使用经标记的抗生素鉴定抗生素耐受性.pdf

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1、10申请公布号CN101965407A43申请公布日20110202CN101965407ACN101965407A21申请号200980107249X22申请日2009013008001949020080201EPC12Q1/04200601G01N33/5820060171申请人米阿科姆诊断有限公司地址德国杜塞尔多夫72发明人I斯普敦W斯坦因74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华54发明名称使用经标记的抗生素鉴定抗生素耐受性57摘要本发明的主题为检测微生物的抗生素耐受性的方法，其包括下列步骤使疑似微生物与经荧光标记的抗生素接触，及观察其和同种无耐受性的微。

2、生物之间的差异。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010083186PCT申请的申请数据PCT/EP2009/0006212009013087PCT申请的公布数据WO2009/095258EN2009080651INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书38页CN101965408A1/2页21用于检测生物样品中预定微生物的抗生素耐受性的方法，包括下列步骤A提供经标记的抗生素，B使所述经标记的抗生素与含所述微生物的生物样品在允许所述经标记的抗生素与所述微生物中的其结合位点相结合的条件下接触，C检测所述微生物中的所述经标记的抗生素，及D鉴定所述可检测。

3、的标记物的量随着所述非耐受形式的预定微生物中的所述可检测标记物的量而改变的微生物，其中步骤D中鉴定的微生物是对所述抗生素耐受的微生物。2权利要求1的方法，其中所述抗生素选自氨基糖苷类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、单菌胺类、内酰胺抗生素类、喹诺酮类、杆菌肽、磺胺类、四环素类、链阳菌素类、氯霉素、克林霉素、和林肯胺。3权利要求1或2的方法，其中所述抗生素经发光标记基团，尤其经荧光标记基团标记。4以上权利要求中任一项的方法，其中所述结合位点位于细胞腔内，细胞质中，细胞壁中，或/和分泌的蛋白中。5以上权利要求中任一项的方法，其中所述抗生素是内酰胺抗生素。6权利要求5的方法，。

4、其中所述内酰胺抗生素与PBP2结合蛋白结合。7以上权利要求中任一项的方法，其中步骤C中的所述标记物通过表面荧光显微镜检、流式细胞术、激光扫描装置、时间分辨荧光测定、发光检测、同位素检测、高频谱成像扫描仪、表面等离子体共振或其他基于EVANSCESENCE的读取技术检测。8以上权利要求中任一项的方法，其中所述预定微生物在所述生物样品中鉴定。9权利要求8的方法，其中所述预定微生物通过能够与所述微生物中的核酸在原位条件下特异性杂交的经标记的核酸鉴定。10权利要求8或9的方法，其中所述预定微生物通过FISH鉴定。11权利要求810中任一项的方法，其中所述预定微生物在步骤C中鉴定。12权利要求811中任。

5、一项的方法，其中所述微生物的鉴定和所述微生物中所述经标记的抗生素的检测同时进行。13权利要求812中任一项的方法，其中所述微生物通过表面荧光显微镜检、流式细胞术、激光扫描装置、时间分辨荧光测定、发光检测、同位素检测、高频谱成像扫描仪、表面等离子体共振或其他基于EVANSCESENCE的读取技术检测。14以上权利要求中任一项的方法，其中微生物选自细菌，酵母和霉菌，尤其选自革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。15以上权利要求中任一项的方法，其中所述微生物是通过表2中的所述制剂革兰氏阳性穿孔缓冲液穿孔的革兰氏阳性细菌。16以上权利要求中任一项的方法，其中所述微生物是通过表2中的所述制剂酵母穿孔缓冲液穿孔的酵。

6、母或霉菌。17权利要求913中任一项的方法，其中随通过结合经标记的内酰胺抗生素来检测所述青霉素结合蛋白2的表达，同时通过原位杂交鉴定甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌MRSA。权利要求书CN101965407ACN101965408A2/2页318权利要求913中任一项的方法，其中随通过结合经标记的克林霉素或甲氧苄啶磺胺的各自能力区分医院和社区获得的MRSA，同时通过原位杂交鉴定甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌MRSA。19权利要求913中任一项的方法，其中随结合经标记的万古霉素的能力，同时通过原位杂交鉴定万古霉素耐受型金黄色葡萄球菌VRSA。20权利要求913中任一项的方法，其中随结合经标记的万古霉素。

