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1、10申请公布号CN101962689A43申请公布日20110202CN101962689ACN101962689A21申请号201010523637022申请日20101028C12Q1/70200601C12Q1/68200601G01N21/6420060171申请人浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心地址310012浙江省杭州市西湖区文三路2号72发明人张晓峰帅江冰吴姗陈笑梅何永强74专利代理机构浙江翔隆专利事务所33206代理人张建青54发明名称一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法57摘要目前对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫。
2、区的流行情况以阻断该病的传播。本发明公开了一种通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TAQMAN探针；四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测。本发明保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点，四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页CN101962690A1/1页21一种戊型肝炎病毒的。
3、四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TAQMAN探针所述的扩增引物序列为HEVFTATTCATCCAACCAACCCCTT，HEVRGTCDCGCCAAGYGGAGC，该引物为针对不同基因型HEVORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C；所述的TAQMAN探针序列为IPCY5TGTCACCGCTGCGGCCGBHQ3，IIPROXAGACGTTGCCGCTGCGTCCBHQ2，IIIPHEXTTTCACAAYCCGGGGCTGGABHQ1，IVPFAMCGCAT。
4、CTGACATWCCARCCGCBHQ1，四条探针分别针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列中Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G；PCR鉴别检测方法的步骤如下1将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30LDEPC水溶解；2在PCR反应管中配置反应体系，体系的总体积为25L，其组成如下10L荧光定量PCRMIX，12L浓度为10M的HEVF，12L浓度为10M的HEV。
5、R，05L浓度为10M的IP，05L浓度为10M的IIP，05L浓度为10M的IIIP，05L浓度为10M的IVP，8LHEV阳性RNA模板，双蒸水补至25L；3将PCR反应管置于荧光定量PCR仪中，反应条件如下第一阶段42，30MIN；第二阶段95，3MIN；第三阶段95，10S，60，45S，45个循环，并于第三阶段60时同时采集不通通道的荧光信号；4阴性对照CT值应显示为0或400，阳性对照的CT值应300，否则视实验失败，需重做；检测样品CT值350，结果有效，直接报告样品阳性；检测样品350CT值400，需进行一次重复实验，若CT值仍介于350和400之间，且曲线有明显的指数增长特性。
6、，同时阴性对照CT值为零，报告样品阳性，否则报告样品阴性；检测样品CT值为零，报告样品阴性。权利要求书CN101962689ACN101962690A1/7页3一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法技术领域0001本发明属于生物检测技术领域，涉及一种人血清、动物血清及其产品、食品以及环境中通过多重荧光定量PCR鉴别戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法。背景技术0002戊型肝炎HEPATITISE由戊型肝炎病毒HEPATITISEVIRUS，HEV引起，是一种经粪口传播、以黄疸为主的急性传染病，患病孕妇的病死率更可高达21。自1955年印度发生第一次大暴发以来，戊型肝炎已在亚洲、非洲与。
