黄牛 TAS1R2 基因的单核苷酸多态性及其检测方法 技术领域 本发明属于分子遗传学领域， 涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性 (SNP) 作 为分子遗传标记， 特别涉及一种黄牛 TAS1R2 基因的单核苷酸多态性及其检测方法。
背景技术 近几年来， 我国肉牛生产发展很快， 但生产水平较低， 平均产肉率不高， 其中一个 重要原因是迄今我国还没有一个自己培育的专门化肉牛品种。要大力发展我国的肉牛生 产， 除了利用国外优秀的肉牛品种杂交改良我国地方黄牛外， 还必须培育自己的肉牛品种。
作为世界牛品种资源宝库的重要组成部分， 我国黄牛品种资源十分丰富， 适应性 强， 肉质良好。 然而， 由于历史上以役用为主， 我国黄牛作为规模化肉用生产的牛种， 缺点也 是明显的。这主要表现在后驱不发达， 产肉少， 育肥增重速度赶不上国外的专门化品种， 加 上没有经过系统的肉用性能选育， 肉的品质规格往往差异较大， 优质高档肉块产量少， 造成 发展肉牛生产的规模效益比不上专门化的国外肉牛品种。但另一方面， 我国各黄牛品种内 个体间存在极大的差异， 一些个体的生长肥育性能较好。 在一些群体中， 部分个体具有很好 的肉用特征。如果通过品种内高强度的选择和培育， 完全有可能在较短时间内培育成为中 国特有的优良肉牛品种。
肉用性状是典型的、 具有重要经济价值的数量性状， 受环境因素影响较大， 用常规 育种方法进行育种进展缓慢。 20 世纪 80 年代后期以来， 国际上的动物遗传育种已经进入分 子水平， 即分子育种， 使育种朝着快速改变动物基因型的方向发展。近几年来， 由于分子生 物学和各种分子生物技术的发展， 使人们又可能直接从遗传物质本身的基础上揭示生物的 性状特征， 它与基因产物的研究相比克服了年龄、 性别、 组织及各种内外环境因素的影响， 而且所提供的遗传差异， 即遗传标记的种类又非常多， 如微卫星、 PCR-SSCP、 PCR-RFLP 等遗 传标记的种类也越来越多， 因此， 分子育种越来越受到人们的重视。在 20 世纪 90 年代中期 以后， 我国逐渐开展了黄牛肉用性能的分子遗传学研究。采用基因标记等现代分子育种新 技术结合常规育种， 以便能够加快中国肉牛品种的培育和选育。
SSCP(single strand comformation polymorphism) 即 单 链 构 象 多 态 性。 PCR-SSCP 技术是 PCR 技术和 SSCP 技术的结合， 其原理是变性后的产物在电泳时， 空间构象 不同的单链 DNA 会因其迁移率不同而得到分离， 从而检测相应的遗传变异。这项技术具有 简便、 快速、 敏感和经济等特点， 适用于大样本基因变异情况的筛查。
TAS1R2(taste receptor， type 1， member 2) 是味觉受体第一家族的成员。 目前已 确定的哺乳动物味觉受体基因家族有两个， 即味觉受体第一家族 (taste receptor family T1Rs) 和味觉受体第二家族 (taste receptor family 2 members， T2Rs)。研究 1 members， 表明， 甜味与鲜味 ( 氨基酸味 ) 主要由味觉细胞上 G 蛋白偶联受体第一家族 (T1Rs) 识别。
味觉是动物最基本、 最原始的生理感觉之一， 人和动物利用味觉来识别食物的性 质、 调节食欲、 控制摄食量。鲜和甜被人们认为为相对 “好” 的味觉， 它能促进对营养食物较 多进食 ； 而苦和酸相对而言的是 “坏” 的味觉， 使得机体对有毒的和低 PH 值食物更加警惕，
促使它们拒绝或是减少对含有有害物质的摄取。 所以味觉恰如其分的调整了生物体的采食 行为。
T1Rs 家族由 3 个基因组成， T1R1、 T1R2 和 T1R3， 它们以异源二聚体的形式发挥作 用， T1R2 和 T1R3 结合形成甜味受体， T1R1 和 T1R3 一起作为鲜味受体。甜味觉一直是人类 和其他动物的喜好的味觉， 所以甜味觉可以提高食欲， 增加摄食量。为此， TAS1R2 基因遗传 变异或 SNP 位点在动物生产实践中对肉用性状、 生长发育性状具有重要的作用。
关于 TAS1R2 基因的研究国内外多见于人和小鼠， 还未见有关 TAS1R2 基因遗传变 异或 SNP 研究的报道。由于目前中国黄牛 TAS1R2 基因遗传变异领域的研究匮乏， 使该基因 位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状 ( 如 ： 产肉、 生长发育等性状 ) 关联的研究成 为空白。 发明内容
本发明解决的问题在于提供黄牛 TAS1R2 基因单核苷酸多态性检测方法及其应 用， 寻找与黄牛经济性状相关的 SNP 作为分子标记， 加快黄牛良种繁育速度。