7、的能力，同时通过原位杂交鉴定万古霉素耐受型葡萄球菌VRS。21权利要求913中任一项的方法，其中随结合经标记的万古霉素的能力，同时通过原位杂交鉴定万古霉素耐受型肠球菌VRE。22权利要求813中任一项的方法，其中所述内酰胺酶ESBL分泌所致的针对内酰胺抗生素的耐受性通过以下检测通过结合经标记的克拉维酸揭示所述酶的存在，及革兰氏阴性微生物的鉴定。23权利要求813中任一项的方法，其中金属内酰胺酶MBL分泌所致的针对内酰胺抗生素的耐受性通过以下检测通过结合经标记的亚胺培南揭示所述酶的存在，及革兰氏阴性微生物的鉴定。24权利要求813中任一项的方法，其中针对大环内酯类、林肯胺和链阳菌素MLS的耐受性。

8、通过以下检测经标记的红霉素或/和克林霉素的结合，及链球菌的鉴定。25权利要求813中任一项的方法，其中药物耐受型肺炎链球菌DRSP通过以下鉴定FISH，及针对内酰胺和大环内酯类的各自耐受性。26权利要求813中任一项的方法，其中高水平的氨基糖苷耐受型肠球菌HLAR通过FISH和经标记的庆大霉素检测。27以上权利要求中任一项的方法，其是诊断方法。28适于检测预定微生物的抗生素耐受性的试剂盒，其含A经标记的抗生素、和B任选的探针，其适于所述生物样品中所述微生物的鉴定。29经标记的抗生素用于检测生物样品中预定微生物的抗生素耐受性的用途。权利要求书CN101965407ACN101965408A1/3。

9、8页4使用经标记的抗生素鉴定抗生素耐受性0001本发明的主题为检测微生物的抗生素耐受性的方法。0002常规诊断方法中的微生物表征包括确定其种，及其对抗生素的敏感性。为实现这点，需将微生物自其环境中分离，并于选择性环境富集，以便分离鉴定ID以及进行抗生素敏感性测试AST。当前对微生物的AST/ID主要通过对其是否存在或缺少一系列生物化学特性以及在抗生素存在下不能生长进行鉴定而实现。或可自样品中提取DNA，使用基因扩增技术检测经合并的DNA中特定序列的存在/缺失情况。这可告知样品中存在生物体。同样的，可对样品中编码抗生素耐受性的基因的存在情况进行检测。根据定义，直接自样品中提取DNA可从未知的细胞。

10、混合物中得到合并的DNA。仅当自纯集落提取DNA时，方可得到明确的结果。0003金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS为最常见的基于医院或社区感染的病因，引发具有高发病率和高死亡率的疾病。由于甲氧西林或类似物被认为是治疗葡萄球菌感染的首选，近些年，显示对甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌MRSA的耐受的细菌株数量的增长已成为一项严峻的临床及流行病学问题。对该抗生素的耐受意味着对所有内酰胺抗生素耐受。由于上述的这些原因，准确而迅速地检测甲氧西林耐受性，对确保感染的患者的正确的抗生素治疗以及控制医院环境中的MRSA单离物以避免其扩散是关键的。0004MRSA株具有MECA基因，其编码与甲。

11、氧西林及所有内酰胺抗生素亲和性低的经修饰PBP2蛋白PBP2或PBP2A。甲氧西林耐受性的表型表达可根据金黄色葡萄球菌的生长条件如温度或培养基渗透压而改变。而这可影响用于检测甲氧西林耐受性的方法的准确度1。杂耐受性的细菌株可发展成为全耐受性株，且可在接受内酰胺抗生素的患者体内被筛选，导致治疗失败。因此，从临床的观点看，应将它考虑为全耐受的。0005已存在几种检测甲氧西林耐受性的方法1，9，包括测定最低抑菌浓度MIC盘扩散、E试验、或肉汤稀释的经典方法，使用含苯唑西林的固体培养基的筛选技术，以及检测MECA基因或其蛋白产物PBP2蛋白的方法3，4。MECA基因的检测可被作为测定甲氧西林耐受性的参。

12、照方法1。但是世界上很多实验室并不具备所需资金，能力或有经验的工作人员来提供检测MRSA单离物的分子试验。因此需将更实用的筛选方法并入常规临床实践中。此外，抗生素耐受性的存在具有几种水平的其关联性，其全部具有临床意义。00061存在提供耐受性的基因，如MECA、MEFE，00072存在抑制上述耐受性机制的表型表达的阻遏物基因，如，MECA阻遏物，00083多重耐受性机制如通过核糖体结合位点的修饰的大环内酯耐受性以及存在外排机制00094通过作为表型可检测的转录及翻译调控的上述耐受性机制的表达水平。0010当前的培养技术需要离散集落的单离及随后鉴定和耐受性测试，假定单集落源于单个细胞，则其可由此。