7、拉丁美洲的很多国家广泛流行。近年来该病亦在日本等发达国家散发流行。我国是戊型肝炎高发的国家，新疆、辽宁、山东等省均有大量流行，极大的危害人类健康。有证据显示，戊型肝炎是一种动物源性疾病，被感染的家养或野生动物可直接传播或通过污染水源传播本病。有研究表明，猪源戊型肝炎病毒可以感染恒河猴和黑猩猩等灵长类动物，而人戊型肝炎病毒在实验条件下也能成功感染猪等动物；血清学调查则发现与猪频繁接触的人群如饲养员、兽医、屠工中戊型肝炎病毒的抗体水平明显高于正常人群。日本亦有人因食用了未煮熟的猪肝和鹿肉而引起急性戊肝的报道，提示了猪戊型肝炎病毒在公共卫生和食品安全方面存在的重大意义。0003HEV是无包膜的单股正。
8、链RNA病毒，其基因组长约75KB，有3个开放阅读框。根据HEV各分离株的基因组序列分析，可将其分为4个主要的基因型。I型主要发生于亚非多数国家；II型分离于墨西哥；III型发生于美国和一些欧洲国家；IV型发生于亚洲。其中I型和II型只能感染人，III型和IV型则为人畜共患，可感染人、猪和其它动物。在我国流行的HEV主要为由I型和IV型。但有研究表明，上海地区猪场中已有III型HEV毒株的流行。0004迄今为止，对猪源戊型肝炎尚无有效的疫苗用于预防，采取的控制措施主要是及早发现，并随时监测疫区的流行情况以阻断该病的传播。这就需要建立一种通用的、高度敏感、特异和快速的检测方法用于HEV的诊断。同。
9、时，HEV主要经污染的水源和环境传播，高度敏感的病原检测技术也将有助于分子流行病学调查和病毒溯源。而目前可同时快速鉴定戊型肝炎病毒各个基因型的方法尚无报道。发明内容0005本发明的目的是提供一种戊型肝炎病毒各个基因型的快速检测方法，利用TAQMAN探针技术建立I、II、III和IV型HEV的多重荧光快速分型检测体系，以期填补技术空白。0006为此，本发明采用如下的技术方案一种不同基因型戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法，其特征在于针对HEVORF3序列设计一对保守扩增引物和4条型特异性TAQMAN探针0007所述的扩增引物序列为0008HEVFTATTCATCCAACCAACCCCT。
10、T，0009HEVRGTCDCGCCAAGYGGAGC，说明书CN101962689ACN101962690A2/7页40010该引物为针对不同基因型HEVORF3中的高度保守序列设计，对4种基因型HEV基因组均能扩增，引物序列中D代表碱基A、G或T，Y代表碱基T或C。0011所述的TAQMAN探针序列为0012IPCY5TGTCACCGCTGCGGCCGBHQ3，0013IIPROXAGACGTTGCCGCTGCGTCCBHQ2，0014IIIPHEXTTTCACAAYCCGGGGCTGGABHQ1，0015IVPFAMCGCATCTGACATWCCARCCGCBHQ1，0016四条探针分别。
11、针对各自的ORF3变异区序列设计，为型特异性，能实现不同基因型的鉴别检测；其中，I型HEV探针为CY5标记，II型HEV探针为ROX标记，III型HEV探针为HEX标记，IV型HEV探针为FAM标记；探针序列种Y代表碱基T或C，W代表碱基A或T，R代表碱基A或G。0017PCR鉴别检测方法的步骤如下00181将待测样品、阴性对照以及不同型HEV阳性对照采用TRIZO试剂提取RNA，最后加入30LDEPC水溶解。00192在PCR反应管中按下表所述配置反应体系002000213将PCR反应管置于ABI7500、ROCHELIGHTCYCLER480、QIAGENROTORGENE6000等荧光定。
12、量PCR仪中，并按下述反应条件进行检测0022第一阶段42，30MIN；0023第二阶段95，3MIN；0024第三阶段95，10S，60，45S，45个循环；0025并于第三阶段60时同时采集不通通道的荧光信号。00264阴性对照CT值应显示为0或400，阳性对照的CT值应300，否则视实验失败，需重做。检测样品CT值350，结果有效，可直接报告样品阳性。检测样品350CT值400，需进行一次重复实验，若CT值仍介于350和400之间，且曲线有明显的指数增长特性，同时阴性对照CT值为零，可报告样品阳性，否则报告样品阴性。检测样品CT值为零，报告样品阴性。0027本发明通过对已发表的不同基因型。