本发明通过以下技术方案来实现 ： 一种黄牛 TAS1R2 基因的单核苷酸多态性， 其基因单核苷酸多态性包括 ：
黄牛 TAS1R2 基因第 288 位为 A 或 G 的单核苷酸多态性。
上述黄牛 TAS1R2 基因的单核苷酸多态性的检测方法为 ：
以包含 TAS1R2 基因的待测黄牛全基因组 DNA 为模板， 以引物对 P 为引物， PCR 扩 增黄牛 TAS1R2 基因 ； 对扩增产物进行变性之后， 再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ； 根据电泳结 果鉴定黄牛 TAS1R2 基因第 288 位的单核苷酸多态性 ；
所述的引物对 P 为 ：
上游引物 P1 ： F5′ -CACCTCTGAGACCTCCATT-3′
下游引物 P2 ： R5′ -ACTCACTCCTTGCACTTGG-3′。
所述的 PCR 扩增反应程序为 ：
95℃预变性 5min ； 94℃变性 30s， 64℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 35 个循环 ； 72℃延 伸 10min。
所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为 10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
所述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 ： TAS1R2 基因第 288 位的碱基多态性为 ： AA 型表现 ； AG 型表现 ； GG 型表现。
与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ：
本发明公开了与黄牛产肉性状相关的功能基因 TAS1R2 的核苷酸多态性， 该核苷 酸多态性能够作为一个分子遗传标记， 利用标记位点信息和数量性状的表型信息， 更准确 估计动物个体的育种值， 提高选择效率， 加快育种进展。
针对上述 TAS1R2 基因的 SNP 多态性， 本发明还公开了其检测方法， 通过设计特定 的 PCR 引物扩增片段， 运用 SSCP 方法并结合 DNA 测序方法， 简单、 快速、 低成本、 精确的检测 其单核苷酸的多态性。
本发明对 TAS1R2 基因的 SNP 进行了基因分型和基因频率分析， 以及与郏县红牛、 秦川牛和鲁西牛性状之间进行了性状关联分析 ； 结果显示 TAS1R2 基因的核苷酸多态位点
能够成为分子遗传辅助育种的标记。
由于 TAS1R2 基因功能主要涉及产肉这个经济性状， 本发明提供的检测方法为 TAS1R2 基因的 SNP 与体尺性状关系的建立奠定了基础， 以便用于中国黄牛肉用经济性状的 标记辅助选择， 快速建立遗传资源优良的黄牛种群。 附图说明 图 1 为黄牛血样基因组 DNA 电泳检测图 ；
图 2 为黄牛 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp PCR 扩增产物电泳图 ；
图 3 为黄牛 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 TAS1R2 基因多态性的电泳结果图 ； 泳道 2、 4 为 AA 基因型个体 ； 泳道 1、 3、 5 为 AG 基因型个 体； 泳道 6 为 GG 基因型个体。
图 4 为黄牛 TAS1R2 基因 SNP 的不同基因型测序峰图。
具体实施方式
本发明以 TAS1R2 基因保守序列设计引物扩增 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp 片段， 分别以 3 种黄牛品种的基因组为模板， 进行 PCR 扩增， 并对 PCR 产物纯化， 经 SSCP 分析和测 序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态 ； 针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析， 并 提供其检测方法， 使得 TAS1R2 基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、 方便检测的分子遗 传标记， 为加快建立具有优质经济性状的黄牛种群提供依据。
a、 黄牛 TAS1R2 基因部分 DNA 序列的扩增及其多态性的检测
1、 黄牛血样的采集及处理
取黄牛血样 10mL， 加入 0.5mol/L 的 EDTA 500μL 抗凝， 缓慢颠倒 3 次后放入冰 盒， -80℃保存备用。
本发明采用了 3 个黄牛品种， 具体如表 1 所示。
表 1 黄牛样品来源表
品种 郏县红牛 秦川牛 鲁西牛