13、被视为是纯的。然而事实上，无法确保自病原体通常存活于生物膜群落中的临床样品产生纯集落。同样，使用扩增技术对来自多个细胞的核酸序列提取及扩增，且可因此呈现出假阳性的结果。仅当在单个细胞执行并读取鉴定和耐受性的信息时，方可对该侵入的病原体正确描绘。说明书CN101965407ACN101965408A2/38页50011众多抗生素携带有伯氨基。在技术领域中众所周知的，如异硫氰酸荧光素FITC，荧光素N羟基琥珀酰亚胺酯的试剂均易与上述伯胺基反应。0012随着抗生素耐受性在社区及卫生保健系统中传播速度的不断加快，分子生物学的测定精度与速度显得尤为重要。然而，这些实验的复杂性以及花费限制了其在常规测试环。

14、境中更广泛的应用。0013考虑到在生物样品中鉴定微生物及其潜在的抗生素耐受性的困难，希望可在无需培养及扩增的情况下，直接自样品中快速识别病原体，还能检测或排除对所选抗生素的耐受性的存在。0014本发明意图提供能在细胞水平上同时实现鉴定与耐受性检测的解决方案。其减少了试验的复杂性，并可对单独的细胞均做出明确的表型判断。该试验被设计为旨在减少允许筛选程序就例如MRSA而对新来的患者进行筛选的操作以及周转时间。0015本发明的第一方面为用于检测生物样品中预定微生物的抗生素耐受性的方法。包括下列步骤0016A提供经记的抗生素，0017B使所述经标记的抗生素与含所述微生物的生物样品在允许所述经标记的抗生。

15、素与所述微生物中的其结合位点相结合的条件下接触，0018C检测所述微生物中的所述经标记的抗生素，及0019D鉴定所述可检测的标记物的量随着所述非耐受形式的预定微生物中的所述可检测标记物的量而改变的微生物。0020其中步骤D中鉴定的微生物是对所述抗生素耐受的微生物。0021本方法的基本原理为如果生物体对抗生素敏感或耐受，其将显著不同于与其耐受性或敏感性对应生物体。抗生素可与在细胞腔、细胞质、细胞壁或如内酰胺酶的分泌出的蛋白中任意处的其相应结合位点相结合。依靠其耐受性机制，耐受型生物通常因与例如核糖体或青霉素结合蛋白亲和力下降，表现出对抗生素的亲和力下降或无亲和力。相反的，如果耐受性机制为将抗生素。

16、吸收/吸附到胞外膜，耐受型生物将显示出高度增强的荧光。0022所述生物样品可以是生物学来源的任何疑似含有抗生素耐受型微生物的样品，如临床或食物样品。该微生物可选自细菌、酵母及霉菌，特别是选自革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。0023所述预定微生物优选选自葡萄球菌STAPHYLOCOCCUS、肠球菌ENTEROCOCCUS以及链球菌STREPTOCOCCUS。0024所述预定微生物更优选选自甲氧西林耐受型葡萄球菌、万古霉素耐受型葡萄球菌、万古霉素耐受型肠球菌、以及高水平氨基糖苷耐受型肠球菌。0025微生物可再更优选选自金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌MRSA、万古霉素耐受型金黄色葡萄球菌VR。

17、SA、万古霉素耐受型葡萄球菌VRS、万古霉素耐受型肠球菌VRE、肺炎链球菌、药物耐受型肺炎链球菌DRSP和氨基糖苷耐受型肠球菌HLAR。0026步骤A中提供的抗生素可以为任何抗生素。所述抗生素优选选自氨基糖苷类、碳头孢烯类、碳青霉烯类、头孢菌素类、糖肽类、大环内酯类、单菌胺类、内酰胺抗生素说明书CN101965407ACN101965408A3/38页6类、喹诺酮类、杆菌肽、磺胺类、四环素类、链阳菌素类、氯霉素、克林霉素以及林肯胺。0027所述抗生素更优选选自内酰胺抗生素类、大环内酯类、林肯胺以及链阳菌素类。0028所述抗生素再更优选选自阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素、。

18、妥布霉素、氯碳头孢、厄他培南、亚胺培南、西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢他啶、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢磺啶、头孢吡肟、替考拉宁、万古霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、氨曲南、阿莫西林、氨苄西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、二氯唑西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、青霉素、哌拉西林、替卡西林、杆菌肽、粘菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、磺胺米隆、。