13、HEV毒株全序列进行分析后，针对HEVORF3序列设计一对保守引物，能同时扩增不同基因型HEV毒株，进一步针对此扩增区域的变异区设计四条型特异性探针，分别标记有不同的荧光基团，用于对4种不同基因型的一步法鉴说明书CN101962689ACN101962690A3/7页5别诊断。基于TAQMAN探针的荧光定量PCR保留了PCR方法的高灵敏度、高准确度的特点。四重荧光定量PCR提高了检测效率，降低了检测成本，同时实现鉴别诊断的目的，为传染源调查、传播环境、病毒溯源等工作奠定基础。0028下面通过实施例和说明书附图对本发明进行详细描述。附图说明0029图1本发明荧光定量PCR方法敏感性图1A及其标准。
14、曲线分析图1BI型HEV通道，模板浓度依次为2102108拷贝。0030图2本发明荧光定量PCR方法敏感性图2A及其标准曲线分析图2BII型HEV通道，模板浓度依次为2102108拷贝。0031图3本发明荧光定量PCR方法敏感性图3A及其标准曲线分析图3BIII型HEV通道，模板浓度依次为2102108拷贝。0032图4本发明荧光定量PCR方法敏感性图4A及其标准曲线分析图4BIV型HEV通道，模板浓度依次为2102108拷贝。具体实施方式00331材料和方法003411HEV多重荧光定量PCR方法的建立0035111引物及探针的设计合成0036通过已发表的不同基因型HEV毒株全序列进行分析后。
15、，针对HEVORF3序列设计一对保守引物，能同时扩增不同型HEV毒株。同时针对此扩增区域的变异区分别设计四条型特异性探针，分别标记有不同的荧光基团，用于HEV的一步法荧光定量PCR检测表10037表1引物及探针序列00380039A兼并引物中D代表碱基A、G或T；Y代表碱基T或C；W代表碱基A或T；R代表碱基A或G0040112荧光定量PCR反应条件优化0041利用HEV阳性RNA模板作为检测样品，对引物和探针浓度从00506MOL/L进行优化，并对退火温度等反应条件进行优化，筛选出最佳的荧光定量PCR反应条件。0042113荧光定量PCR标准曲线分析及敏感性试验0043将2102108拷贝/。
16、L的四种基因型HEV阳性RNA模板分别混合，进行荧光定量PCR，设3个重复，以确定四重荧光定量PCR方法的标准曲线及其检测限。并与普通套式PCR说明书CN101962689ACN101962690A4/7页6方法的检测灵敏度进行比较优化。0044114干扰性试验0045将四型HEV病毒RNA模板按不同浓度混合，并利用建立的分型体系进行检测，以确定四种病毒的探针、引物之间是否存在相互干扰现象。0046115特异性及重复性试验0047利用本发明建立的荧光定量检测方法，对其它主要的猪传染性病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪瘟病毒CSFV、猪流感病毒SIV等进行检测，以确定该方法的特异性。以1。
17、02106拷贝的标准品进行检测，每个样品3个重复，通过计算标准差SD和变异系数CV来验证荧光定量PCR的批内重复性。同时进行方法的批间重复性分析，即102106拷贝的每个标准品分别检测3次，并计算标准差SD和变异系数CV。004812样品采集和处理0049人或动物血清样本采集后76保存备用，用于HEV核酸的荧光定量PCR检测。环境拭子、产品或猪粪便等样品采集后制成20的悬液W/V，10000R/MIN离心20MIN，小心吸取上清，76保存备用。005013RNA提取及HEV的荧光定量检测0051将样品上清按TRIZOLREAGENT使用说明提取RNA，最后加入30LDEPC水溶解，利用所建立的。
18、荧光定量PCR方法进行HEV的检测。00522结果005321荧光定量PCR反应条件优化0054不同的引物和探针终浓度配比试验结果结合仪器要求，荧光定量PCR反应最佳退火温度为60，最终反应条件为第一阶段42，30MIN；第二阶段95，3MIN；第三阶段95，10S，60，45S，45个循环；并于第三阶段60时同时采集不通通道的荧光信号。20L的反应体系中上下游引物及四种型特异性探针的最适终浓度为分别06MOL/L和025MOL/L。反应体系如下表；0055表2荧光定量PCR反应体系0056005722HEV荧光定量PCR检测方法灵敏度分析0058以10倍系列稀释的四种型HEV阳性RNA混合液。