样品数 394 116 65样品名称 血样 血样 血样样品来源 陕西 河南 河南采样方式 随机采样 随机采样 随机采样采样时间 2008.7-9 月 2008.7-9 月 2008.7-9 月2、 血样基因组 DNA 的提取、 纯化
(1) 将冷冻血样室温解冻， 转移 500μL 至 1.5mL Eppendorf 管， 加入等体积 PBS 缓 冲液， 充分混匀， 12000r/min 离心 10min(4℃ )， 弃去上清液， 重复上述步骤至上清液透明、 沉淀呈淡黄色。
(2) 在离心管中加入 DNA 抽提缓冲液 500μL， 摇动， 使血细胞沉淀脱离离心管管 壁， 37℃水浴 1h。DNA 抽提缓冲液的配制 ： 0.6057g 的 Tris、 18.612g 的 EDTA 和 2.5g 的 SDS加超纯水 500mL， 灭菌、 调 pH 至 8.0， 4℃保存备用。
(3) 加蛋白酶 K 3μL(20mg/mL) 并混匀， 55 ℃过夜至澄清， 尚未澄清者， 可补加 1μL 蛋白酶 K 混匀继续消化至澄清。
(4) 将反应液冷却至室温， 加 Tris- 饱和酚 500μL， 温和摇动离心管 20min， 使其充 分混匀 ； 4℃， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另一 1.5mL 离心管中， 重复一次。
(5) 加氯仿 500μL， 充分混匀 20min， 4℃， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另 一 1.5mL 离心管中。
(6) 加 0.1 倍体积 NaAc 缓冲液及 2 倍体积的冰冷的无水乙醇， 混合转动离心管直 至白色的絮状沉淀析出， -20℃保存 30 ～ 60min。
(7)4℃， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 用 70％的冰冷乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次。
(8)4℃， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 室温下使乙醇挥发干净。
(9) 干燥后的 DNA 溶于 80 ～ 100μL 的 TE- 缓冲液或超纯水， 4℃保存直至 DNA 完 全溶解， 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量， -80℃保存。
(10)500μL 的 DNA 溶液中加入 10％ SDS 使其终浓度为 0.1％， 加入蛋白酶 K 至终 浓度达到 50μg/mL ； (11)5℃保温 10h 左右 ；
(12) 等体积苯酚、 氯仿、 异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 和氯仿分别抽提一次 ；
(13)12000r/min 离心 5min 分相， 吸取上层水相至另一离心管中 ；
(14) 加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠和 2 倍体积冰冷无水乙醇沉淀 DNA ；
(15) 倒掉液体， 70％乙醇洗涤后晾干， 加入 60μL 灭菌超纯水溶解， 4℃待检测。
3、 基因组 DNA 的电泳检测
用 1％的琼脂糖对部分黄牛血样 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果见 图 1， 从图中可以看出黄牛基因组 DNA 的质量非常高， 可用于下一步扩增。
4、 PCR 扩增引物设计
从 NCBI 数据库中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 获得牛的 GenBank 登录号 为： NC_007300 的 TAS1R2 基因 DNA 序列， 以该基因序列保守区序列为参考利用 Primer 5.0 设计黄牛 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp 片段的 PCR 引物对， 其引物对序列如下 ：
上游引物 P1 ： F5′ -CACCTCTGAGACCTCCATT-3′
下游引物 P2 ： R5′ -ACTCACTCCTTGCACTTGG-3′。
5、 PCR 扩增黄牛 TAS1R2 基因
分别以 3 个黄牛品种的 DNA 为模版， 用设计的特定引物进行 PCR 扩增， PCR 总反应 体系为 25μL， 见表 2 ； PCR 总反应程序， 见表 3。
表 2PCR 反应体系
