利用红曲霉生产酯化酶粗酶制剂的方法 所属技术领域
本发明涉及一种粗酶制剂的制备方法，尤其是利用高产酯化酶红曲霉菌株采用固态发酵工艺生产酯化酶粗酶制剂的方法。所属领域为微生物发酵技术。
背景技术
浓香型白酒是我国白酒十二大香型中产量最大、分布面最广、生产厂家最多、市场覆盖最广的一类白酒，在国民经济和人们日常生活中占有重要的地位。目前，优质浓香型白酒的生产还存在生产周期长、优级品率低等问题，严重制约了浓香型白酒企业的发展。主要原因之一为浓香型白酒主要香味物质己酸乙酯的形成速度慢且最终含量低。目前生产上提高己酸乙酯含量的方法主要是己酸菌灌窖法，该法效果甚微，因为己酸菌主要作用是产生己酸，酯化作用弱，将己酸转化成己酸乙酯的能力差。因此使用催化剂催化己酸和乙醇生成己酸乙酯是提高浓香型白酒的质量和缩短生产周期的主要措施之一。研究发现细菌、酵母、霉菌中的很多菌株都能合成能催化短链脂肪酸和乙醇酯化的脂肪酶，这类微生物被酿酒行业统称为酯化菌，但是适合酿酒生产的酯化菌并不多。
红曲霉是我国传统的药用真菌，将其接种于大米经发酵制备而成的红曲是一种食疗兼备的传统中药，具有活血化瘀健脾消食等功效。研究表明，红曲同时还具有降脂、降压、降糖和抑制肿瘤生长等作用。20世纪60年代初，中国科学院成都生物所发现红曲霉的某些菌株能够使短链脂肪酸和醇生成酯，为红曲在白酒生产上的应用开拓了新途径，是我国白酒工业的一项重大创新。由于红曲霉能够在大曲、制曲作坊、酿酒醪液、糟醅等酿酒场所繁殖生长，因而成为酿酒界研究的热点。近年来国内酒界对红曲霉的研究取得了一定成效，如中国科学院成都生物所分离到泸型酯化菌M101菌株，利用该菌株培养“强化菌曲”，用于发酵产酒，具有较强的生香功能。江苏双洋酒厂分离到一株具有极强产酯能力的红曲霉菌株，该菌株用于浓香型白酒的生产，对提高大曲酒的产量、质量，调整己酸乙酯/乳酸乙酯的比例都有明显效果。
虽然近年酿酒行业在红曲霉菌种的选育方面取得了显著成绩，但红曲霉运用方面还存在技术缺陷与不足。目前利用红曲霉生产酯化酶粗酶制剂的主要工艺以麸皮为原料，浅盘固态发酵制备麸曲。因麸皮营养丰富，适宜众多微生物生长，而红曲霉与其它霉菌相比生长缓慢，导致该工艺容易被污染，对场地和操作要求严格，规模化生产污染风险大。大米是红曲霉生长的天然培养基，红曲霉在大米基质上生长，竞争优势明显，不易污染，但采用以大米为原料的红曲生产的传统工艺生产红曲酯化酶粗酶制剂也存在缺陷，主要表现为：传统工艺以整粒大米为原料，红曲霉与基质接触面小，菌丝往基质内生长渗透速度慢，导致发酵周期长(一般在10天以上)；工艺过程复杂繁琐，耗时(要经浸泡，沥干，蒸熟，冷却打散等前处理工序)；工艺关键点的控制对工人经验要求高，实施难度大(如大米浸泡，蒸熟等都要恰到好处)。
【发明内容】
为了克服现有红曲酯化酶粗酶制剂生产工艺易污染，发酵周期长，工艺过程复杂繁琐，关键点控制难的缺陷和不足，本发明提供了一种利用红曲霉生产酯化酶粗酶制剂的方法，该方法以高产酯化酶红曲霉菌株为生产菌株，以大米粉、黄豆粉、乳酸或黄水为主料，以稻壳为辅料，采用固态发酵工艺生产酒用酯化酶粗酶制剂，该法生产出的酯化酶粗酶制剂的酯化力达(80-160)mg/100ml·7day。该方法工艺简单，易操作，不易污染，对场地要求不高，而且能显著缩短发酵周期(可缩短到5天)。
技术方案：将大米粉碎成粉状作碳源，黄豆粉补充氮源，用量为大米粉质量的3％-7％，用乳酸或黄水调节PH值，乳酸用量为大米粉质量的0.5％-1％，黄水为大米粉质量的19％--27％，以稻壳为支持辅料，起蓬松透气供氧的作用，弥补大米粉遇水成团，透气性变差，供氧不足而导致红曲霉不能生长的缺陷，其用量为大米粉质量的40％-50％。可采用三角瓶固态发酵模式或浅盘固态发酵模式进行培养。