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诱导心肌细胞形成的方法
背景
本领域需要产生用于研究应用以及治疗应用的心肌细胞的方法。
发明概述
本发明提供在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成(cardiomyogenesis)和扩增心脏祖细胞的方法，所述方法通常包括在干细胞或祖细胞中诱导规范(canonical)Wnt信号传导途径。本发明提供由干细胞群或祖细胞群产生心肌细胞群或心脏祖细胞群的方法，所述方法通常包括使所述干细胞或祖细胞接触诱导规范Wnt信号传导的物质。本发明方法可用于产生心肌细胞群或心脏祖细胞群，所述心肌细胞群或心脏祖细胞群可用于研究和治疗应用。
附图简要说明
图1A和1B.图1A描述了组织特异性的无效β-联蛋白和稳定β-联蛋白的产生。图1B描述Nkx2.5-cre、ctnnb1^tm2Kem杂合子和纯合子(左侧)以及野生型和Nkx2.5-cre、β-联蛋白/loxP(ex3)杂合子(右侧)胚胎的心室的Western印迹。
图2描述短尾基因(Brachyury)的表达概况。
图3A和3B描述早期和晚期心脏基因的表达概况。
图4A-E描述规范Wnt信号传导对心脏诱导和ES细胞分化的影响。
图5是显示来自E9.5的对照(Islet1-cre，左)、野生型(Rosa-YFP；Islet1-cre，中)和突变型(Islet1-cre；β-联蛋白(ex3)loxP，右)胚胎的YFP+细胞群的直方图。
图6描述由WT(Rosa-YFP；Islet1-cre，左柱)和Mut(Rosa-YFP；Islet1-cre；β-联蛋白(ex3)loxP，右柱)胚胎分选的YFP+细胞中所示基因的实时定量RT-PCR。
图7描述规范Wnt对人ES细胞的影响。
图8A和8B提供Wnt3a蛋白的氨基酸序列的比对。
图9A-H提供编码β-联蛋白的核苷酸序列的比对。
图10A-C提供β-联蛋白的氨基酸序列的比对。
定义
本文所用术语“干细胞”指可经诱导增殖的未分化细胞。干细胞能够自主维持，这意味着每次细胞分裂后，一个子细胞也是干细胞。干细胞可获自胚胎、新生儿、青少年或成人组织。本文所用术语″祖细胞″指衍生自干细胞而本身不是干细胞的未分化细胞。一些祖细胞可以产生能够分化成一种以上细胞类型的后代。
本文所用术语“治疗”、“治疗的”等指获得所需的药理学和/或生理学作用。从完全或部分防止疾病或其症状方面来说，这种作用可以是预防性的，和/或从部分或完全治愈疾病和/或由该疾病产生的不良影响来说，这种作用可以是治疗性的。本文所用术语“治疗”包括在哺乳动物，特别是人中进行的任何疾病治疗，包括：(a)在可能易患该疾病或症状但尚未诊断患有该疾病的对象中防止该疾病的发生；(b)抑制疾病，即阻滞其发展；和(c)缓解疾病，即引起该疾病消退。
术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于：鼠类(大鼠、小鼠)、非人灵长动物、人、犬、猫、有蹄类(如马、牛、羊、猪、山羊)等。
″治疗有效量″或″有效量″指给予哺乳动物或其它对象治疗疾病时，足以治疗这种疾病的化合物或若干细胞的用量。“治疗有效量”取决于化合物或细胞、疾病和其严重程度、所治疗对象的年龄、体重等。
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于本文所述的具体实施方式，因为它们当然可能变化。应理解，本文所用术语的目的只是描述具体实施方式，不应为限制性，因为本发明范围仅受所附权利要求书的限制。
应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值，以及所述范围的任何其它标称或间插数值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，除非明确地排除所述范围的上下限。所述范围包含一个或两个限值时，除这一个或两个限值以外的范围也包括在本发明范围内。
除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但下面描述了优选的方法和材料。本文所述的所有发表物通过引用纳入本文，以公开或描述与所引用发表物有关联的方法和/或材料。
应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，例如，提到“干细胞”包括多种这类干细胞，提到“心肌细胞”包括本领域技术人员已知的一种或多种心肌细胞和其等同物，等等。还注意到，可设计权利要求书以便排除任何任选元件。同样，这种说明应用作使用这类排除性术语，如“只有”、“仅仅”等以及引用权利要求元件，或使用“负”限制的前提基础。
本文只提供其公开日期早于本申请申请日的发表物。本文中没有任何内容可被解释为承认本发明不早于这篇发表物，而成为已有发明。另外，所提供发表物的日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独验证。
发明详述
本发明提供在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成和扩增心脏祖细胞的方法，所述方法通常包括在干细胞或祖细胞中诱导规范Wnt信号传导途径。本发明提供由干细胞群或祖细胞群产生心肌细胞群或心脏祖细胞群的方法，所述方法通常包括使所述干细胞或祖细胞接触诱导规范Wnt信号传导的物质。本发明方法可用于产生心肌细胞群或心脏祖细胞群，所述心肌细胞群或心脏祖细胞群可用于研究和治疗应用。
诱导心肌细胞形成和心脏祖细胞扩增的方法
本发明提供在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成的方法；和扩增(增加其数量)心脏祖细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法通常包括在干细胞或祖细胞中诱导规范Wnt信号传导途径。在其它实施方式中，所述方法包括在干细胞或祖细胞中提高β-联蛋白的水平。
在一些实施方式中，使用本发明方法时，至少约10％的干细胞群或祖细胞群分化成心肌细胞。例如，在一些实施方式中，约10％-50％的干细胞群或祖细胞群分化成心肌细胞。在其它实施方式中，至少约50％的干细胞群或祖细胞群分化成心肌细胞。例如，在一些实施方式中，约50％-60％、约60％-70％、约70％-80％或约80％-90％，或更多的干细胞群或祖细胞群分化成心肌细胞。
在一些实施方式中，本发明方法使心脏祖细胞数量增加。例如，在一些实施方式中，本发明方法能诱导心脏祖细胞增殖，从而增加心脏祖细胞的数量。因此，例如，在一些实施方式中，本发明方法导致心脏祖细胞数量增加至少约25％、至少约50％、至少约100％(或2倍)、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍或至少约100倍，或更多。
在一些实施方式中，本发明方法能增加来自干细胞群或祖细胞群的搏动胚状体数量，例如，本发明方法可使搏动胚状体数量增加约10％-50％、约50％-100％(或2倍)、约2倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-25倍、约25倍-50倍或约50倍-100倍，或100倍以上。
在一些实施方式中，本发明方法导致表达Isl1(Islet 1)、原肌球蛋白、Nkx2.5、Tbx5、Hand2和肌节基因中一种或多种基因的群体的细胞数量增加。在一些实施方式中，本发明方法导致表达Isl1(Islet 1)、原肌球蛋白、Nkx2.5、Tbx5、Hand2和肌节基因中一种或多种基因的群体的细胞数量增加约10％-50％、约50％-100％(或2倍)、约2倍-5倍、约5倍-10倍、约10倍-25倍、约25倍-50倍或约50倍-100倍，或者100倍以上。
不难测定干细胞或祖细胞是否分化成心肌细胞。例如，在一些实施方式中，可通过检测细胞产生的心肌细胞特异性标记物确定是否分化成心肌细胞。合适的心肌细胞特异性细胞表面标记物包括但不限于：肌钙蛋白和原肌球蛋白。
在一些实施方式中，本发明方法在体外进行。在群体实施方式中，本发明方法在体内进行。在一些实施方式中，本发明方法在体外进行时，随后将心肌细胞引入活生物体。
在一些实施方式中，在干细胞或祖细胞存在于基质中的情况下进行本发明方法。在一些这类实施方式中，本发明方法适合产生人工心脏组织。
诱导规范Wnt信号传导途径
本发明提供在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成和/或心脏祖细胞扩增的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在干细胞或祖细胞中诱导规范Wnt信号传导途径。规范Wnt途径包括当Wnt配体结合于卷曲蛋白(Frizzled)家族的细胞表面受体时，引起受体活化蓬乱蛋白(dishevelled)家族的蛋白，最终导致到达细胞核的β-联蛋白量改变的一系列事件。Smalley等((2005)J.Cell Sci.118：5279)；Logan和Nusse(2004)Annu Rev Cell Dev Biol 20：781-810；Bejsovec(2005)Cell 120：11-4。
在一些实施方式中，干细胞或祖细胞接触Wnt配体，如Wnt激动剂时诱导规范Wnt信号传导途径。合适的Wnt激动剂包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a、Wnt8b、Wnt8c、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt14、Wnt15、or Wnt16中一种或多种的激动剂。参见例如，美国专利公开号2006/0147435。在一些实施方式中，Wnt配体是可溶性Wnt3a。在一些实施方式中，Wnt激动剂是wnt多肽、蓬乱蛋白多肽或β-联蛋白多肽。在一些实施方式中，诱导或接触步骤在中胚层定型之前进行。
在一些实施方式中，本发明方法包括使干细胞群或祖细胞群接触Wnt3a多肽。本领域已知Wnt3a多肽，可采用能够用作规范Wnt信号传导途径诱导物的任何Wnt3a多肽。在一些实施方式中，适用于本发明方法的Wnt3a多肽包含与SEQ ID NO：1所列氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，适用于本发明方法的Wnt3a多肽包含与SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的约250-275个氨基酸、约275-300个氨基酸、约300-325个氨基酸或约325-350个氨基酸的毗连序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。在一些实施方式中，适用于本发明方法的Wnt3a多肽包含与SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的氨基酸25-352具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列相同性的氨基酸序列，其中Wnt3a多肽缺少信号序列(如，对应于SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的氨基酸1-24的信号序列)。在一些实施方式中，适用于本发明方法的Wnt3a多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸25-352所列氨基酸序列的约250-275个氨基酸、约275-300个氨基酸或约300-328个氨基酸的毗连序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或100％氨基酸序列相同性的氨基酸序列。
图8A和8B显示人(GenBank登录号NP_149122；SEQ ID NO：1)、小鼠(GenBank登录号NP_033548；SEQ ID NO：2)、鸡(GenBank登录号AAY87456；SEQ ID NO：4)和蛙(GenBank登录号NP_001079343；SEQ ID NO：3)氨基酸序列的比对。下划线序列是信号肽。用粗体表示23个保守的半胱氨酸残基。比对显示了人、小鼠、鸡和蛙Wnt3a中保守的氨基酸。在给定Wnt3a蛋白中可能不同的氨基酸包括例如，氨基酸132(如，氨基酸132可以是苏氨酸或丝氨酸)；氨基酸134(如，氨基酸134可以是丙氨酸或苏氨酸)；氨基酸140(如，氨基酸140可以是苏氨酸或丝氨酸)；氨基酸143(如，氨基酸143可以是赖氨酸或谷氨酰胺)；氨基酸194(如，氨基酸194可以是丝氨酸或丙氨酸)；氨基酸230(如，氨基酸230可以是酪氨酸或苯丙氨酸)；氨基酸260(如，氨基酸260可以是酪氨酸或苯丙氨酸)；氨基酸272(如，氨基酸272可以是异亮氨酸或缬氨酸)；氨基酸300(如，氨基酸300可以是苏氨酸或丝氨酸)；氨基酸320(如，氨基酸320可以是苏氨酸或丙氨酸)；和氨基酸330(如，氨基酸330可以是异亮氨酸或缬氨酸)。
在一些实施方式中，合适的Wnt3a多肽是融合蛋白，其中Wnt3a融合蛋白包含与异源蛋白(“融合伙伴”)融合的Wnt3a多肽。合适的异源蛋白包括表位标签；提供Wnt3a融合蛋白的溶解度的多肽；提高Wnt3a融合蛋白稳定性的多肽；提供可检测信号的多肽；等。提供可检测信号的多肽包括例如，作用于底物以产生直接可检测的产物如发光产物、有色产物、荧光产物等的酶；荧光蛋白，如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白；等等。
在一些实施方式中，Wnt3a多肽包含在存在干细胞和/或祖细胞的细胞培养基中，它的浓度约为每毫升细胞培养基5ng-5000ng。例如，在一些实施方式中，在Wnt3a多肽浓度为约5ng/ml-10ng/ml、约10ng/ml-25ng/ml、约25ng/ml-50ng/ml、约50ng/ml-100ng/ml、约100ng/ml-250ng/ml、约250ng/ml-500ng/ml、约500ng/ml-750ng/ml、约750ng/ml-1000ng/ml、约1000ng/ml-2000ng/ml、约2000ng/ml-3000ng/ml、约3000ng/ml-4000ng/ml或约4000ng/ml-5000ng/ml、或5000ng/ml以上的细胞培养基中培养干细胞和/或祖细胞。
提高β-联蛋白水平
本发明提供在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成和/或心脏祖细胞扩增的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在干细胞或祖细胞中提高β-联蛋白的水平。
在一些实施方式中，所述方法包括用含有编码β-联蛋白的核苷酸序列的表达构建物遗传修饰干细胞或祖细胞，其中所述干细胞或祖细胞中产生编码的β-联蛋白，所述遗传修饰的干细胞或祖细胞中β-联蛋白的水平高于未经表达构建物遗传修饰的干细胞或祖细胞中β-联蛋白的水平，所述较高的β-联蛋白水平诱导心肌细胞形成。在一些实施方式中，所述表达构建物是病毒构建物，例如重组腺伴随病毒构建物、重组腺病毒构建物和重组慢病毒构建物等。