体系成分 10×PCR 缓冲液 (MBI)体积 (μL) 2.56101962683 A CN 101962684说MgCl2(25mmol/L) dNTPs(2.5mmol/L)明书1.5 2.5 0.25 0.25 2.0 1.0 15.0 25.05/7 页上游引物 (10pmol/L) 下游引物 (10pmol/L) Taq DNA 聚合酶 (0.5U/μL) DNA 模板 (50ng/μL) 灭菌超纯水 (H2O) 总体积
表 3PCR 反应程序
6、 PCR 扩增产物的电泳检测
用 1％的琼脂糖对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果见图 2， 从图中可 以看出扩增产物的质量非常高， 可用作下一步分析。
7、 PCR-SSCP 分析
(1) 变性 ： 取 4μL PCR 产物与 6μL 上样缓冲液混合， 98℃变性 10min， 取出后迅速 置于准备好的碎冰中， 保证至少 5min 后开始点样。
(2) 电泳 ： 开始 10min 300 ～ 400V 高压电泳， 然后 140 ～ 200V 电泳 14h 左右。
(3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ： 根据图像人工初步判断基因型， 经过测序后最终 判断基因型。当 TAS1R2 基因第 288 位发生 A ＞ G 突变时， 由于黄牛为 2 倍体动物， 所以当 发生 A ＞ G 的突变时， 可形成 3 种不同的基因型， 分别为 AA、 AG、 GG， 其 SSCP 凝胶检测的结 果如图 3 所示 ： 其中， AA 型表现为上一条带 ； GG 型表现为下一条带 ； 杂合子 GA 型表现为上 下结合的两条带。
(4) 不同基因型个体 PCR 产物的测序验证
根据条带的类型， 如图 3 所示的凝胶电泳检测结果能够基本判定是否发生了点突 变， 再结合如图 4 所示的 DNA 测序结果， 就可以确定是否发生了突变， 从而检测其 SNP 多态
性。
c、 黄牛 TAS1R2 基因第 288 位的 SNP 作为分子标记在不同黄牛群体多态性中的应用 1、 群体多态性中的诊断
利用上述的 SNP 多态性检测方法对郏县红牛 394 份 DNA 样品、 秦川牛 116 份 DNA 样品和鲁西牛 65 份 DNA 样品， 分别进行 SNP 多态性的鉴定 ； 统计其 SNP 位点的频率以及与 性状的关联情况。
2、 SNP 位点的频率统计分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。 PAA ＝ NAA/N， 其中 PAA 代表某一位点的 AA 基因型频率 ； NAA 表示群体中具有 AA 基因型的个体数 ； N 为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。 计算的公式 可以写成 ： PA ＝ (2NAA+NAa1+NAa2+......+NAan)/2N。式中， PA 表示等位基因 A 频率， NAA 表示群 体中具有 AA 基因型的个体数量， NAai 表示群体中具有 Aai 基因型个体数量， a1-an 为等位基 因 A 的 n 个不同的复等位基因 ； 统计结果见表 4。
表 4 黄牛 TAS1R2 基因第 288 位 SNP 基因频率分布表从表 4 可以看出 ： 郏县红牛、 秦川牛和鲁西牛的 A 等位基因频率远高于 G 等位基 因， 这表明等位基因可能 AA 可能是优势基因型。
3、 基因效应的关联分析
基因型数据 ： 基因型 AA、 AG 和 GG
生产数据 ： 体尺数据 ( 体长、 体高、 胸围、 管围 )
关联分析模型 ：
利用 SPSS(17.0) 软件分析基因位点、 公畜、 场别效应、 年龄和品种效应与生长性 状的相关性。 先对数据进行描述分析， 确定是否存在离群值， 再利用最小二乘分析对数据校 正； 根据数据特征， 利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下 ：
yijklmn ＝ μ+Genotypei+Sj+Bk+Fl+Agem+Xn+eijklmn
其中 ： yijklm 为个体表型记录 ； Fl 场别效应 ； Sj 为种公畜效应 ； Bk ： 品种效应 ； Agem 为 年龄效应 ； Xn 为各种二级和二级以上互作效应， 如： Age×Genotype， Sj×Genotype 等 ； eijklmn 为随机误差 ； 运用 SPSS(17.0) 软件对数据进行分析， 并用最小二乘法拟合线性模型， 对各 基因型间体尺指标进行差异显著性检验。
结果表明 ( 见表 5) ： 对于第 288 位的 SNP 位点， AA 基因型为优势基因型 ； 对于体 高， 体长和胸围， AA 基因型个体的数值均显著高于 AG 基因型个体， 研究表明体尺性状与产 肉性状呈正相关， 这说明 AA 基因型可以成为一个提高黄牛产肉性状育种速度的分子遗传 标记。