19、百浪多息、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、磺胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶、甲氧苄啶磺胺、磺胺甲噁唑、磺胺甲基异噁唑、地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯霉素、克林霉素、乙胺丁醇、磷霉素、呋喃唑酮、异烟肼、利奈唑胺、甲硝唑、莫匹罗星、呋喃妥因、平板霉素、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普汀、利福平、大观霉素、两性霉素B、氟康唑、氟嘧啶、庆大霉素、和克拉维酸。0029所述抗生素最优选选自万古霉素、甲氧西林、克林霉素、甲氧苄啶磺胺、庆大霉素、和克拉维酸。0030出人意料的是，用标记基团修饰抗生素不阻碍抗生素与微生物中的其结合位点的结合。0031优选使用发光标记基团对抗生素进行标记。许多适于本发明。

20、中的标记基团的荧光团可使用。可选择标记基团以适用于市场中已有滤器。抗生素可使用任何可在微生物中检测到的适宜标记基团进行标记。标记基团优选为荧光标记基团。标记基团更优选选自荧光素以及ATTO495NSI。0032标记基团可被偶联到抗生素功能基团。众多抗生素带有伯氨基。例如荧光化合物如异硫氰酸荧光素FITC、荧光素N羟基琥珀酰亚胺酯可与抗生素的氨基反应，得到经荧光素标记的抗生素。其它抗生素如克林霉素携带有可与标记基团相偶联的硫代甲基。在一定条件下，克林霉素的甲基被间隔分子温和取代而形成二硫键。0033标记基团可通过间隔物与抗生素连接。在技术领域已有很多熟知的间隔物，并且均可使用。通过本领域熟知的蛋。

21、白质化学技术，连接间隔物，紧接着连接荧光团的许多方法是可行的。在一个优选的实施方式中，选择伯氨基基团易于被荧光团标记的半胱氨酸。在技术领域中熟知的具有更长碳骨架及其它反应基团的分子也可被选择作为荧光团与抗生素物质之间的连接物/间隔物。0034一系列经连接或未连接间隔物的荧光团修饰的抗生素列于表1。抗生素特别是表1中的优选使用荧光素或ATTO495NSI标记。0035为组合鉴定及耐受性状态，允许经标记抗生素与其在步骤B中微生物内结合位点结合的条件，可能涉及到不被原位杂交过程抑制的结合试验，使单个细胞及细胞群体中的鉴定及耐受性状态二者的同时或陆续测定。0036葡萄球菌中优选的结合位点为由MECA基。

22、因编码的PBP2蛋白青霉素结合蛋白。说明书CN101965407ACN101965408A4/38页7在葡萄球菌对内酰胺抗生素的耐受性中，MECA基因编码与甲氧西林以及所有内酰胺抗生素具有低亲和力的经修饰的PBP2蛋白PBP2或PBP2A。因此，在一个更优选的实施方式中，微生物是MRSA株，其带有编码对甲氧西林及所有内酰胺抗生素具有低亲和力的经修饰PBP2蛋白PBP2或PBP2A的MECA基因，且抗生素为内酰胺抗生素。0037一个更优选的应用为确定由23S核糖体RNA中的点突变所致的耐受性。不同位置的点突变会诱发对一系列抗生素的耐受性，所述抗生素如大环内酯类，酮内酯类，四环素，噻唑抗生素类，林。

23、肯胺，氯霉素，链阳菌素，AMECITIN，茴香霉素，稀疏霉素和嘌呤霉素。各点突变的详细的效果列于表3。在23SRRNA不同位置的点突变可产生异表型。其需要一系列寡核苷酸探针来覆盖所有的可能性。本发明提供了经济而高效率的无需考虑突变位置而检测抗生素耐受性的方法。0038另一个优选的应用为对万古霉素与金黄色葡萄球菌的固定于细胞壁肽聚糖的表面蛋白结合情况的检测。万古霉素耐受型葡萄球菌以使得万古霉素失效的程度与抗生素结合。经标记的万古霉素因此将更优选与耐受生物体相结合。0039在本发明中，微生物内可检测标记物的量对应于抗生素标记基团的信号。可检测标记物的量可与获自标记基团的信号成正比。0040本发明的。

24、方法包括如下步骤去除已经从抗生素切割下的标记基团，或/及去除未与微生物结合的经标记的抗生素。该步骤可提升信噪比。0041在本发明方法的步骤C中，标记物可通过本领域已知的任何适宜方法检测。对该实验的读取需要细至单个细胞的分辨率。标记物优选通过表面荧光显微镜、流式细胞仪、激光扫描装置、时间分辨荧光光度法、发光检测、同位素检测、高频谱成像扫描仪、表面等离子体共振及/或其它基于EVANSCESENCE的读取技术来检测。0042在本发明方法的步骤D中，可检测标记物量的改变可以是可检测标记物的增加或可检测标记物的减少。在本发明的方法中，待检测的抗生素耐受性通过在步骤A中提供经标记的抗生素来预定。表4显示了。