本领域已知编码β-联蛋白的核苷酸序列，编码功能性β-联蛋白的任何核苷酸序列均适用。在一些实施方式中，合适的多核苷酸包含与SEQ ID NO：5所列核苷酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％核苷酸序列相同性的核苷酸序列(GenBank登录号X87838；图9A-H)。在一些实施方式中，合适的多核苷酸包含与SEQ ID NO：5所列核苷酸序列中约1500-1750个核苷酸、约1750-2000个核苷酸、或约2000-2346个核苷酸的毗连序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％核苷酸序列相同性的核苷酸序列。
图9A-H提供编码人β-联蛋白(GenBank登录号X87838；SEQ ID NO：5)、小鼠β-联蛋白(GenBank登录号BC053065；SEQ ID NO：6)，鸡β-联蛋白(GenBank登录号U82964；SEQ ID NO：7)和蛙β-联蛋白(BC108764；SEQ ID NO：8)的核苷酸序列的核苷酸序列比对。由所述序列比对，不难看出可以对核苷酸序列作出的改变。
图10A-C提供人β-联蛋白(GenBank登录号CAA61107；SEQ ID NO：9)、小鼠β-联蛋白(GenBank登录号AAH53065；SEQ ID NO：10)、鸡β-联蛋白(GenBank登录号AAB80856；SEQ ID NO：11)和蛙β-联蛋白(GenBank登录号AAI08765；SEQ ID NO：12)的氨基酸序列的氨基酸序列比对。
在一些实施方式中，合适的多核苷酸包含与SEQ ID NO：9所列氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％核苷酸序列相同性的多肽的编码氨基酸序列。在一些实施方式中，合适的多核苷酸包含与SEQ ID NO：9所列氨基酸序列的约600-650个氨基酸、约650-700个氨基酸、约700-750个氨基酸或约750-781个氨基酸的毗连序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％核苷酸序列相同性的多肽的编码氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述表达构建物是病毒构建物，例如重组腺伴随病毒构建物(参见例如，美国专利7,078,387)、重组腺病毒构建物和重组慢病毒构建物等。
合适的表达载体包括但不限于：病毒载体(如基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等，Invest Opthalmol Vis Sci35：25432549，1994；Borras等，Gene Ther 6：515524，1999；Li和Davidson，PNAS 92：77007704，1995；Sakamoto等，H Gene Ther 5：10881097，1999；WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺伴随病毒(参见例如，Ali等，Hum Gene Ther 9：8186，1998，Flannery等，PNAS 94：69166921，1997；Bennett等，Invest Opthalmol Vis Sci38：28572863，1997；Jomary等，Gene Ther 4：683690，1997，Rolling等，HumGene Ther 10：641648，1999；Ali等，Hum Mol Genet 5：591594，1996；Srivastava，WO 93/09239；Samulski等，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等，Virol.(1988)166：154-165；和Flotte等，PNAS(1993)90：10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒(参见例如，Miyoshi等，PNAS 94：1031923，1997；Takahashi等，J Virol 73：78127816，1999)；逆转录病毒载体(如鼠白血病病毒、脾坏死病毒和逆转录病毒，如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖肉瘤病毒和乳房肿瘤病毒衍生的载体)等。
本领域技术人员了解许多合适的表达载体，许多可从市场上购得。以举例方式提供以下载体；就真核宿主细胞而言：是pXT1、pSG5(司查塔基公司(Stratagene))、pSVK3、pBPV、pMSG，和pSVLSV40(法玛西亚公司(Pharmacia))。然而，可采用任何其它载体，只要它与宿主细胞相容。
根据所用的宿主/载体系统，多种合适的转录和翻译控制元件中的任何一种，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等均可用于该表达载体(参见例如，Bitter等(1987)Methods in Enzymology，153：516-544)。
合适的真核启动子(在真核细胞中有功能的启动子)的非限制性例子包括CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I。本领域普通技术人员熟知如何选择合适的载体和启动子。表达载体也可含有启动翻译的核糖体结合位点和转录终止子。该表达载体也可包括增加表达的合适序列。
在一些实施方式中，编码β-联蛋白的核苷酸序列操作性连接于心脏特异性转录调节元件(TRE)，其中TRE包括启动子和增强子。合适的TRE包括但不限于：衍生自以下基因的TRE：肌球蛋白轻链-2、α-肌球蛋白重链、AE3、心脏肌钙蛋白C和心脏肌动蛋白。Franz等(1997)Cardiovasc.Res.35：560-566；Robbins等(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752：492-505；Linn等(1995)Circ.Res.76：584-591；Parmacek等(1994)Mol.Cell.Biol.14：1870-1885；Hunter等(1993)Hypertension 22：608-617；和Sartorelli等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4047-4051。
本领域已知将核酸引入宿主细胞的方法，可采用任何已知方法将核酸(如，包含编码β-联蛋白多肽的核苷酸序列的表达构建物)引入干细胞或祖细胞。合适的方法包括例如，感染、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体-介导的转染等。
由混合细胞群分离心肌细胞
在一些实施方式中，本发明方法包括：a)在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成，产生未分化干细胞和/或未分化祖细胞和心肌细胞的混合群体；和b)将心肌细胞与未分化(非心肌细胞)细胞分离开。在一些实施方式中，分离步骤包括使细胞接触心肌细胞特异性细胞表面标记物的特异性抗体。合适的心肌细胞特异性细胞表面标记物包括但不限于：肌钙蛋白和原肌球蛋白。
分离可采用公知方法进行，包括例如，各种分选方法，如荧光激活细胞分选(FACS)、负选择法等。将所选细胞与非所选细胞分离开，产生所选(“分选”)细胞群。所选细胞群可以是至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或99％以上的心肌细胞。
细胞分选(分离)方法是本领域众所周知的。分离的方法可包括磁力分离、适用抗体包被的磁珠、亲和层析和用连接于固体基质如平板的抗体“淘选”，或其它方便的技术。提供准确分离的技术包括，荧光活化的细胞分选仪，它可具有不同的复杂程度，例如多个色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。可通过死细胞有关的染料(碘化丙锭[PI]、LDS)进行选择，以清除死细胞。可采用不会对所选细胞活力产生过度有害影响的任何技术。选择包括使用一种或多种抗体时，该抗体可偶联于某标签以易于分离特定细胞类型，所述标签包括例如，磁珠；以高亲和力结合于亲和素或链霉亲和素的生物素；可与荧光激活细胞分选仪仪器使用的荧光染料；半抗原；等。可利用FACS，或者联用免疫磁性分离和流式细胞术，以进行多色分析。
用途
可利用本发明方法产生心肌细胞群或心脏祖细胞群，所述心肌细胞或心脏祖细胞可用于研究应用、产生人工心脏组织和治疗方法。
研究应用
本发明方法可用于产生用于研究应用的心肌细胞或心脏祖细胞。研究应用包括例如，将心肌细胞或心脏祖细胞引入非人动物疾病(如心脏病)模型，以测定心肌细胞或心脏祖细胞在疾病治疗中的功效；将心肌细胞用于筛选方法以鉴定适用于治疗心脏病的候选药物；等。例如，可将本发明方法产生的心肌细胞或心脏祖细胞与某种受试物质相接触，并可评估该受试物质对心肌细胞或心脏祖细胞的生物学活性的影响(如果有)，如果受试物质对心肌细胞或心脏祖细胞的生物学活性有影响，则认为它是治疗心脏病的候选药物。另一个例子是，可将本发明方法产生的心肌细胞或心脏祖细胞引入非人动物心脏病模型，可在该非人动物模型中检测心肌细胞或心脏祖细胞对疾病改善的作用。
治疗方法
可利用本发明方法产生人工心脏组织，例如植入需要的哺乳动物对象的人工心脏组织。可利用本发明方法置换损伤的心脏组织(如缺血的心脏组织)。可利用本发明方法刺激存留在心脏内的内源性干细胞，使其形成心肌细胞。当本发明方法包括将心肌细胞引入(植入)个体时，可进行同种异体或自体移植。
本发明提供治疗个体的心脏病的方法，所述方法通常包括给予需要的个体治疗有效量的一种或多种以下物质：a)诱导规范Wnt信号传导的物质；b)包含编码β-联蛋白的核苷酸序列的表达构建物；c)本发明方法制备的心肌细胞群；d)本发明方法制备的心脏祖细胞群；和e)本发明方法制备的人工心脏组织。需要用本发明方法治疗的个体包括但不限于：患有先天性心脏缺陷的个体；患有导致缺血性心脏组织的病症的个体，如患有冠状动脉疾病的个体；等。可利用本发明方法治疗变性肌肉疾病，如家族性心肌病、扩张型心肌病、肥大性心肌病、限制型心肌病或导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病。
适合用本发明方法治疗的个体包括患有心脏病症，例如导致缺血性心脏组织的病症的个体(例如，哺乳动物对象，如人；非人灵长动物；实验性非人哺乳动物对象，如小鼠、大鼠等)，如患有冠状动脉疾病的个体；等。适合用本发明方法治疗的个体包括患有变性肌肉疾病，如家族性心肌病、扩张型心肌病、肥大性心肌病、限制型心肌病或导致缺血性心肌病的冠状动脉疾病的个体。
为了给予哺乳动物宿主，可将本发明方法产生的心肌细胞群或心脏祖细胞群配制成药物组合物。药物组合物可以是无菌的水性或非水性溶液、混悬液或乳液，它们还包含生理上可接受的载体(即不干扰心肌细胞活性的无毒材料)。本领域普通技术人员已知的任何合适载体均可用于本发明药物组合物。载体的选择部分取决于所给物质(即细胞或化学化合物)的特性。代表性载体包括生理盐水溶液、明胶、水、乙醇、天然或合成油、糖溶液、二醇、可注射有机酯如油酸乙酯或这些材料的组合。任选地，药物组合物还可包含防腐剂和/或其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和/或惰性气体，和/或其它活性成分。
在一些实施方式中，按照已知的包胶技术，包括微囊化技术将心肌细胞群或心脏祖细胞群包入胶囊(参见例如，美国专利4,352,883；4,353,888；和5,084,350)。在一些实施方式中，将心肌细胞或心脏祖细胞包入胶囊时，通过美国专利号5,284,761；5,158,881；4,976,859；4,968,733；5,800,828和PCT公开专利申请WO 95/05452所述的巨囊化技术(macroencapsulation)将心肌细胞或心脏祖细胞包入胶囊。
在一些实施方式中，心肌细胞群或心脏祖细胞群存在于基质中，如下所述。
心肌细胞群或心脏祖细胞群的单位剂型可含有约10³至10⁹个细胞，例如约10³至10⁴个细胞、约10⁴细胞至10⁵个细胞、约10⁵细胞至10⁶个细胞、约10⁶细胞至10⁷个细胞、约10⁷细胞至10⁸个细胞或约10⁸细胞至10⁹个细胞。
心肌细胞群可按照常规方法冻存。例如，可以用″冷冻″培养基对约一百万至一千万个细胞进行冻存，所述冷冻培养基包含合适的增殖培养基、10％BSA和7.5％二甲亚砜。离心细胞。吸出生长培养基并用冷冻培养基替换。将细胞重悬为球体。缓慢冷冻细胞，例如放入容器中，置于-80℃。通过37℃水浴涡旋融化细胞，重悬于新鲜增殖培养基，如上所述进行培养。
人工心脏组织
在一些实施方式中，本发明方法包括：a)在体外，在干细胞群或祖细胞群中诱导心肌细胞形成，例如，干细胞或祖细胞存在于基质中，在其中产生心肌细胞；和b)将心肌细胞群移植到个体的现有心脏组织中或上。因此，本发明提供体外产生人工心脏组织和将人工心脏组织植入体内的方法。
可将人工心脏组织同种异体或自体移植到需要的个体中。为了产生人工心脏组织，可提供与干细胞或祖细胞接触的基质，在此处用本发明方法诱导干细胞或祖细胞形成心肌细胞，如上所述。这意味着，将此种基质转移到合适容器中，上面铺一层含有细胞的培养基(在扩增的干细胞或祖细胞分化之前或期间)。术语″基质″应理解为细胞能够粘附或附着以形成相应细胞复合体，即人工组织的任何合适的载体材料。在一些实施方式中，所述基质或载体材料分别以后续应用所需的三维形式存在。例如，牛心包组织用作与胶原交联、去细胞化和光固定的基质。
例如，基质(也称为″生物相容性基材″)是适合植入对象、上面可沉积细胞群的材料。生物相容性基材植入对象后不引起毒性或损伤效应。在一个实施方式中，生物相容性基材是具有可形成需要修复或替换的所需结构的表面的聚合物。聚合物也可形成需要修复或替换的结构的一部分。生物相容性基材提供细胞可以粘附并在上面生长的支持性框架。然后，培养的细胞群可以在生物相容性基材上生长，该基材提供细胞间相互作用所需的适当间距。
实施例
提供以下实施例的目的是向本领域普通技术人员完整地公开和描述如何制备和使用本发明，这些实施例不应限制发明人认为的发明范围，也不代表下述实验是所进行的所有和仅有的实验。努力保证所用数值(如含量、温度等)的准确性，但应允许一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。可采用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m.，肌内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下等。
实施例1：在胚胎干细胞诱导心肌细胞形成
指导干细胞或祖细胞形成不同谱系仍然是干细胞生物学中的基本挑战。Wnt途径的成员控制着许多关键的胚胎事件(Jessen和Solnica-Krezel Cell 120，736-7(2005)；Olson Cell 125，593-605(2006)；Kamer等，Semin CellDev Biol 17，214-22(2006))，认为在一些物种中规范Wnt配体会抑制中胚层祖细胞分化成心肌细胞(Schneider和Mercola Gene Dev 15，304-15(2001)；Marvin等Genes Dev15，316-27(2001)；Tzahor和Lassar Gene Dev 15，255-60(2001))。然而，尚不了解规范Wnt信号传导通过其专性转录介导物β-联蛋白的细胞自主作用。本文中，已证明体内的早期心脏祖细胞富含β-联蛋白，心脏祖细胞中缺乏β-联蛋白的小鼠具有较少的心肌细胞且心室发育不全。缺乏β-联蛋白的心肌细胞有增殖缺陷，Wnt/β-联蛋白靶基因细胞周期蛋白D2在突变心脏中下调。相反，心脏中β-联蛋白的稳定化导致肌细胞过度增殖和细胞周期蛋白D2上调。在胚胎干细胞发育的离散窗口中，规范Wnt信号传导的激活促进心肌细胞形成，抑制规范Wnt则抑制了心脏分化。这些发现证明，规范Wnt信号传导促进心脏发生的一些早期事件，在胚胎干细胞中正向调节心肌细胞分化。