表 5 多态位点与郏具红牛体尺之间的方差分析
背景技术 近几年来， 我国肉牛生产发展很快， 但生产水平较低， 平均产肉率不高， 其中一个 重要原因是迄今我国还没有一个自己培育的专门化肉牛品种。要大力发展我国的肉牛生 产， 除了利用国外优秀的肉牛品种杂交改良我国地方黄牛外， 还必须培育自己的肉牛品种。
作为世界牛品种资源宝库的重要组成部分， 我国黄牛品种资源十分丰富， 适应性 强， 肉质良好。 然而， 由于历史上以役用为主， 我国黄牛作为规模化肉用生产的牛种， 缺点也 是明显的。这主要表现在后驱不发达， 产肉少， 育肥增重速度赶不上国外的专门化品种， 加 上没有经过系统的肉用性能选育， 肉的品质规格往往差异较大， 优质高档肉块产量少， 造成 发展肉牛生产的规模效益比不上专门化的国外肉牛品种。但另一方面， 我国各黄牛品种内 个体间存在极大的差异， 一些个体的生长肥育性能较好。 在一些群体中， 部分个体具有很好 的肉用特征。如果通过品种内高强度的选择和培育， 完全有可能在较短时间内培育成为中 国特有的优良肉牛品种。
肉用性状是典型的、 具有重要经济价值的数量性状， 受环境因素影响较大， 用常规 育种方法进行育种进展缓慢。 20 世纪 80 年代后期以来， 国际上的动物遗传育种已经进入分 子水平， 即分子育种， 使育种朝着快速改变动物基因型的方向发展。近几年来， 由于分子生 物学和各种分子生物技术的发展， 使人们又可能直接从遗传物质本身的基础上揭示生物的 性状特征， 它与基因产物的研究相比克服了年龄、 性别、 组织及各种内外环境因素的影响， 而且所提供的遗传差异， 即遗传标记的种类又非常多， 如微卫星、 PCR-SSCP、 PCR-RFLP 等遗 传标记的种类也越来越多， 因此， 分子育种越来越受到人们的重视。在 20 世纪 90 年代中期 以后， 我国逐渐开展了黄牛肉用性能的分子遗传学研究。采用基因标记等现代分子育种新 技术结合常规育种， 以便能够加快中国肉牛品种的培育和选育。
SSCP(single strand comformation polymorphism) 即 单 链 构 象 多 态 性。 PCR-SSCP 技术是 PCR 技术和 SSCP 技术的结合， 其原理是变性后的产物在电泳时， 空间构象 不同的单链 DNA 会因其迁移率不同而得到分离， 从而检测相应的遗传变异。这项技术具有 简便、 快速、 敏感和经济等特点， 适用于大样本基因变异情况的筛查。
TAS1R2(taste receptor， type 1， member 2) 是味觉受体第一家族的成员。 目前已 确定的哺乳动物味觉受体基因家族有两个， 即味觉受体第一家族 (taste receptor family T1Rs) 和味觉受体第二家族 (taste receptor family 2 members， T2Rs)。研究 1 members， 表明， 甜味与鲜味 ( 氨基酸味 ) 主要由味觉细胞上 G 蛋白偶联受体第一家族 (T1Rs) 识别。
味觉是动物最基本、 最原始的生理感觉之一， 人和动物利用味觉来识别食物的性 质、 调节食欲、 控制摄食量。鲜和甜被人们认为为相对 “好” 的味觉， 它能促进对营养食物较 多进食 ； 而苦和酸相对而言的是 “坏” 的味觉， 使得机体对有毒的和低 PH 值食物更加警惕，
促使它们拒绝或是减少对含有有害物质的摄取。 所以味觉恰如其分的调整了生物体的采食 行为。
T1Rs 家族由 3 个基因组成， T1R1、 T1R2 和 T1R3， 它们以异源二聚体的形式发挥作 用， T1R2 和 T1R3 结合形成甜味受体， T1R1 和 T1R3 一起作为鲜味受体。甜味觉一直是人类 和其他动物的喜好的味觉， 所以甜味觉可以提高食欲， 增加摄食量。为此， TAS1R2 基因遗传 变异或 SNP 位点在动物生产实践中对肉用性状、 生长发育性状具有重要的作用。
关于 TAS1R2 基因的研究国内外多见于人和小鼠， 还未见有关 TAS1R2 基因遗传变 异或 SNP 研究的报道。由于目前中国黄牛 TAS1R2 基因遗传变异领域的研究匮乏， 使该基因 位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状 ( 如 ： 产肉、 生长发育等性状 ) 关联的研究成 为空白。 发明内容
本发明解决的问题在于提供黄牛 TAS1R2 基因单核苷酸多态性检测方法及其应 用， 寻找与黄牛经济性状相关的 SNP 作为分子标记， 加快黄牛良种繁育速度。
本发明通过以下技术方案来实现 ： 一种黄牛 TAS1R2 基因的单核苷酸多态性， 其基因单核苷酸多态性包括 ：
黄牛 TAS1R2 基因第 288 位为 A 或 G 的单核苷酸多态性。
上述黄牛 TAS1R2 基因的单核苷酸多态性的检测方法为 ：