25、临床有关微生物中常见抗生素耐受性机制。从特定的预定微生物的耐受性机制中如表4中所示，可以推出何种微生物/抗生素耐受性的组合预期在抗生素耐受性细胞中显示出升高量的可检测标记物，及何种组合则会显示出降低量的可检测标记物。例如，在耐受内酰胺抗生素或大环内酯类的微生物如MSRA、ORSA等中预期可检测标记物量的减少。在VRSA中预期可检测标记物量的升高。由于不同于在VRSA中的耐受性机制，在万古霉素耐受型肠球菌中预期可检测标记物量的减少。更多的细节见表4。0043在本发明中，非耐受形式的预定微生物可作为测定可检测标记物的量是否改变减少或增加的参照。可将非耐受形式的预定微生物加入到样品中或以分离的制剂提。

26、供。非耐受形式的预定微生物可携带至少一种其它标记物。只要适于分辨抗生素标记物或/及其它存在于本发明的试验中的微生物，可使用本文所述的任何标记物。非耐受形式的预定微生物中可检测标记物量也可以微生物、抗生素、标记基团的一种或多种组合的可检测标记物的量的比值或范围的形式例如以数据表中的形式提供。特别是，本发明的试剂盒可含上述非耐受形式的预定微生物或/及上述数据表。0044本发明的方法还使用耐受形式的预定微生物作为另一对照，或是微生物、抗生素和标记基团的一种或多种组合的耐受形式的预定微生物中可检测标记物的量的比值或范说明书CN101965407ACN101965408A5/38页8围的形式例如以数据表。

27、中的形式。耐受形式的预定微生物可携带至少一种其他标记物。只要适于分辨抗生素标记物或/及其它存在于本发明试验中的微生物，可使用本文所述的任何标记物。特别是，本发明的试剂盒可含上述耐受形式的预定微生物或/及上述数据表。0045可检测标记物量的减少可以是非耐受形式的预定微生物中可检测标记物量的至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、或至少90。特别是，待鉴定的微生物可为基本上未携带所述标记物的微生物。0046可检测标记物量的增加可以是非耐受形式的预定微生物中可检测标记物量的至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至。

28、少80、至少90、至少100、至少150、或至少200。0047在本发明另一个实施方式中，所述方法包括鉴定生物样品中的微生物。本发明中的“鉴定”指鉴定单个微生物细胞为属于特定的分类范畴，如种、属、科、钢或/及目等。鉴定可基于形态学或/和生物化学分类进行。0048可采用探针来对微生物进行鉴定。优选使用能在原位条件下与微生物中的核酸特异性杂交的经标记核酸特别是经标记的寡核苷酸来鉴定预定微生物。所述经标记的寡核苷酸长度可达50个核苷酸。更优选使用荧光原位杂交FISH来对所述微生物进行鉴定。这些优选以及更优选的实施方式允许在分子水平上检测抗生素表型，同时保持原位杂交条件，以允许在同一细胞甚至是混合群中。

29、，通过原位杂交同时和明确鉴定，及抗生素耐受性表型的鉴定。0049可如专利申请EP060212677中所述应用原位杂交规程，所述文献通过引文并入本文。与经标记的抗生素的温育可在低于杂交探针的TM的温度下进行。在一个优选的实施方式中，所述温度在约25和约65之间，在更优选的实施方式中，温度在约35和约59之间。在更进一步的优选中，温度为约52。温育时间优选在约1分钟和约30分钟之间。在更优选的实施方式中，进行温育约15分钟。在温育后，玻片可浸泡于50乙醇中，之后浸没于纯乙醇中。两步骤均可进行约1分钟和约10分钟之间。优选的温育时间在约2分钟和约6分钟之间。更优选温育约4分钟。玻片随后可风干如置于热。