材料和方法
小鼠品系和遗传学.通过Nkx2.5-cre、ctnnb1^{tm2Kem flox/+}或Islet1-cre、ctnnb1^{tm2Kem flox/+}品系与ctnnb1^{tm2Kem flox/flox}品系的杂交分别获得Nkx2.5-cre、ctnnb1^tm2Kem或Islet1-cre、ctnnb1^tm2Kem纯合胚胎。通过Nkx2.5-cre品系与β-联蛋白/loxP(ex3)^flox/+品系的杂交获得Nkx2.5-cre、β-联蛋白/loxP(ex3)杂合胚胎。如Jaspard等，Mech Dev 90，263-7(2000)；和Brault等，Development 128，1253-64(2001)所述鉴定野生型和突变型胚胎。
免疫组化和原位杂交。完整或冰冻切片的胚胎和EB用以下抗体染色：小鼠抗-Islet1(1∶200)和抗-原肌球蛋白(1∶100)(DSHB)、山羊抗-Wnt8a(15μg/ml，R&D系统公司(R&D Systems))、山羊抗-β-联蛋白(1∶50)和大鼠抗-细胞周期蛋白D2(1∶100)(圣克鲁兹生物科技公司(Santa Cruz Biotechnology))、兔抗-磷酸化组蛋白H3(1∶100，昂斯特公司(Upstate))和辣根过氧化物酶偶联的(TSA+荧光系统(TSA plus Fluorescent Systems)，帕金埃尔默公司(PerkinElmer))第二抗体(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory))。用所示反义探针进行mRNA原位杂交，如Srivastava等，Science 270，1995-9(1995)所述。
ES细胞培养物和基因表达分析。在维持培养基中以未分化状态增殖鼠ES细胞，所述维持培养基由以下组分构成：Glasgow MEM(西格玛(Sigma)G5154)，补充有10％胎牛血清(FBS，海克隆(Hyclone)SH30071.03)、1mM β-巯基乙醇(西格玛M7522)、2mM L-谷氨酰胺(吉布科(Gibco-BRL)25030-081)、1mM丙酮酸钠(吉布科11360-070)、0.1mM含有非必需氨基酸的极限必需培养基和LIF条件培养基(1∶1000)。在超低粘附的六孔板(克斯塔(Costar)07200601)中，用分化培养基(DM)培养ES细胞(6x10⁵/孔)3天，以形成EB，所述培养基所含组分与维持培养基基本相同，但含有20％FBS而不含LIF。在早期处理中，在开始后第4天用含有Wnt3a(150ng/ml，R&D系统公司)或Dkk1(500ng/ml，R&D系统公司)的DM更换培养基；在第6天，用新鲜DM更换培养基。在后期处理中，在开始后第7天用含Wnt3a-或Dkk1的DM更换DM，在第9天更换成新鲜DM。对早期、晚期和未处理EB而言，每3天更换一次培养基。监测EB在第8-12天的搏动。在第3天至第12天，以规则间隔收集EB。在基因表达分析中，分离总RNA，用ABI普利司(ABI Prism)系统(7900HT，应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行实时PCR。本研究所用的TaqMan引物见表1。所有样品均一式三份地进行测定。用SDS2.2软件校正和标准化实时PCR数据。
表1

  基因名称  基因ID  物种  ABI编号#  短尾基因(T)  NM_009309.1  鼠  Mm00436877_ml  Gapdh  NM_001001303  鼠  Mm99999915_gl  Gata4  NM_008092  鼠  Mm00484689_ml  Hand1  NM_008213.1  鼠  Mm00433931_ml  Hand2  NM_010402.2  鼠  Mm00439247_ml  Islet1  NM_021459.2  鼠  Mm00627860_ml  Mesp1  NM_008588.1  鼠  Mm00801883_gl  Myh6  NM_010856.2  鼠  Mm00440354_ml  Myh7  NM_080728  鼠  Mm00600555_ml  Mlc2a  NM_022879.1  鼠  Mm00491655_ml  Mlc2v  NM_010861.2  鼠  Mm00440384_ml  Nkx2.5  NM_008700.2  鼠  Mm00657783_ml  Tbx5  NM_011537.2  鼠  Mm00803521_ml
结果
原肠胚形成后不久，在诱导性和抑制性信号的相互作用刺激下，在中胚层前侧开始形成脊椎动物心脏。Olson和Schneider Genes Dev 17，1937-56(2003)；Zaffran和Frasch Circ Res 91，457-69(2002)。由于对相邻的内胚层和外胚层信号的应答，中胚层前体的两个区域-第一和第二心脏区-选定心脏命运，各自产生不同的心脏区域。Buckingham等Nat Rev Genet 6，826-35(2005)；Srivastava Cell 126，1037-48(2006)。尽管心脏发育途径在不同物种中相对保守，但已报道Wnt信号传导在心脏发生中的互斥作用。
在无翅苍蝇中，需要规范Wnt家族的组成成员(founding member)决定心脏谱系(Wu等Dev Biol 169，619-28(1995)；Jagla等Development 124，91-100(1997))；然而，在蛙和鸡中，过度表达规范Wnt可能会通过影响内胚层而抑制心肌细胞决定或分化。(Schneider和Mercola Genes Dev 15，304-15(2001)；Marvin等Genes Dev 15，316-27(2001)；Tzahor和Lassar Genes Dev 15，255-60(2001))。Wnt配体结合于卷曲蛋白跨膜受体时启动规范Wnt信号传导途径，从而稳定β-联蛋白的蛋白质水平，β-联蛋白是与TCF/LEF转录因子家族相互作用活化Wnt靶基因的转录共同激活物。Logan和Nusse Annu Rev Cell Dev Biol 20，781-810(2004)；Bejsovec Cell120，11-4(2005)。G蛋白偶联受体介导的非规范Wnt信号传导-依赖性胞内钙改变可促进心脏发生(Pandur等，Nature 418，636-41(2002))，但尚不了解Wnt途径在中胚层前体中的细胞自主作用。
为了确定规范Wnt信号传导在心脏形成区域中是否有活性，测定小鼠胚胎中的β-联蛋白表达。胚胎日(E)8.5时，心肌层中富含β-联蛋白，这表明心脏祖细胞中规范Wnt信号传导处于活动状态。在发育心脏中表达的规范Wnt分子(Wnt2、Wnt7a、Wnt8a)中(Monkley等，Development 122，3343-53(1996)；Bond等，Dev Dyn 227，536-43(2003)；Jaspard等，Mech Dev 90，263-7(2000))，发现E8.5时Wnt8a在心脏前体中的表达特异性最高。β-联蛋白和Wnt8a在较晚期的发育阶段持续表达。
为了检测规范Wnt信号传导在心肌细胞中的细胞自主作用，分别利用ctnnb1^tm2Kem(Brault等，Development 128，1253-64(2001))或β-联蛋白/loxP(ex3)(Harada等，EMBO J18，5931-42(1999))小鼠破坏或稳定心脏中胚层前体中的β-联蛋白表达。在ctnnb1^tm2Kem小鼠中，Cre重组酶介导的外显子2-6切割在β-联蛋白/loxP(ex3)小鼠中产生β-联蛋白无效的等位基因；cre表达通过产生稳定的β-联蛋白活化Wnt/β-联蛋白信号传导(图1A和1B)。从E8.0开始，刚好在早期心脏定型事件开始后，利用Nkx2.5-cre品系驱动心室发生前体中的cre表达。McFadden等，Development 132，189-201(2005)。Cre介导的切割事件经Western分析验证，几乎是完全切割(图1B)。
Nkx2.5-cre、ctnnb1^tm2Kem纯合胚胎大约在E12.5死于心脏功能障碍，其心室尺寸，特别是右心室(RV)尺寸明显减小，心室壁中心肌细胞较少。相反，具有稳定化β-联蛋白的Nkx2.5-cre、β-联蛋白/loxP(ex3)杂合胚胎心脏增大，心室壁异常增厚，这表明规范Wnt信号传导调节心肌细胞数量。
为了鉴定心肌改变的根源，利用抗磷酸化组蛋白H3(PH3)抗体对心脏进行免疫染色分析以测定细胞周期控制的改变，或通过TUNEL测定检测凋亡。PH3染色在Nkx2.5-cre、ctnnb1^tm2Kem心脏中降低(38％，P＜0.01)，在Nkx2.5-cre，β-联蛋白/loxP(ex3)心脏中升高(132％，P＜0.01)。促进细胞周期运转的Wnt/β-联蛋白信号传导的已知靶点-细胞周期蛋白D2的水平(Kioussi等，Cell 111，673-85(2002)；Huang等，Oncogene(2007)26：2471)在Nkx2.5-cre、β-联蛋白/loxP(ex3)心脏中升高，在Nkx2.5-cre、ctnnb1^tm2Kem心脏中降低。凋亡未受影响。因此，第一和第二心脏区域的衍生物中需要Wnt/β-联蛋白，它分别作用于左心室或右心室，以细胞自主方式将心脏祖细胞维持在增殖状态。
由于Nkx2.5-cre在未分化中胚层前体中未激活，所以上述结果可能代表Wnt/β-联蛋白信号传导在中胚层祖细胞定型为心脏谱系之后的相对晚期的作用。为了评价其早期作用，通过使ctnnb1^tm2Kem小鼠与Islet1-cre小鼠杂交，在心脏分化之前使第二心脏区域祖细胞中缺失β-联蛋白，其中cre在E7.0-7.5时在中胚层祖细胞中表达产生RV和流出道(outflow tract)。Cai等，Dev Cell 5，877-89(2003)。在Islet1-cre，ctnnb1^tm2Kem纯合胚胎中，第二心脏区域无法形成RV，但左心室(LV)的尺寸相对正常。用识别LV特异性转录物Hand1(SrivastavaTrends Cardiovasc Med 9，11-8(1999))(还在流出道中表达)的探针进行原位杂交证实了心室的身份。突变心脏切片揭示出缩小的RV和流出道区域内的心肌层薄，这表明与Nkx2.5-Cre晚期缺失相比RV前体的缺陷更严重。与Islet1-Cre在咽弓中胚层中的活性相一致，β-联蛋白缺失也导致这些结构发育不全。因此，第二心脏区域中胚层祖细胞可能需要Wnt/β-联蛋白信号传导来进行特定分化(specification)或扩增。Islet1表达正常，这表明存在中胚层祖细胞，但不能分化成产生RV的肌细胞。
虽然心脏祖细胞发育需要Wnt/β-联蛋白，但我们的体内数据未确定诱导早期心脏祖细胞是否需要Wnt/β-联蛋白信号传导，它们也不能说明Wnt调节的初始分子事件。为了解答这些问题，采用胚胎干(ES)细胞分化系统，该系统允许观察特定发育阶段的祖细胞。悬滴培养的ES细胞可形成随机分化成三个胚层的衍生物并可形成搏动心肌细胞的胚状体(EB)，但频率较低。悬浮培养EB时，该频率甚至更低，但悬浮培养技术容易实现得多，并且能以较高通量由ES细胞产生心肌细胞。
为了确定靶向规范Wnt信号传导的最佳时间，在ES分化过程中对中胚层和心脏基因表达进行概况分析。早期中胚层标记物短尾基因(Bry)在EB分化第3天(EB3)被强烈诱导，但随后下调，这表明到EB3发生中胚层定型(图2)。其它早期心脏中胚层标记物，包括转录因子Nkx2.5、Tbx5、Gata4和Mesp1在EB4-6被高度诱导。晚期心脏标记物，包括肌节基因Myh6、Myh7、Mlc2a和Mlc2v到EB7-9被诱导(图3A和3B)。
体内(Haegel等，Development 121，3529-37(1995)；Liu等，Nat Genet 22，361-5(1999))和EB(Lindsley等，Development 133，3787-96(2006))中，普通中胚层形成需要规范Wnt信号传导。为了帮助解释Wnt信号传导对心脏分化的特殊作用，在中胚层定型(EB3)后早期心脏基因诱导(EB4-5)前靶向规范Wnt信号传导。利用可溶性Wnt3a(可获得的可溶性规范Wnt配体)和dickopff1(Dkk1)(规范Wnt的抑制剂)促进或破坏Wnt/β-联蛋白信号传导。Bry表达未改变(图4A)，这表明在EB3后刺激或抑制规范Wnt信号传导不改变中胚层祖细胞的数量。相反，在细胞悬浮培养的情况下，在EB4-6用可溶性Wnt3a刺激Wnt/β-联蛋白则将EB12时搏动EB的数量从10％提高到50％以上(图4B，左图，P＜0.01)。在EB4-6用Dkk-1抑制规范Wnt信号传导导致搏动EB完全消失(图4B，右图)，这表明ES细胞分化系统中心肌细胞形成需要规范Wnt信号传导。Wnt信号传导以类似方式影响心脏祖细胞：EB中的Isl1-和原肌球蛋白-阳性细胞数量被Wnt激动剂提高，而被Wnt拮抗剂降低(图4C和4D)。
与Wnt将中胚层祖细胞推动为心脏谱系的正向作用相一致，在EB4-6接触Wnt3a能上调早期心脏基因Nkx2.5和Tbx5的表达，而接触Dkk-1则能下调其表达(图4E，上图)。第二心脏区域标记物Islet1和RV标记物Hand2(SrivastavaTrends Cardiovasc Med 9，11-8(1999))对Wnt3a和Dkk-1的反应与心脏肌节基因相似(图4E，上图)。
为了评价诱导早期心脏中胚层后规范Wnt信号传导的作用，在EB 7-9利用Wnt3a或Dkk-1处理EB。接近50％Wnt3a处理和悬浮培养的EB在EB 12时搏动(图4B，左图，P＜0.01)，大部分早期和晚期心脏标记物上调(图4E，下图)，这表明Wnt即使在相对晚期，也对心脏中胚层分化有正向作用。约10％Dkk-1处理的EB搏动(相对而言13％对照EB搏动，图4B，右图，P＞0.2)，心脏基因表达未改变(图4E，下图)。因此，心脏中胚层定型后，规范Wnt信号对完成心脏分化而言似乎不是必需的，但它仍可征集中胚层前体或扩增心脏祖细胞。
在模型体系中规范Wnt信号传导激动剂的错误表达或过度表达导致以下流行的观点：脊椎动物心脏发生需要抑制规范Wnt信号传导(Olson和SchneiderGene Dev 17，1937-56(2003)；Eisenberg和Eisenberg Dev Biol 293，305-15(2006))。为了验证此理论，以空间-时间限制和细胞自主方式进行规范Wnt信号传导的丢失功能研究和获得功能研究。与流行观点相反，Wnt/β-联蛋白信号传导是小鼠胚胎和ES衍生细胞中心脏祖细胞发育所必需的，甚至对中胚层祖细胞中心脏基因表达的最早迹象也是必需的。与这些发现相一致的是，果蝇()中心脏祖细胞的诱导和分化需要规范Wnt信号传导(Zaffran和Frasch Circ Res91，457-69(2002)；Buckingham等，Nat Rev Genet 6，826-35(2005))。相反，刺激Wnt/β-联蛋白信号传导导致心脏增大和心脏细胞增殖过多，这表明它在心脏细胞增殖中的指令性作用，这种作用可能部分通过对细胞周期蛋白D2的影响来实现。由悬浮培养的EB有效产生搏动的心肌细胞和诱导心脏基因表达进一步证实了规范Wnt信号传导在促进心脏发生中的正向作用。因此，本文中已证明Wnt/β-联蛋白信号传导是哺乳动物心脏形成中必需的，可通过操作规范Wnt信号传导来调节ES细胞的心脏确定和分化。