以包含 TAS1R2 基因的待测黄牛全基因组 DNA 为模板， 以引物对 P 为引物， PCR 扩 增黄牛 TAS1R2 基因 ； 对扩增产物进行变性之后， 再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ； 根据电泳结 果鉴定黄牛 TAS1R2 基因第 288 位的单核苷酸多态性 ；
所述的引物对 P 为 ：
上游引物 P1 ： F5′ -CACCTCTGAGACCTCCATT-3′
下游引物 P2 ： R5′ -ACTCACTCCTTGCACTTGG-3′。
所述的 PCR 扩增反应程序为 ：
95℃预变性 5min ； 94℃变性 30s， 64℃退火 30s， 72℃延伸 30s， 35 个循环 ； 72℃延 伸 10min。
所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为 10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
所述的根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 ： TAS1R2 基因第 288 位的碱基多态性为 ： AA 型表现 ； AG 型表现 ； GG 型表现。
与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ：
本发明公开了与黄牛产肉性状相关的功能基因 TAS1R2 的核苷酸多态性， 该核苷 酸多态性能够作为一个分子遗传标记， 利用标记位点信息和数量性状的表型信息， 更准确 估计动物个体的育种值， 提高选择效率， 加快育种进展。
针对上述 TAS1R2 基因的 SNP 多态性， 本发明还公开了其检测方法， 通过设计特定 的 PCR 引物扩增片段， 运用 SSCP 方法并结合 DNA 测序方法， 简单、 快速、 低成本、 精确的检测 其单核苷酸的多态性。
本发明对 TAS1R2 基因的 SNP 进行了基因分型和基因频率分析， 以及与郏县红牛、 秦川牛和鲁西牛性状之间进行了性状关联分析 ； 结果显示 TAS1R2 基因的核苷酸多态位点
能够成为分子遗传辅助育种的标记。
由于 TAS1R2 基因功能主要涉及产肉这个经济性状， 本发明提供的检测方法为 TAS1R2 基因的 SNP 与体尺性状关系的建立奠定了基础， 以便用于中国黄牛肉用经济性状的 标记辅助选择， 快速建立遗传资源优良的黄牛种群。 附图说明 图 1 为黄牛血样基因组 DNA 电泳检测图 ；
图 2 为黄牛 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp PCR 扩增产物电泳图 ；
图 3 为黄牛 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp PCR 产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 TAS1R2 基因多态性的电泳结果图 ； 泳道 2、 4 为 AA 基因型个体 ； 泳道 1、 3、 5 为 AG 基因型个 体； 泳道 6 为 GG 基因型个体。
图 4 为黄牛 TAS1R2 基因 SNP 的不同基因型测序峰图。
具体实施方式
本发明以 TAS1R2 基因保守序列设计引物扩增 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp 片段， 分别以 3 种黄牛品种的基因组为模板， 进行 PCR 扩增， 并对 PCR 产物纯化， 经 SSCP 分析和测 序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态 ； 针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析， 并 提供其检测方法， 使得 TAS1R2 基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、 方便检测的分子遗 传标记， 为加快建立具有优质经济性状的黄牛种群提供依据。
a、 黄牛 TAS1R2 基因部分 DNA 序列的扩增及其多态性的检测
1、 黄牛血样的采集及处理
取黄牛血样 10mL， 加入 0.5mol/L 的 EDTA 500μL 抗凝， 缓慢颠倒 3 次后放入冰 盒， -80℃保存备用。
本发明采用了 3 个黄牛品种， 具体如表 1 所示。
表 1 黄牛样品来源表
品种 郏县红牛 秦川牛 鲁西牛
样品数 394 116 65样品名称 血样 血样 血样样品来源 陕西 河南 河南采样方式 随机采样 随机采样 随机采样采样时间 2008.7-9 月 2008.7-9 月 2008.7-9 月2、 血样基因组 DNA 的提取、 纯化