当采用三角瓶固态发酵时，在上面所述的物料中加入大米粉质量的80％的水，充分拌匀，分装到三角瓶中(装瓶量为90g/500ml-100g/500ml三角瓶或200g/1000ml-220g/1000ml三角瓶)，高压灭菌(121℃)30分钟，呈热打散，冷却到40℃左右时，接入10ml红曲霉菌液，摇匀，在34℃下恒温培养115-125小时，待整个培养基质长满菌丝，略带红色，到培养终点，收曲于45℃下烘干即为红曲酯化酶粗酶制剂成品；当采用浅盘固态发酵时，加入大米粉质量的120％-150％的水，充分拌匀，用纱布或白布包被基质，高压灭菌(121℃)30分钟，呈热打散，冷却到40℃左右时，接入物料质量的8％-10％的三角瓶二级固态种子，拌匀并摊平到浅盘中，使物料厚度为4cm，在上面覆盖4层湿纱布或2层湿白布，于34℃下恒温培养48小时，降温到32℃，补入物料质量的10％的水，此时所覆盖的纱布或白布已变干，更换成湿纱布或湿白布，继续培养52h-62h，待整个培养基质长满菌丝，略带红色，到培养终点，收曲于45℃下烘干即为红曲酯化酶粗酶制剂成品。
本发明的有益效果是：提供一种利用红曲霉生产酯化酶粗酶制剂的方法，该方法克服了现有工艺以麸皮为原料生产酯化酶粗酶制剂时易污染的缺点，并提高了酯化酶粗酶制剂的酯化力(从40-80mg/100ml·7day提高到80-160mg/100ml·7day)；该方法省去了以大米为原料的生产工艺中润粮(一般需要24小时，使吸水在60％-70％之间)、沥干、蒸熟(要求刚好过心，熟而不腻，较难控制)、培养过程中需要多次补水等繁琐耗时的步骤，并且显著缩短了发酵周期(从10天以上缩短为5天左右)。本发明提供的生产工艺简单，易操作，污染风险小，易规模化生产。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施列1
(1)斜面培养：
斜面培养基：100BX麦芽汁，琼脂3％，PH自然；将红曲霉菌种接种于斜面培养基上，在34℃下培养7天，待菌丝长满试管并产生孢子时备下一步使用。
(2)菌液的制备：
将3支(1)所述地试管种子洗入盛有100ml无菌水的500ml三角瓶中，加入一定量的玻璃珠和1g葡萄糖，在34℃，180r/min的转速下恒温震荡培养24小时，得红曲霉菌液。
(3)三角瓶固态发酵：
固态发酵培养基：大米粉400g，黄豆粉20g，乳酸4ml，稻壳200g，蒸馏水320ml；将大米粉和黄豆粉拌匀后加入稻壳并拌匀。将蒸馏水，乳酸充分混匀后加入上述固体基质中，轻轻搓匀(不能用大力)，让大米粉充分分散到稻壳上并保证物料蓬松。将上述物料平均分装到10个500ml三角瓶中，塞上棉塞，用牛皮纸将棉塞包好，高压(121℃)灭菌30分钟。取出后呈热将成团的基质摇散，待冷却到40℃左右时，每个三角瓶接入10ml(2)所述的菌液，摇匀后，在34℃下恒温培养72小时后扣瓶，继续培养48小时，此时发酵基质长满菌丝，略带红色，到培养终点，收曲于45℃下烘干得红曲酯化酶粗酶制剂成品390g，酯化力为110mg/100ml·7day。
实施列2
(1)斜面培养：
同实施列1。
(2)菌液的制备：
同实施列1。
(3)三角瓶固态种子：
前期操作同实施列1，在34℃下恒温培养约72小时，具体时间依基质生长情况而定，待基质长满白色菌丝，镜检具有大量的分生孢子产生时，此时扣摇使基质尽量分散作种子备浅盘培养使用。
(4)浅盘固态发酵：
固态发酵培养基：大米粉750g，黄豆粉37.5g，黄水180ml，稻壳375g，蒸馏水900ml；将大米粉和黄豆粉拌匀后加入稻壳并拌匀。将蒸馏水，黄水充分混匀后加入上述固体基质中，轻轻搓匀(不能用大力)，让大米粉充分分散到稻壳上并保证物料蓬松。用纱布或白布包被基质，高压灭菌(121℃)30分钟，呈热打散，待冷却到40℃左右时，接入100g(3)所述的三角瓶固态种子(约2瓶500ml三角瓶培养物)拌匀，将物料摊平到浅盘中使其的厚度为4cm，在上面覆盖4层湿纱布或2层湿白布，于34℃下，湿度≥80％的条件下恒温培养48小时，把温度降到32℃，补入物料重量10％的水，此时所覆盖的纱布或白布已变干，更换成湿纱布或湿白布，保持湿度≥90％的条件下继续培养58h，待整个培养基质长满菌丝，略带红色，到培养终点，收曲于45℃下烘干得红曲酯化酶粗酶制剂730g，酯化力为100mg/100ml·7day。