图1A和1B描述组织特异性的无效和稳定的β-联蛋白的产生。b，利用β-联蛋白和GAPDH的抗体(分别以1∶50和1∶100稀释，圣克鲁兹生物科技)对来自E12.0时Nkx2.5-cre、ctnnb1^tm2Kem杂合子和纯合子(左侧)以及野生型和Nkx2.5-cre、β-联蛋白/loxP(ex3)杂合子(右侧)胚胎的心室进行的Western印迹。GAPDH抗体用作对照。
图2描述短尾基因的表达概况。表示未分化ES细胞的心脏基因表达的改变倍数(y轴)。误差棒指出标准差。
图3A和3B描述早期和晚期心脏基因的表达概况。a，到第6天，WT EB中早期心脏基因(Nkx2.5、Tbx5、Gata4和Mesp1)的表达水平明显不同。b，到第9天，WT EB中晚期心脏基因(Myh6、Myh7、Mlc2a和Mlc2v)的表达水平显著增加。表示未分化ES细胞的心脏基因表达的改变倍数(y轴)。误差棒指出标准差。
图4A-E.规范Wnt信号传导调节ES细胞的心脏诱导和分化。a，经实时定量PCR(qPCR)测定，与对照相比，第0天的未分化ES细胞和早期Wnt3a或Dkk-1处理后第3、6和9天收获的EB的短尾基因表达概况。b，第8-12天悬浮培养的搏动EB的计数结果。早期(第4-6天)或晚期(第7-9天)用Wnt3a(左)或Dkk-1(右)处理后，搏动EB的百分数。星号表示相对于未处理EB，处理组的搏动百分数有显著差异(P＜0.01)。c，d用抗-Islet1(c)或抗-原肌球蛋白(d)对第12天的EB进行的免疫组化。e，早期(第4-6天，上图)或晚期(第7-9天，下图)用Wnt3a或Dkk-1处理后的心脏基因表达。第3、6和9天(早期处理)或第6、9和12天(晚期处理)收获EB。通过qPCR评估相对于未分化的ES细胞，EB中所有标明基因的表达改变倍数(y-轴)。NS，不显著。^*P＜0.01。
实施例2：稳定化β-联蛋白影响的基因的鉴定
为了在基因组范围内检索受稳定化β-联蛋白影响的第二心脏区域(SHF)基因，产生Rosa-YFP^+/-；Islet1-cre^+/-；β-联蛋白(ex3)loxP ^loxP/+胚胎。这些胚胎的SHF祖细胞和其衍生物中表达黄色荧光蛋白(YFP)。胚胎日(E)9时，解剖这些胚胎，修整去除不需要的细胞(头和尾组织)。选择这一胚期以避免心力衰竭后可能发生的二次基因改变。在格莱斯顿流式细胞术实验室(Gladstone FlowCytometry Lab)，通过荧光激活的细胞分选(FACS)纯化YFP⁺细胞(图5)。Rosa-YFP-阴性胚胎组织用作门控对照(图5，左图)。
图5.显示来自E9.5的对照(Islet1-cre，左)、野生型(Rosa-YFP；Islet1-cre，中)和突变型(Islet1-cre；β-联蛋白(ex3)loxP，右)胚胎的YFP+细胞群的直方图。用矩形框表示用于分选的YFP+细胞。
各个E9.5胚胎产生约3000个YFP⁺细胞和约10ng总RNA。该RNA产量(10ng)足以产生一个用于艾菲美特(Affymetrix)试验的样品。对此微阵列分析进行三次重复实验。用WT-奥法兴皮可RNA扩增系统(WT-Ovation Pico RNAAmplification System)扩增总RNA，片段化，并用FL-奥法兴cDNA生物素模块V2(FL-Ovation cDNA Biotin Module V2)(纽基公司(Nugen))标记。简要说，通过RT-PCR和PCR，由总RNA合成DNA/RNA异源双链体双链cDNA。通过SPIA等温线性扩增进一步扩增该cDNA。纯化后，将得到的cDNA片段化和标记，以便用艾菲美特基因芯片杂交。艾菲美特基因芯片的杂交、染色和扫描均由格莱斯顿基因组中心实验室(Gladstone Genomics Core Lab)进行。进一步分析原始数据，消减潜在候选物的数量。表2显示该阵列中调节明显异常的所选基因。
表2
  基因标志符  改变倍数  基因标志符  改变倍数  Ndrg1  11  Wif1  3.6  Ndrl  8.2  Apcdd1  3.5  Dkk1  3.4  Myct1  7.5  Dkk2  3  Ier3  7.5  Dkk3  1.8  Axin2  1.7  Bhlhb2  6.5  T  2.5  Fgf11  5.2  Fgf9  2.6  CCng2  2.6  Fgf4  1.9  Tgfbi  2.5  Rorα  4.9  Tgfα  2  Sox 17  3.5  BMP2  2.5  Sox 18  2.2  BMP4  1.8  Sox 10  2.1  Tbx20  -1.9  Isl1  -2.3  Shh  -2.4  Myocd  -2.6  Smyd1  -2.6
突变型中规范Wnt的许多反馈靶基因(Wnt信号传导组件)，如Dkks、Wif1、Apcdd1和Axin2上调，这证实了数据集的质量。突出的是，突变型中细胞周期相关基因如Ndrg1、Ndrl和Myct1显著上调。N-myc下游调节基因-1(Ndrg1)编码参与细胞分化的一种新型蛋白质。Kokame等，J Biol Chem 1996；271：29659-65；van Belzen等，Lab Invest 1997；77：85-92。myc靶点1(Myct1)是癌基因c-Myc的直接靶点，它调节参与癌症的基因。Cohen和Prochownik Cell Cycle2006；5：392-3。一致的是，编码生长因子，如Fgf、Tgf和BMP的基因均高度上调。含有SRY框的基因Sox17、18和10也上调。规范Wnt信号传导正向调节Sox17，它是ES细胞发生心脏特定分化所必需的。Liu等，Proc Natl Acad SciU S A 2007；104：3859-64。在上调的基因集中，含有碱性螺旋-环-螺旋结构域的B2类(Bhlhb2)编码序列特异性转录抑制物，其同源物参与细胞周期、分化和昼夜节律调节的过程。Zawel等，Proc Natl Acad Sci USA 2002；99：2848-53；Boudjelal等，Genes Dev 1997；11：2052-65；Sun等，Nat Immunol 2001；2：1040-7；Honma等，Nature 2002；419：841-4。在许多上调基因的基因座中发现保守的Lef/Tcf结合位点，这提示它们可能是Wnt/β-联蛋白信号传导的直接靶点。在突变体中几种基因似乎明显下调。它们包括Isl1、Shh、Myocd和Smyd1。Isl1是SHF标记物，为SHF发育所需。Cai等，Cell(2003)5：877-89。心脏形态发生中需要Shh，它是Islet1的下游靶点。Lin等，Dev Biol 2006；295：756-63。因此，Shh下调可能是由Islet1表达降低引起的。然而，在Shh基因座中发现保守的Bhlhb2结合位点，这提示Wnt/β-联蛋白信号传导也可能通过Bhlhb2抑制Shh表达。心肌素(Myocardin，Myocd)是参与肌形成的转录共同激活物。Pipes等，Genes Dev 2006；20：1545-56。含有SET和MYND结构域的蛋白1(Smyd1)是对心脏形态发生至关重要的组蛋白甲基转移酶。Gottlieb等，Nat Genet2002；31：25-32。有趣的是，Smyd1敲除(KO)胚胎出现心脏增大(Gottlieb等(2002)，同上)，这类似于具有稳定化β-联蛋白的胚胎的心脏。Kwon等，Proc NatlAcadSci USA2007；104：10894-9。通过实时定量PCR测定一些候选基因(图6)。
图6.由WT(Rosa-YFP；Islet1-cre，左柱)和Mut(Rosa-YFP；Islet1-cre；β-联蛋白(ex3)loxP，右柱)胚胎分选的YFP+细胞中所示基因的实时定量RT-PCR。误差棒指出标准差。
实施例3：
用Wnt-3a处理正在分化的人胚胎干(ES)细胞(H9)。如图7所示，Wnt-3a显著增加搏动hES细胞的数量。因此，规范Wnt能促进人ES细胞分化成心肌细胞。
虽然参照具体实施方式描述了本发明，但本领域技术人员应理解可在不背离本发明真实构思和范围的情况下作出各种改变并用其等同形式替代。此外，可根据本发明目的、构思和范围进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、工艺步骤。所有这些修改均应包括在所附权利要求书的范围之内。
序列表
<110>D.斯里瓦斯塔瓦(Srivastava，Deepak)权喆颜(Kwon，Chulan)
<120>诱导心肌细胞形成的方法
<130>GLAD-037WO
<150>60/858,145
<151>2006-11-09
<160>12
<170>用于Windows的FastSEQ4.0版
<210>1
<211>352
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Met Ala Pro Leu Gly Tyr Phe Leu Leu Leu Cys Ser Leu Lys Gln Ala
 1               5                  10                  15
Leu Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr
            20                  25                  30
Ser Ser Leu Gly Ser Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro
    50                  55                  60
Ser Val Ala Glu Gly Ile Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65                  70                  75                  80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val His Asp Ser Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
            100                 105                 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Ala Glu Gly Thr Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg His Gln Gly
    130                 135                 140
Ser Pro Gly Lys Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
                165                 170                 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
            180                 185                 190
Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Arg Ala Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
                245                 250                 255
Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val
            260                 265                 270
Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
        275                 280                 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr Cys Asn Val Ser Ser His Gly Ile
    290                 295                 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Ala
305                 310                 315                 320
Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys Arg Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr
                325                 330                 335
Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
            340                 345                 350
<210>2
<211>352
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Met Ala Pro Leu Gly Tyr Leu Leu Val Leu Cys Ser Leu Lys Gln Ala
 1               5                  10                  15
Leu Gly Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Pro Gln Tyr
            20                  25                  30
Ser Ser Leu Ser Thr Gln Pro Ile Leu Cys Ala Ser Ile Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro
    50                  55                  60
Ser Val Ala Glu Gly Val Lys Ala Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65                  70                  75                  80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val Ser Asn Ser Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