30、板上，而可将细胞包埋于平衡盐包埋培养基中。0050可通过本领域已知的任何适宜方法对微生物进行检测。对试验的读取需细至单个细胞的分别率。特别是，微生物通过表面荧光显微镜、流式细胞仪、激光扫描装置、时间分辨荧光光度法、发光检测、同位素检测、高频谱成像扫描仪、表面等离子体共振或/及其它基于EVANSCESENCE的读取技术进行检测。0051优选组合原位杂交与抗生素耐受性的检测。更优选组合FISH与抗生素耐受性的检测。0052还优选在本发明方法的步骤C中鉴定预定微生物。0053优选相继进行对微生物的鉴定以及对微生物中经标记抗生素的检测。0054在一个替代性优选实施方式中，对微生物的鉴定以及对微生物中经。

31、标记抗生素的检测同时进行。在本实施方式中，经标记的抗生素被加入到杂交缓冲液中。经过温育，如本文所述进行其它处理以对微生物进行检测。原位杂交和FISH最优选分别与抗生素耐受性检测同时进行。0055可优选将相同的检测方法如表面荧光显微镜、流式细胞仪，激光扫描装置或其说明书CN101965407ACN101965408A6/38页9它本文所述的方法应用于鉴定微生物以及检测微生物中的经标记的抗生素。0056原位杂交以及酶或受体试验通常要求本领域现状的各自试验的特殊环境。因此，令人惊奇的可能实现下列各项00571制备具有足以允许长达50聚体的寡核苷酸穿过的尺寸的孔的原位杂交用细胞00582使膜蛋白可接近。

32、经标记的抗生素00593保持上述蛋白和核糖体二者的完整性，以使经荧光团标记的抗生素特异性结合00604找到充足的结合位点以产生在表面荧光显微镜中可见的信号，特别是在同一的条件下。0061优选在本发明的方法中使用具有在预定波长范围发射的荧光团的寡核苷酸，及使用另一种在波长范围发射的荧光团标记的抗生素，两种荧光团可通过发光检测分辨。例如，荧光团之一例如荧光素可发射绿色信号，而另一种荧光团可发射红色信号。经荧光团修饰的抗生素的列表列于表I。0062在最优选的实施方式中，分发明的方法包括使用原位杂交鉴定甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌MRSA，并同时通过与经标记的内酰胺抗生素结合检测青霉素结合蛋白2的表达。

33、。0063在MRSA的一个例子中，甚至可通过分析其对克林霉素或甲氧苄啶磺胺的敏感性来区分在医院以及在社区获得的MRSA。获自社区的甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌株保持了其对克林霉素或对甲氧苄啶磺胺的敏感性。然后通过各自结合能力特征进行区分。在另一个最优选的实施方式中，本发明的方法因此包括通过原位杂交对甲氧西林耐受型金黄色葡萄球菌MRSA进行鉴定，同时通过对其与经标记的克林霉素或甲氧苄啶磺胺结合的各自能力，对医院以及社区获得的MRSA进行区分。0064在另一个最优选实施方式中，本发明的方法包括通过原位杂交对万古霉素耐受型金黄色葡萄球菌VRSA进行鉴定，同时检验其与经标记的万古霉素结合的能力。006。

34、5在另一个最优选实施方式中，本发明的方法包括通过原位杂交鉴定万古霉素耐受型葡萄球菌VRS，同时检测与经标记的万古霉素结合的能力。0066在另一个最优选实施方式中，本发明的方法包括通过原位杂交鉴定万古霉素耐受型肠球菌VRE，同时检测与经标记的万古霉素结合的能力。0067在另一个最优选实施方式中，本发明的方法包括对由于分泌内酰胺酶ESBL获得的内酰胺抗生素耐受的检测，其通过与经标记的克拉维酸结合来显示所述酶的存在情况；以及对革兰氏阴性微生物的鉴定。0068克拉维酸为内酰胺酶抑制剂，有时与青霉素类抗生素组合，以克服某些类型的抗生素耐受性。特别是，其用于克服分泌可使大部分青霉素失效的内酰胺酶的细菌的耐。

35、受性。最常见将钾盐克拉维酸钾与阿莫西林相组合。克拉维酸是内酰胺抗生素的竞争性抑制剂，当使用荧光团对其进行标记时，其可检测内酰胺酶的存在情况。0069在另一个最优选实施方式中，本发明方法包括对由于分泌金属内酰胺酶MBL所致的内酰胺抗生素耐受性的检测，其通过与经标记的亚胺培南结合来显示所述酶的存在情况；以及对革兰氏阴性微生物的鉴定。0070在另一个最优选的实施方式中，本发明的方法包括通过经标记的红霉素或/及克林霉素的结合情况对大环内酯类、林肯胺以及链阳菌素MLS的耐受性进行检测；以及说明书CN101965407ACN101965408A7/38页10对链球菌进行鉴定。0071在另一个最优选的实施方。