(1) 将冷冻血样室温解冻， 转移 500μL 至 1.5mL Eppendorf 管， 加入等体积 PBS 缓 冲液， 充分混匀， 12000r/min 离心 10min(4℃ )， 弃去上清液， 重复上述步骤至上清液透明、 沉淀呈淡黄色。
(2) 在离心管中加入 DNA 抽提缓冲液 500μL， 摇动， 使血细胞沉淀脱离离心管管 壁， 37℃水浴 1h。DNA 抽提缓冲液的配制 ： 0.6057g 的 Tris、 18.612g 的 EDTA 和 2.5g 的 SDS加超纯水 500mL， 灭菌、 调 pH 至 8.0， 4℃保存备用。
(3) 加蛋白酶 K 3μL(20mg/mL) 并混匀， 55 ℃过夜至澄清， 尚未澄清者， 可补加 1μL 蛋白酶 K 混匀继续消化至澄清。
(4) 将反应液冷却至室温， 加 Tris- 饱和酚 500μL， 温和摇动离心管 20min， 使其充 分混匀 ； 4℃， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另一 1.5mL 离心管中， 重复一次。
(5) 加氯仿 500μL， 充分混匀 20min， 4℃， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另 一 1.5mL 离心管中。
(6) 加 0.1 倍体积 NaAc 缓冲液及 2 倍体积的冰冷的无水乙醇， 混合转动离心管直 至白色的絮状沉淀析出， -20℃保存 30 ～ 60min。
(7)4℃， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 用 70％的冰冷乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次。
(8)4℃， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 室温下使乙醇挥发干净。
(9) 干燥后的 DNA 溶于 80 ～ 100μL 的 TE- 缓冲液或超纯水， 4℃保存直至 DNA 完 全溶解， 0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其质量， -80℃保存。
(10)500μL 的 DNA 溶液中加入 10％ SDS 使其终浓度为 0.1％， 加入蛋白酶 K 至终 浓度达到 50μg/mL ； (11)5℃保温 10h 左右 ；
(12) 等体积苯酚、 氯仿、 异戊醇 (25 ∶ 24 ∶ 1) 和氯仿分别抽提一次 ；
(13)12000r/min 离心 5min 分相， 吸取上层水相至另一离心管中 ；
(14) 加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠和 2 倍体积冰冷无水乙醇沉淀 DNA ；
(15) 倒掉液体， 70％乙醇洗涤后晾干， 加入 60μL 灭菌超纯水溶解， 4℃待检测。
3、 基因组 DNA 的电泳检测
用 1％的琼脂糖对部分黄牛血样 DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果见 图 1， 从图中可以看出黄牛基因组 DNA 的质量非常高， 可用于下一步扩增。
4、 PCR 扩增引物设计
从 NCBI 数据库中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 获得牛的 GenBank 登录号 为： NC_007300 的 TAS1R2 基因 DNA 序列， 以该基因序列保守区序列为参考利用 Primer 5.0 设计黄牛 TAS1R2 基因第 1 外显子 215bp 片段的 PCR 引物对， 其引物对序列如下 ：
上游引物 P1 ： F5′ -CACCTCTGAGACCTCCATT-3′
下游引物 P2 ： R5′ -ACTCACTCCTTGCACTTGG-3′。
5、 PCR 扩增黄牛 TAS1R2 基因
分别以 3 个黄牛品种的 DNA 为模版， 用设计的特定引物进行 PCR 扩增， PCR 总反应 体系为 25μL， 见表 2 ； PCR 总反应程序， 见表 3。
表 2PCR 反应体系
体系成分 10×PCR 缓冲液 (MBI)体积 (μL) 2.56101962683 A CN 101962684说MgCl2(25mmol/L) dNTPs(2.5mmol/L)明书1.5 2.5 0.25 0.25 2.0 1.0 15.0 25.05/7 页上游引物 (10pmol/L) 下游引物 (10pmol/L) Taq DNA 聚合酶 (0.5U/μL) DNA 模板 (50ng/μL) 灭菌超纯水 (H2O) 总体积