            100                 105                 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Ala Glu Gly Ser Ala Ala Ile Cys Gly Cys Ser Ser Arg Leu Gln Gly
    130                 135                 140
Ser Pro Gly Glu Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Ile Glu
145                 150                 155                 160
Phe Gly Gly Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
                165                 170                 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
            180                 185                 190
Gln Ala Ile Ala Ser His Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Arg Thr Ile Gly Asp Phe Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
                245                 250                 255
Arg Pro Arg Tyr Thr Tyr Phe Lys Val Pro Thr Glu Arg Asp Leu Val
            260                 265                 270
Tyr Tyr Glu Ala Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
        275                 280                 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Thr CysAsn Val Ser Ser His Gly Ile
    290                 295                 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Ala Arg Thr
305                 310                 315                 320
Glu Arg Arg Arg Glu Lys Cys His Cys Val Phe His Trp Cys Cys Tyr
                325                 330                 335
Val Ser Cys Gln Glu Cys Thr Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
            340                 345                 350
<210>3
<211>352
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus laevis)
<400>3
Met Gly Cys Phe Gly Tyr Leu Leu Leu Ile Ile Gly Leu His Gln Val
 1               5                  10                  15
Leu Ala Thr Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Val Gly Gln Gln Tyr
            20                  25                  30
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Pro Ile Pro Cys Gly Thr Ile Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Val Ala Lys Gln Met Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Met Glu Ile Met Pro
    50                  55                  60
Ser Val Ala Glu Gly Val Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65                  70                  75                  80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val Asn Asp Asn Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
            100                 105                 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Ala Glu Gly Ser Ala Thr Ile Cys Gly Cys Asp Thr His His Lys Gly
    130                 135                 140
Pro Pro Gly Glu Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Met Asp
145                 150                 155                 160
Phe Gly Ser Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
                165                 170                 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
            180                 185                 190
Thr Ser Ile Leu Asp His Arg His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Arg Val Ile Gly Asp Tyr Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
                245                 250                 255
Arg Pro Lys Tyr Thr Phe Phe Lys Pro Pro Ile Glu Arg Asp Leu Ile
            260                 265                 270
Tyr Tyr Glu Ser Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
        275                 280                 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Glu Cys Asn Val Thr Ser His Gly Ile
    290                 295                 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly Gln Asn Thr Arg Thr
305                 310                 315                 320
Glu Lys Arg Lys Glu Lys Cys His Cys Ile Phe His Trp Cys Cys Tyr
                325                 330                 335
Val Ser Cys Gln Glu Cys Met Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
            340                 345                 350
<210>4
<211>352
<212>PRT
<213>红原鸡(Gallus gallus)
<400>4
Met Ala Ser Phe Gly Tyr Phe Leu Phe Leu Cys Gly Leu Ser Gln Ala
 1               5                  10                  15
Leu Ser Ser Tyr Pro Ile Trp Trp Ser Leu Ala Ile Gly His Gln Tyr
            20                  25                  30
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Pro Ile Leu Cys Gly Ser Ile Pro Gly Leu
        35                  40                  45
Val Pro Lys Gln Leu Arg Phe Cys Arg Asn Tyr Val Glu Ile Met Pro
    50                  55                  60
Ser Val Ala Glu Gly Val Lys Ile Gly Ile Gln Glu Cys Gln His Gln
65                  70                  75                  80
Phe Arg Gly Arg Arg Trp Asn Cys Thr Thr Val Asn Asp Ser Leu Ala
                85                  90                  95
Ile Phe Gly Pro Val Leu Asp Lys Ala Thr Arg Glu Ser Ala Phe Val
            100                 105                 110
His Ala Ile Ala Ser Ala Gly Val Ala Phe Ala Val Thr Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Ala Glu Gly Ser Ala Thr Ile Cys Gly Cys Asp Thr Arg His Lys Gly
    130                 135                 140
Ser Pro Gly Glu Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Glu Asp Val Glu
145                 150                 155                 160
Phe Gly Ser Met Val Ser Arg Glu Phe Ala Asp Ala Arg Glu Asn Arg
                165                 170                 175
Pro Asp Ala Arg Ser Ala Met Asn Arg His Asn Asn Glu Ala Gly Arg
            180                 185                 190
Thr Ser Ile Ile Glu Leu Met His Leu Lys Cys Lys Cys His Gly Leu
        195                 200                 205
Ser Gly Ser Cys Glu Val Lys Thr Cys Trp Trp Ser Gln Pro Asp Phe
    210                 215                 220
Arg Val Ile Gly Asp Tyr Leu Lys Asp Lys Tyr Asp Ser Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
Met Val Val Glu Lys His Arg Glu Ser Arg Gly Trp Val Glu Thr Leu
                245                 250                 255
Arg Pro Lys Tyr Asn Phe Phe Lys Ala Pro Thr Glu Lys Asp Leu Val
            260                 265                 270
Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Asn Phe Cys Glu Pro Asn Pro Glu Thr Gly
        275                 280                 285
Ser Phe Gly Thr Arg Asp Arg Ile Cys Asn Val Thr Ser His Gly Ile
    290                 295                 300
Asp Gly Cys Asp Leu Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Asn Thr Arg Thr
305                 310                 315                 320
Glu Lys Arg Lys Glu Lys Cys His Cys Ile Phe His Trp Cys Cys Tyr
                325                 330                 335
Val Arg Cys Gln Glu Cys Ile Arg Val Tyr Asp Val His Thr Cys Lys
            340                 345                 350
<210>5
<211>2346
