
14、液第一次絮凝处理第二次絮凝处理板框压滤超滤成品加稳定剂、防腐剂处理二次升温，一次升温7278、保温时间30分钟，二次升温6268、保温时间60分钟，成品。说明书CN101974500ACN101974504A3/3页50023如图2和图3所示，首先用氯化钙溶液进行第一次絮凝处理，用硅藻土、磷酸盐和石灰水对发酵罐进行第二次絮凝处理，然后压入消毒空气，形成压力缸，进行一次板框压滤，得滤饼和清液，再进行二次板框压滤，又得清液，即超滤循环液，然后进入冷却器，加冷却水，进行超滤，超滤后进行一次理化检测，然后用盐、糊精和醋酸钠进行调配，调配后升温至75，30分钟，然后用冷却水降温，再用硅藻土过滤，进入二次。
15、升温桶升温至65，60分钟，再用冷却水降温后，用硅藻土进行成品精过滤，装入成品储罐，再进行一次理化检测，合格后进行无菌包装、入库。0024一次性投料，由于基础浓度高，渗透压大，不利于菌丝大量代谢，中后期营养缺乏，造成菌丝过早衰退，因而产酶低下，从而造成单罐能耗大，单位生产成本大。由于采用基础料加补料加入含氮源营养基及脉冲通氨，使基础浓度低，渗透压小，溶氧好，适宜菌丝生长产酶，因而最终放罐活力增加大，降低了单罐能耗，降低了单位生产成本。在发酵过程中，菌丝代谢旺盛，PH至下降快，因而产酶快，高。0025经过工艺的改进，使产品的各项技术指标均达到最佳且稳定，适合大量生产要求。通过对发酵工艺的改进，使产酶活力提高了近2倍，对后处理工艺改进后，产品的质量大幅提高且稳定。收率93，产品酶活力5632U/ML，细菌总数1102个/ML，无沉淀，PH65。说明书CN101974500ACN101974504A1/3页6图1说明书附图CN101974500ACN101974504A2/3页7图2说明书附图CN101974500ACN101974504A3/3页8图3说明书附图CN101974500A。