19、2102108拷贝为模板进行定量扩增并分析其标准曲线图1图4。结果表明本发明的荧光定量方法对于不同基因型的HEV都具有较高的扩增效率97159878。而且该方法对不同基因型模板的检测说明书CN101962689ACN101962690A5/7页7下限均可达102拷贝，具有很高的灵敏度。其对高浓度模板也具有很好的检测效果，表明此方法具有很广的线性范围，适用于临床不同条件、多种样品的检测。而常规套式PCR最低仅能检出含量为51025103的模板，因此荧光定量PCR方法相比于普通PCR，其检测灵敏度要高10100倍。005923抗干扰试验0060将四种基因型HEV模板按不同浓度混合后进行多重荧光定量。
20、PCR检测，不同浓度组合均能同时扩增出四种基因型HEV，不产生干扰。006124荧光定量PCR检测体系的特异性和稳定性0062进一步对该方法的特异性和稳定性进行分析。结果显示猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪瘟病毒CSFV、猪流感病毒SIV等对照在该体系中不同信号通道检测均为阴性，表明该方法特异性强，与其他主要传染性病原无交叉反应性。0063对不同含量的各基因型阳性样品102106拷贝进行荧光定量检测，每个样品3个重复，结果表明各通道检测变异系数CV为004063表3，GREEN通道，具有良好的批内稳定性。同时进行方法的批间重复性分析，即102106拷贝的每个标准品分别检测3次，不同浓度模板。
21、3次试验平均CT值间变异系数介于012和126，说明该方法也具有很高的批间稳定性。0064表3GREEN通道荧光定量PCR体系稳定性分析0065006625不同地区人群及猪群中HEV核酸检测0067利用一步法荧光定量PCR对浙江省内抗体阳性的人血清样本及采集自浙江、上海、江苏等不同地区规模化猪场的样品进行HEV病毒核酸的四重荧光定量检测。其中，77份HEV抗体阳性的人血清样本仅有2份为IV型HEV核酸阳性，阳性率为26。而18个不同地区猪场的273份猪粪便样品中有55份检测到IV型HEV核酸阳性率205，一份样品为III型HEV阳性。且所有地区的猪场均能检测到猪HEV核酸，地区覆盖率100，表。
22、明猪HEV已经在规模化猪场中广泛存在。0068序列表0069浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心0070一种戊型肝炎病毒的四重荧光定量PCR鉴别检测方法0071说明书CN101962689ACN101962690A6/7页8007260073PATENTINVERSION33007410075210076DNA0077人工合成00780079PRIMERBIND0080121008110082TATTCATCCAACCAACCCCTT21008320084170085DNA0086人工合成00870088PRIMERBIND0089117009020091GTCDCGCCAAGYGGAGC17。
23、009230093170094DNA0095人工合成00960097PRIMERBIND0098117009930100TGTCACCGCTGCGGCCG17010140102190103DNA0104人工合成01050106PRIMERBIND0107119010840109AGACGTTGCCGCTGCGTCC1901105说明书CN101962689ACN101962690A7/7页90111200112DNA0113人工合成01140115PRIMERBIND0116120011750118TTTCACAAYCCGGGGCTGGA20011960120210121DNA0122人工合成01230124PRIMERBIND0125121012660127CGCATCTGACATWCCARCCGC21说明书CN101962689ACN101962690A1/4页10图1A图1B说明书附图CN101962689ACN101962690A2/4页11图2A图2B说明书附图CN101962689ACN101962690A3/4页12图3A图3B说明书附图CN101962689ACN101962690A4/4页13图4A图4B说明书附图CN101962689A。