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
atggctactc aagctgattt gatggagttg gacatggcca tggaaccaga cagaaaagcg 60
gctgttagtc actggcagca acagtcttac ctggactctg gaatccattc tggtgccact 120
accacagctc cttctctgag tggtaaaggc aatcctgagg aagaggatgt ggatacctcc 180
caagtcctgt atgagtggga acagggattt tctcagtcct tcactcaaga acaagtagct 240
gatattgatg gacagtatgc aatgactcga gctcagaggg tacgagctgc tatgttccct 300
gagacattag atgagggcat gcagatccca tctacacagt ttgatgctgc tcatcccact 360
aatgtccagc gtttggctga accatcacag atgctgaaac atgcagttgt aaacttgatt 420
aactatcaag atgatgcaga acttgccaca cgtgcaatcc ctgaactgac aaaactgcta 480
aatgacgagg accaggtggt ggttaataag gctgcagtta tggtccatca gctttctaaa 540
aaggaagctt ccagacacgc tatcatgcgt tctcctcaga tggtgtctgc tattgtacgt 600
accatgcaga atacaaatga tgtagaaaca gctcgttgta ccgctgggac cttgcataac 660
ctttcccatc atcgtgaggg cttactggcc atctttaagt ctggaggcat tcctgccctg 720
gtgaaaatgc ttggttcacc agtggattct gtgttgtttt atgccattac aactctccac 780
aaccttttat tacatcaaga aggagctaaa atggcagtgc gtttagctgg tgggctgcag 840
aaaatggttg ccttgctcaa caaaacaaat gttaaattct tggctattac gacagactgc 900
cttcaaattt tagcttatgg caaccaagaa agcaagctca tcatactggc tagtggtgga 960
ccccaagctt tagtaaatat aatgaggacc tatacttacg aaaaactact gtggaccaca 1020
agcagagtgc tgaaggtgct atctgtctgc tctagtaata agccggctat tgtagaagct 1080
ggtggaatgc aagctttagg acttcacctg acagatccaa gtcaacgtct tgttcagaac 1140
tgtctttgga ctctcaggaa tctttcagat gctgcaacta aacaggaagg gatggaaggt 1200
ctccttggga ctcttgttca gcttctgggt tcagatgata taaatgtggt cacctgtgca 1260
gctggaattc tttctaacct cacttgcaat aattataaga acaagatgat ggtctgccaa 1320
gtgggtggta tagaggctct tgtgcgtact gtccttcggg ctggtgacag ggaagacatc 1380
actgagcctg ccatctgtgc tcttcgtcat ctgaccagcc gacaccaaga agcagagatg 1440
gcccagaatg cagttcgcct tcactatgga ctaccagttg tggttaagct cttacaccca 1500
ccatcccact ggcctctgat aaaggctact gttggattga ttcgaaatct tgccctttgt 1560
cccgcaaatc atgcaccttt gcgtgagcag ggtgccattc cacgactagt tcagttgctt 1620
gttcgtgcac atcaggatac ccagcgccgt acgtccatgg gtgggacaca gcagcaattt 1680
gtggaggggg tccgcatgga agaaatagtt gaaggttgta ccggagccct tcacatccta 1740
gctcgggatg ttcacaaccg aattgttatc agaggactaa ataccattcc attgtttgtg 1800
cagctgcttt attctcccat tgaaaacatc caaagagtag ctgcaggggt cctctgtgaa 1860
cttgctcagg acaaggaagc tgcagaagct attgaagctg agggagccac agctcctctg 1920
acagagttac ttcactctag gaatgaaggt gtggcgacat atgcagctgc tgttttgttc 1980
cgaatgtctg aggacaagcc acaagattac aagaaacggc tttcagttga gctgaccagc 2040
tctctcttca gaacagagcc aatggcttgg aatgagactg ctgatcttgg acttgatatt 2100
ggtgcccagg gagaacccct tggatatcgc caggatgatc ctagctatcg ttcttttcac 2160
tctggtggat atggccagga tgccttgggt atggacccca tgatggaaca tgagatgggt 2220
ggccaccacc ctggtgctga ctatccagtt gatgggctgc cagatctggg gcatgcccag 2280
gacctcatgg atgggctgcc tccaggtgac agcaatcagc tggcctggtt tgatactgac 2340
ctgtaa                                                            2346
<210>6
<211>3565
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>6
gcggcgccat cttaagccct cgctcggtgg cggccgcgtc agctcgtgtc ctgtgaagcc 60
cgcggcccgg ggaggcggag acggagcacg gtgggcgccg agccgtcagt gcaggaggcc 120
gaggccgagc gggcggccgc gagtgagcag cgcgcgggcc tgagggtacc tgaagctcag 180
cgcacagctg ctgtgacacc gctgcgtgga caatggctac tcaagctgac ctgatggagt 240
tggacatggc catggagccg gacagaaaag ctgctgtcag ccactggcag cagcagtctt 300
acttggattc tggaatccat tctggtgcca ccaccacagc tccttccctg agtggcaagg 360
gcaaccctga ggaagaagat gttgacacct cccaagtcct ttatgaatgg gagcaaggct 420
tttcccagtc cttcacgcaa gagcaagtag ctgatattga cgggcagtat gcaatgacta 480
gggctcagag ggtccgagct gccatgttcc ctgagacgct agatgagggc atgcagatcc 540
catccacgca gtttgacgct gctcatccca ctaatgtcca gcgcttggct gaaccatcac 600
agatgttgaa acatgcagtt gtcaatttga ttaactatca ggatgacgcg gaacttgcca 660
cacgtgcaat tcctgagctg acaaaactgc taaacgatga ggaccaggtg gtagttaata 720
aagctgctgt tatggtccat cagctttcca aaaaggaagc ttccagacat gccatcatgc 780
gctcccctca gatggtgtct gccattgtac gcaccatgca gaatacaaat gatgtagaga 840
cagctcgttg tactgctggg actctgcaca acctttctca ccaccgcgag ggcttgctgg 900
ccatctttaa gtctggtggc atcccagcgc tggtgaaaat gcttgggtca ccagtggatt 960
ctgtactgtt ctacgccatc acgacactgc ataatctcct gctccatcag gaaggagcta 1020
aaatggcagt gcgcctagct ggtggactgc agaaaatggt tgctttgctc aacaaaacaa 1080
acgtgaaatt cttggctatt acaacagact gccttcagat cttagcttat ggcaatcaag 1140
agagcaagct catcattctg gccagtggtg gaccccaagc cttagtaaac ataatgagga 1200
cctacactta tgagaagctt ctgtggacca caagcagagt gctgaaggtg ctgtctgtct 1260
gctctagcaa caagccggcc attgtagaag ctggtgggat gcaggcactg gggcttcatc 1320
tgacagaccc aagtcagcga cttgttcaaa actgtctttg gactctcaga aacctttcag 1380
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gttccgatga tataaatgtg gtcacctgtg cagctggaat tctctctaac ctcacttgca 1500
ataattacaa aaacaagatg atggtgtgcc aagtgggtgg catagaggct cttgtacgca 1560
ccgtccttcg tgctggtgac agggaagaca tcactgagcc tgccatctgt gctcttcgtc 1620
atctgaccag ccggcatcag gaagccgaga tggcccagaa tgccgttcgc cttcattatg 1680
gactgcctgt tgtggttaaa ctcctgcacc caccatccca ctggcctctg ataaaggcaa 1740
ctgttggatt gattcgaaac cttgcccttt gcccagcaaa tcatgcgcct ttgcgggaac 1800
agggtgctat tccacgacta gttcagctgc ttgtacgagc acatcaggac acccaacggc 1860
gcacctccat gggtggaacg cagcagcagt ttgtggaggg cgtgcgcatg gaggagatag 1920
tagaagggtg tactggagct ctccacatcc ttgctcggga cgttcacaac cggattgtaa 1980
tccgaggact caataccatt ccattgtttg tgcagttgct ttattctccc attgaaaata 2040
tccaaagagt agctgcaggg gtcctctgtg aacttgctca ggacaaggag gctgcagagg 2100
ccattgaagc tgagggagcc acagctcccc tgacagagtt actccactcc aggaatgaag 2160
gcgtggcaac atacgcagct gctgtcctat tccgaatgtc tgaggacaag ccacaggatt 2220
acaagaagcg gctttcagtc gagctgacca gttccctctt caggacagag ccaatggctt 2280
ggaatgagac tgcagatctt ggactggaca ttggtgccca gggagaagcc cttggatatc 2340
gccaggatga tcccagctac cgttcttttc actctggtgg atacggccag gatgccttgg 2400
ggatggaccc tatgatggag catgagatgg gtggccacca ccctggtgct gactatccag 2460
ttgatgggct gcctgatctg ggacacgccc aggacctcat ggatgggctg cccccaggtg 2520
atagcaatca gctggcctgg tttgatactg acctgtaaat cgtcctttag gtaagaaagc 2580
ttataaaagc cagtgtgggt gaatacttta ctctgcctgc agaactccag aaagacttgg 2640
tagggtggga atggttttag gcctgtttgt aaatctgcca ccaaacagat acataccttg 2700
gaaggagatg ttcatgtgtg gaagtttctc acgttgatgt ttttgccaca gcttttgcag 2760
cgttatactc agatgagtaa catttgctgt tttcaacatt aatagcagcc tttctctcta 2820
tacagctgta gtgtctgaac gtgcattgtg attggcctgt agagttgctg agagggctcg 2880
aggggtgggc tggtatctca gaaagtgcct gacacactaa ccaagctgag tttcctatgg 2940
gaacagtcga agtacgcttt ttgttctggt cctttttggt cgaggagtaa caatacaaat 3000
ggatttgggg agtgactcac gcagtgaaga atgcacacga atggatcaca agatggcgtt 3060
atcaaaccct agccttgctt gttctttgtt ttaatatctg tagtggtgct gactttgctt 3120
gcttttattt tttgcagtaa ctgttagttt ttaagtagtg ttatgttcta gtgaacctgc 3180
tacagcaatt tctgatttct aagaaccgag taatggtgta gaacactaat tcataatcac 3240