36、式中，本发明的方法包括使用FISH对药物耐受型肺炎链球菌DRSP进行鉴定；以及分别对内酰胺类及大环内酯类的耐受性进行鉴定。0072在另一个最优选的实施方式中，本发明的方法包括通过FISH对高水平氨基糖苷耐受型肠球菌HLAR进行检测；以及对经标记的庆大霉素进行检测。0073生物样品包括预定微生物，并可经预处理，以促进经标记的抗生素的结合，及任选的微生物鉴定。0074生物样品可根据其指定的探针用与检测微生物的经标记的抗生素以及任选的探针热固定在玻片上，例如，在约45约65，优选在50约55，更优选为52。0075如果微生物为革兰氏阳性菌，其可被适宜的缓冲液穿孔。革兰氏阳性细胞可使用细菌素或/及洗涤。

37、剂穿孔。在一个优选的实施方式中，抗生素与生物学洗涤剂相组合，而在一个特别优选的实施方式中，乳链球菌素与皂苷相结合。此外，还可使用例如溶菌酶和溶葡萄球菌酶的裂解酶。可将裂解酶平衡进等式中。如果样品经乙醇处理，活性成分的浓度可被乙醇中的后续处理平衡。在更优选的实施方式中，溶菌酶、溶葡萄球菌酶、乳链球菌素和皂苷被平衡以覆盖除分枝杆菌MYCOBACTERIA外的所有革兰氏阳性生物。0076最优选的革兰氏阳性菌穿孔缓冲液的例子见表2。认为各种量和浓度，以及应用温度及温育时间在本领域技术人员的能力范围内。0077如果微生物为酵母或霉菌，其可被适宜的缓冲液穿孔。令人意外的发现，在依照本领域熟知的方法处理时，。

38、酵母及霉菌的细胞壁未形成可重现的微孔。这些方法频繁地呈现出假阳性及假阴性结果两者。可靠的溶液为含有肽抗生素、洗涤剂，络合剂和还原剂的组合的优选缓冲液。更优选的缓冲液包括可产生特定渗透压的一价盐，细菌素的组合，生物和人工洗涤剂、二价阳离子络合剂，和能减少二硫键的试剂的组合。通过加入特异于原核生物的蛋白水解酶，可得到了更令人意外的改进。在再更优选的缓冲液中，将皂苷、SDS、乳链球菌素、EDTA、DTT与溶菌酶及盐以例如约150MM约250MM的浓度，更优选为约200MM230MM，最优选为约215MM的浓度相组合。0078最优选的酵母穿孔缓冲液的例子列于表2。认为各种量和浓度，以及应用温度及温育在。

39、本领域技术人员的能力范围内。0079在另一个优选的实施方式中，本发明的方法为诊断方法。0080本发明的另一方面为适用于检测预定微生物的抗生素耐受性的试剂盒。其含0081A经标记的抗生素，及0082B任选的探针，其适于所述生物样品中所述微生物的鉴定。0083本发明的试剂盒适用于本发明的方法。经标记的抗生素为本发明的方法中本文所述的经标记的抗生素。0084探针可以是任何适用于鉴定微生物的探针。探针优选为经标记的核酸，特别是经标记的寡核苷酸，其能在原位条件下与微生物中的核酸进行特异性杂交。该寡核苷酸长度可达50个核苷酸。0085如以上所表述的，该试剂盒还可包含其它成分，如提供有关微生物、抗生素及标记。

40、物的至少一种组合中可检测标记物量的信息的数据表；或非耐受或/和耐受形式的预定微生物样品，如用作对照。说明书CN101965407ACN101965408A8/38页110086本发明的另一方面为经标记的抗生素用于检测生物样品中预定微生物的抗生素耐受性的用途。0087本发明通过如下的实施例及表格进行进一步的描述。0088表1描述了适用于本发明的方法的抗生素以及标记的例子。0089表2描述了本发明中使用的穿孔缓冲液的组成。0090表3由于23SRRNA上的突变引起的抗生素耐受性。0091表4微生物中的抗生素耐受性机制以及在耐受性微生物中经标记的抗生素量的改变。0092实施方式0093实施方式100。

41、94表1中的抗生素使用FITC进行标记，并按照本领域熟知的技术进行纯化。通过SS键使用半胱氨酸取代与XS连接的甲基来修饰克林霉素。连接的半胱氨酸随后经N羟基琥珀酰亚胺酯或FITC使用荧光胺进行标记，并使用本领域熟知的方法进行纯化。0095实施方式20096抗生素的耐受性，如青霉素耐受性可通过以下规程进行检测，包括如下步骤00971将生物样品涂布于玻片，如10L00982干燥，如在5200993加入穿孔缓冲液，如10L01004干燥01015加入复原的探针混合物如9L01026加入抗生素如，FITC青霉素01037温育，如在52，15分钟01048ETOH/STOP混合物如，5050如，于室温5。