表 3PCR 反应程序
6、 PCR 扩增产物的电泳检测
用 1％的琼脂糖对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果见图 2， 从图中可 以看出扩增产物的质量非常高， 可用作下一步分析。
7、 PCR-SSCP 分析
(1) 变性 ： 取 4μL PCR 产物与 6μL 上样缓冲液混合， 98℃变性 10min， 取出后迅速 置于准备好的碎冰中， 保证至少 5min 后开始点样。
(2) 电泳 ： 开始 10min 300 ～ 400V 高压电泳， 然后 140 ～ 200V 电泳 14h 左右。
(3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 ： 根据图像人工初步判断基因型， 经过测序后最终 判断基因型。当 TAS1R2 基因第 288 位发生 A ＞ G 突变时， 由于黄牛为 2 倍体动物， 所以当 发生 A ＞ G 的突变时， 可形成 3 种不同的基因型， 分别为 AA、 AG、 GG， 其 SSCP 凝胶检测的结 果如图 3 所示 ： 其中， AA 型表现为上一条带 ； GG 型表现为下一条带 ； 杂合子 GA 型表现为上 下结合的两条带。
(4) 不同基因型个体 PCR 产物的测序验证
根据条带的类型， 如图 3 所示的凝胶电泳检测结果能够基本判定是否发生了点突 变， 再结合如图 4 所示的 DNA 测序结果， 就可以确定是否发生了突变， 从而检测其 SNP 多态
性。
c、 黄牛 TAS1R2 基因第 288 位的 SNP 作为分子标记在不同黄牛群体多态性中的应用 1、 群体多态性中的诊断
利用上述的 SNP 多态性检测方法对郏县红牛 394 份 DNA 样品、 秦川牛 116 份 DNA 样品和鲁西牛 65 份 DNA 样品， 分别进行 SNP 多态性的鉴定 ； 统计其 SNP 位点的频率以及与 性状的关联情况。
2、 SNP 位点的频率统计分析
基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。 PAA ＝ NAA/N， 其中 PAA 代表某一位点的 AA 基因型频率 ； NAA 表示群体中具有 AA 基因型的个体数 ； N 为检测群体的总数量。
基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。 计算的公式 可以写成 ： PA ＝ (2NAA+NAa1+NAa2+......+NAan)/2N。式中， PA 表示等位基因 A 频率， NAA 表示群 体中具有 AA 基因型的个体数量， NAai 表示群体中具有 Aai 基因型个体数量， a1-an 为等位基 因 A 的 n 个不同的复等位基因 ； 统计结果见表 4。
表 4 黄牛 TAS1R2 基因第 288 位 SNP 基因频率分布表从表 4 可以看出 ： 郏县红牛、 秦川牛和鲁西牛的 A 等位基因频率远高于 G 等位基 因， 这表明等位基因可能 AA 可能是优势基因型。
3、 基因效应的关联分析
基因型数据 ： 基因型 AA、 AG 和 GG
生产数据 ： 体尺数据 ( 体长、 体高、 胸围、 管围 )
关联分析模型 ：
利用 SPSS(17.0) 软件分析基因位点、 公畜、 场别效应、 年龄和品种效应与生长性 状的相关性。 先对数据进行描述分析， 确定是否存在离群值， 再利用最小二乘分析对数据校 正； 根据数据特征， 利用多元线性模型分析基因型效应。模型如下 ：
yijklmn ＝ μ+Genotypei+Sj+Bk+Fl+Agem+Xn+eijklmn
其中 ： yijklm 为个体表型记录 ； Fl 场别效应 ； Sj 为种公畜效应 ； Bk ： 品种效应 ； Agem 为 年龄效应 ； Xn 为各种二级和二级以上互作效应， 如： Age×Genotype， Sj×Genotype 等 ； eijklmn 为随机误差 ； 运用 SPSS(17.0) 软件对数据进行分析， 并用最小二乘法拟合线性模型， 对各 基因型间体尺指标进行差异显著性检验。
结果表明 ( 见表 5) ： 对于第 288 位的 SNP 位点， AA 基因型为优势基因型 ； 对于体 高， 体长和胸围， AA 基因型个体的数值均显著高于 AG 基因型个体， 研究表明体尺性状与产 肉性状呈正相关， 这说明 AA 基因型可以成为一个提高黄牛产肉性状育种速度的分子遗传 标记。
表 5 多态位点与郏具红牛体尺之间的方差分析
注： 字母不同表示差异显著 (P ＜ 0.05)。9101962683 A CN 101962684
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