gctaattgta atctggagac gtgtaacatt gtgtagcctt ttgtataaat agacagatag 3300
aaatggtccg attagtttcc tttttaatat gcttaaaata agcaggtgga tctatttcat 3360
gtttttgaac aaaaacttta tcggggatac gtgcggtagg gtaaatcagt aagaggtgtt 3420
atttgagcct tgttttggac agtataccag ttgcctttta tcccaaagtt gttgtaacct 3480
gctgtgatac aatgcttcaa cagatgcggt tatagaaatg gttcagaatt aaacttttaa 3540
ttcattcaaa aaaaaaaaaa aaaaa                                       3565
<210>7
<211>3281
<212>DNA
<213>红原鸡(Gallus gallus)
<400>7
ggcacgagag cagcagcagc cggagcccgg ggggacgctg cgctctcgcc tccgtgccac 60
agtctctgaa aggtagcagg aaagagttct gggagcacag caaggaacat ggcaacccaa 120
gctgacttga tggagttgga tatggccatg gagccagaca gaaaagctgc agtcagtcat 180
tggcagcagc agtcatatct ggactctggt atccattccg gtgccacgac aactgctccc 240
tctttgagtg gcaaaggaaa tcctgaagag gaagatgtgg acacaacgca agtcctgtat 300
gagtgggagc aagggttctc tcagtccttt acccaggagc aagttgctga tattgatggc 360
caatatgcaa tgactagagc tcagagagtg ctttctgcta tgttccccga aacactggat 420
gaaggaatgc aaatcccatc cacacaattt gatgctgccc atccaactaa tgtgcagcgc 480
ctggctgagc catcccagat gctaaaacat gctgttgtta atttgataaa ctatcaggat 540
gatgctgaac ttgcaactcg tgcaatccca gaactgacca aactgttgaa tgatgaggac 600
caggtggtgg taaacaaggc tgcggttatg gttcatcagc tatccaaaaa ggaagcatct 660
cgccatgcta ttatgaggtc tcctcaaatg gtatctgcaa ttgtgcgtac catgcaaaat 720
acaaacgatg tggaaacagc ccgctgtact gcaggcacac tacacaatct ctcacatcac 780
cgtgaaggct tgttggcaat cttcaaatca ggaggcatcc ctgcgttggt taaaatgctt 840
gggtctccgg tggattctgt gttgttctat gccattacta ctcttcacaa tctcctgtta 900
catcaggagg gagccaaaat ggctgtccgt ctggctggag ggctgcaaaa aatggttgcc 960
ctgctcaaca agacaaatgt gaaattcttg gccatcacga cagactgtct tcagatttta 1020
gcctatggca atcaagaaag taagctgatt attctggcaa gcggtggacc ccaagctcta 1080
gtaaacataa tgaggaccta cacttatgag aaactattgt ggaccacaag tagggtgctg 1140
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cttgttcagc ttttaggatc agatgacatt aatgttgtga cttgcgctgc cggaatcctt 1380
tctaacctta cttgcaacaa ttacaagaac aagatgatgg tctgccaggt tggtggcatc 1440
gaggctcttg tgcgcacagt tcttcgggct ggagacaggg aagacatcac agaacctgct 1500
atttgtgcgc tccgtcacct caccagcaga catcaggaag ctgaaatggc tcaaaatgca 1560
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cctttgatca aggctactgt tgggttgatt cgcaatctcg cgctctgccc tgcaaaccat 1680
gccccactgc gtgaacaagg tgctatccca cggctagttc agctgctggt tagagcacat 1740
caagataccc agcgacgtac ttccatgggt ggaacgcaac agcagtttgt ggagggtgtg 1800
cgcatggagg aaatcgttga gggctgtact ggagccctgc atattcttgc acgtgatgtt 1860
cacaatcgaa ttgtaatcag gggtctaaat accattccac tatttgtgca gttgttgtac 1920
tcccccattg agaatatcca gagagtagct gcgggtgtac tttgtgaact tgctcaagac 1980
aaggaagcag ctgaagcaat tgaagctgaa ggcggaactg cccctttaac agaactgctt 2040
cattccagga atgagggtgt tgcaacatat gcagctgcag tgctgttcag aatgtcggag 2100
gacaaaccac aagactacaa gaagcgactt tcagttgaac tgacaagctc tctgttccgg 2160
actgagccaa tggcttggaa cgagacagcg gatcttggac ttgacattgg tgcccaggga 2220
gaacctcttg gataccgccc agatgatcct agctaccgtt ctttccactc tggcggatac 2280
ggtcaggatg ccttgggtat ggaccctatg atggaacatg aaatgggtgg ccaccaccct 2340
ggtgctgact acccagttga tggtctgcca gatcttggcc atgcccagga ccttatggat 2400
gggctgcctc caggtgacag taatcagttg gcctggttcg atactgacct gtaaatcatc 2460
ctttagctgt atcatctgaa tgaacttgca ttgattggcc tgtagagttg ctgagagggc 2520
tcgaggggtg ggctagtatc tcagaaagtg cctgacacac taaccaagct gagtttccta 2580
tgggaacaat tgaagtaaac tttttgttct ggtccttttt ggtcgaggag taataataca 2640
aatggatttt gggagtgatt caagaaacga ggaatgcaca agaatgaatt gcaagatgga 2700
atttatcaaa ccctagcctt gcttgttaaa aatttattat tttttttaaa tctctgtaat 2760
ggtactgacc tttgcttgct ttgaaagtag cctttctttt cgcagtaatt gttgttaggg 2820
tttttttttt aagtctctcg tagtattaag ttatagtgaa tatgctacag ccgtttctaa 2880
tttttaagga ttgagtaaag gtgtagaaca ctaattcata atcgctctaa ctgtattctg 2940
aataaagtgt aacattgtgt agcctttttg tataaaaaaa actagacaaa tagaaatggt 3000
ccaattagtt tcctttttaa tatgcttaaa ataagcaggt ggatctattt catgtttttg 3060
atcaaaaact ttatctggat atgtctgggt aggggccagt aagaactgtt tatttggaac 3120
cttgtattgg acagtttacc agttgccttt tatcccaaag ttattgtagc ctgctgtgat 3180
acagatgctt catgagaaaa atgcagttat aaaatggttc aaaattaaag taaactttta 3240
attcaaaaaa aaaaaaaaaa aactcgagag tacttctaga g                     3281
<210>8
<211>3385
<212>DNA
<213>爪蟾(Xenopus laevis)
<400>8
gtggtgtgca tttgttcatg gcttgcatct gaaaggggtc acaaataaaa gcggggaaaa  60
gtaaatcaac gctcttgcca ccacaccccg tccgccttta ggtgggacat cattcgggag  120
ctgcaatatc tggaggcggt gtaggagacg gccagtaccg ggcgaaacac ggtgacggcc  180
ggaaccgggg gacatcgagc cgacggcttg taatccgcaa cctggttctt tggaaacggt  240
tgaaaaatgg caactcaagc agatctaatg gagctggaca tggccatgga gccagaccga  300
aaggcagcag tgagccactg gcagcagcag tcttacctgg attctgggat tcattctgga  360
gcaaccacca cagcaccatc tttgagtggc aaaggaaacc cagaggatga agatgtggat  420
accaaccaag ttttgtatga gtgggagcag ggcttctctc agtccttcac tcaagatcaa  480
gtggctgata ttgatggcca gtatgccatg acaagagccc agcgagttcg tgctgcaatg  540
tttccagaaa cccttgatga aggcatgcag attccatcca cacaatttga ctctgcacac  600
ccaacaaatg tgcaacgttt agcagagcct tcccagatgc tcaaacacgc tgtggtcaac  660
ttgatcaatt accaggatga tgctgaattg gccactcgag caatccccga gctgacgaaa  720
ctgcttaatg acgaggacca ggttgtagtt aacaaggctg ctgtaatggt tcaccagctg 780
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gttcgtacaa tgcagaacac aaatgatgta gagactgcac gatgcactgc gggaacactt 900
cacaaccttt ctcaccatcg tgaaggcttg ttggccatat ttaaatctgg aggcattcct 960
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ctgcacaatc tacttctcca tcaagaagga gcaaaaatgg ctgtacgtct ggctggtggc 1080
ttgcagaaaa tggttgccct tctcaataaa actaatgtca agtttttggc aattacaaca 1140
gactgtcttc aaatattggc ctatggaaat caagaaagca agttgataat tcttgcaagt 1200
gggggaccac aagcgttggt aaatatcatg aggacttaca gttatgagaa acttctgtgg 1260
accacaagtc gggtgcttaa ggtgctatcc gtgtgctcta gcaacaagcc tgctatagtt 1320
gaagctggtg gaatgcaagc tttaggactc catctcacag actcaagcca acgtttggtt 1380
cagaattgtc tttggacact aagaaacctt tcagatgcag caactaaaca ggagggaatg 1440
gaaggtcttc ttgggaccct ggttcagctt cttggatcag atgacattaa tgttgtaact 1500
tgtgcagctg gtatattgtc caacctcacc tgcaacaact acaaaaacaa aatgatggtt 1560
tgtcaagttg gaggcattga agcacttgtt cgcacagttc tacgtgctgg ggatagagaa 1620
gacattactg aacctgcaat ttgtgctctg cgtcacctta ccagcaggca ccaggaagca 1680
gagatggctc aaaatgcagt acgtctccat tatggacttc cagtggtggt gaaactcttg 1740
cacccgcctt cacactggcc tttgataaag gctactgttg gcttgatccg caatcttgcc 1800
ctttgtccag ccaatcatgc tccactgcgt gaacagggtg ccattccccg acttgttcag 1860
ttgcttgttc gtgcacacca ggacacacag aggcgcactt caatgggtgg aacacaacag 1920
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attttggctc gtgacatcca caaccgaatt gtaatcagag gtcttaacac cattccatta 2040
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cctcttactg agctgcttca ctctagaaat gaaggtgttg caacttatgc agctgctgtt 2220