42、分钟01059乙醇，如99乙醇5分钟010610干燥010711平衡盐包埋培养基如，一小滴010812读取0109实施方式30110表4显示了耐受形式的临床相关的微生物的相对于其非耐受形式的可检测的经标记的抗生素量的改变。所述量以携带有荧光标记物的抗生素荧光的改变分别减少及增加表示。0111表10112说明书CN101965407ACN101965408A9/38页120113说明书CN101965407ACN101965408A10/38页130114说明书CN101965407ACN101965408A11/38页140115表20116说明书CN101965407ACN101965408。

43、A12/38页150117表3由于23SRRNA上的突变引起的抗生素耐受列表01180119说明书CN101965407ACN101965408A13/38页160120说明书CN101965407ACN101965408A14/38页170121说明书CN101965407ACN101965408A15/38页1801220123说明书CN101965407ACN101965408A16/38页190124说明书CN101965407ACN101965408A17/38页200125说明书CN101965407ACN101965408A18/38页210126说明书CN101965407AC。

44、N101965408A19/38页220127说明书CN101965407ACN101965408A20/38页230128说明书CN101965407ACN101965408A21/38页2401290130说明书CN101965407ACN101965408A22/38页250131说明书CN101965407ACN101965408A23/38页260132说明书CN101965407ACN101965408A24/38页2701330134说明书CN101965407ACN101965408A25/38页280135说明书CN101965407ACN101965408A26/38页29。

45、01360137说明书CN101965407ACN101965408A27/38页300138说明书CN101965407ACN101965408A28/38页3101390140说明书CN101965407ACN101965408A29/38页3201410142说明书CN101965407ACN101965408A30/38页330143说明书CN101965407ACN101965408A31/38页340144说明书CN101965407ACN101965408A32/38页3501450146说明书CN101965407ACN101965408A33/38页360147说明书CN10。

46、1965407ACN101965408A34/38页370148说明书CN101965407ACN101965408A35/38页380149表40150说明书CN101965407ACN101965408A36/38页390151说明书CN101965407ACN101965408A37/38页400152参考文献01531CHAMBERS，HF1997METHICILLINRESISTANCEINSTAPHYLOCOCCIMOLECULARANDBIOCHEMICALBASISANDCLINICALIMPLICATIONSCLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS10，7817。

47、9101542SWENSON，JM，WILLIAMS，P，KILLGORE，GETAL2001PERFORMANCEOFEIGHTMETHODS，INCLUDINGTWONEWMETHODSFORDETECTIONOFOXACILLINRESISTANCEINACHALLENGESETOFSTAPHYLOCOCCUSAUREUSORGANISMSJOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY39，3785801553VANLEEUWEN，WB，VANPELT，C，LUIJENDIJK，AETAL1999RAPIDDETECTIONOFMETHICILLINRESISTANCEINS。

48、TAPHYLOCOCCUSAUREUSISOLATESBYTHEMRSASCREENLATEXAGGLUTINATIONTESTJOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY37，30293001564LOUIE，L，MAJURY，A，GOODFELLOW，JETAL2001EVALUATIONOFALATEXAGGLUTINATIONTESTMRSASCREENFORDETECTIONOFOXACILLINRESISTANCEINCOAGULASENEGATIVESTAPHYLOCOCCIJOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY39，41495101575SKO。

49、V，R，SMYTH，R，CLAUSEN，METAL2003EVALUATIONOFCEFOXITIN说明书CN101965407ACN101965408A38/38页4130GDISCONISOSENSITESTAGARFORDETECTIONOFMETHICILLINRESISTANTSTAPHYLOCOCCUSAUREUSJOURNALOFANTIMICROBIALCHEMOTHERAPY52，204701586FELTEN，A，GRANDRY，B，LAGRANGE，PHETAL2002EVALUATIONOFTHREETECHNIQUESFORDETECTIONOFLOWLEVELMETHICILLINRESISTANTSAUREUSMRSAADISCDIFFUSIONMETHODWITHCEFOXITINANDMOXALACTAM，THEVITEK2SYSTEM，ANDTHEMRSASCREENLATEXAGGLUTINATIONTESTJOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY40，27667101597CAUWELIER，B，GORDTS，B，DESCHEEMAE。