ctgttccgta tgtctgagga caaaccccag gactacaaga agcgtctgtc agttgagttg 2280
accagctctc tcttcaggac cgagccaatg ccatggaatg aggctgcaga ccttggtctt 2340
gatattggtg cccaaggcga acctcttggc tacagacagg atgattcaag ctaccgatct 2400
ttccatgctg ctggctatgg tcaggatgca atgggtatgg actccatgat ggatcatgac 2460
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ctgtagtttg ctgagagggc aggagggggg ctggtaatct cagaaagtgc ctgacacact 2700
aaccaagctg agtttcctat gggaacaacg gaagaaaact ttgttctggt cctttatttg 2760
gtcagaggaa caaaaaccaa tggattttgg aagtgactca catcaagaat gcacaagaat 2820
agttttgcaa gctggaactg atcagaaaca ctagccttgc ttattttaaa ttttattttt 2880
tatttttttt ccttttttta tctgtatggt accaacctcg cttgctttct ttagtatcca 2940
gatttctttt cctttctaag gtaacccaag tctctgtagc gttcagttag tgcataatgc 3000
taaggcagtt ttctcatttt taaggatcaa gtgtagaaca ctaaatcata atcacttatt 3060
gtatcctgaa gtggaacatt gtgtagcttt tttttttttt tttttttttc tttttgtata 3120
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tcaaagcttt tatctggaat gtctgggaag gggccagtaa gaatctcgac ttatttggaa 3240
cctgtaatgg acattttacc agttgccttt tatcccaaag ttattgtact gaagccacag 3300
atgcttaatg aaaatcacat tataatatag ctccgaagaa ttaaagtgga cttttaatgc 3360
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa                                       3385
<210>9
<211>721
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
Gln Val Leu Tyr Glu Trp Glu Gln Gly Phe Ser Gln Ser Phe Thr Gln
 1               5                  10                  15
Glu Gln Val Ala Asp Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gln
            20                  25                  30
Arg Val Arg Ala Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gln
        35                  40                  45
Ile Pro Ser Thr Gln Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn Val Gln Arg
    50                  55                  60
Leu Ala Glu Pro Ser Gln Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu Ile
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Gln Asp Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala Ile Pro Glu Leu
                85                  90                  95
Thr Lys Leu Leu Asn Asp Glu Asp Gln Val Val Val Asn Lys Ala Ala
            100                 105                 110
Val Met Val His Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg His Ala Ile
        115                 120                 125
Met Arg Ser Pro Gln Met Val Ser Ala Ile Val Arg Thr Met Gln Asn
    130                 135                 140
Thr Asn Asp Val Glu Thr Ala Arg Cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn
145                 150                 155                 160
Leu Ser His His Arg Glu Gly Leu Leu Ala Ile Phe Lys Ser Gly Gly
                165                 170                 175
Ile Pro Ala Leu Val Lys Met Leu Gly Ser Pro Val Asp Ser Val Leu
            180                 185                 190
Phe Tyr Ala Ile Thr Thr Leu His Asn Leu Leu Leu His Gln Glu Gly
        195                 200                 205
Ala Lys Met Ala Val Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gln Lys Met Val Ala
    210                 215                 220
Leu Leu Asn Lys Thr Asn Val Lys Phe Leu Ala Ile Thr Thr Asp Cys
225                 230                 235                 240
Leu Gln Ile Leu Ala Tyr Gly Asn Gln Glu Ser Lys Leu Ile Ile Leu
                245                 250                 255
Ala Ser Gly Gly Pro Gln Ala Leu Val Asn Ile Met Arg Thr Tyr Thr
            260                 265                 270
Tyr Glu Lys Leu Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys Val Leu Ser
        275                 280                 285
Val Cys Ser Ser Asn Lys Pro Ala Ile Val Glu Ala Gly Gly Met Gln
    290                 295                 300
Ala Leu Gly Leu His Leu Thr Asp Pro Ser Gln Arg Leu Val Gln Asn
305                 310                 315                 320
Cys Leu Trp Thr Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln Glu
                325                 330                 335
Gly Met Glu Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Gln Leu Leu Gly Ser Asp
            340                 345                 350
Asp Ile Asn Val Val Thr Cys Ala Ala Gly Ile Leu Ser Asn Leu Thr
        355                 360                 365
Cys Asn Asn Tyr Lys Asn Lys Met Met Val Cys Gln Val Gly Gly Ile
    370                 375                 380
Glu Ala Leu Val Arg Thr Val Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp Ile
385                 390                 395                 400
Thr Glu Pro Ala Ile Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gln
                405                 410                 415
Glu Ala Glu Met Ala Gln Asn Ala Val Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro
            420                 425                 430
Val Val Val Lys Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu Ile Lys
        435                 440                 445
Ala Thr Val Gly Leu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His
    450                 455                 460
Ala Pro Leu Arg Glu Gln Gly Ala Ile Pro Arg Leu Val Gln Leu Leu
465                 470                 475                 480
Val Arg Ala His Gln Asp Thr Gln Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr
                485                 490                 495
Gln Gln Gln Phe Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu Ile Val Glu Gly
            500                 505                 510
Cys Thr Gly Ala Leu His Ile Leu Ala Arg Asp Val His Asn Arg Ile
        515                 520                 525
Val Ile Arg Gly Leu Asn Thr Ile Pro Leu Phe Val Gln Leu Leu Tyr
    530                 535                 540
Ser Pro Ile Glu Asn Ile Gln Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu
545                 550                 555                 560
Leu Ala Gln Asp Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Glu Ala Glu Gly Ala
                565                 570                 575
Thr Ala Pro Leu Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala
            580                 585                 590
Thr Tyr Ala Ala Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gln
        595                 600                 605
Asp Tyr Lys Lys Arg Leu Ser Val Glu Leu Thr Ser Ser Leu Phe Arg
    610                 615                 620
Thr Glu Pro Met Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Leu Asp Ile
625                 630                 635                 640
Gly Ala Gln Gly Glu Pro Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asp Pro Ser Tyr
                645                 650                 655
Arg Ser Phe His Ser Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Ala Leu Gly Met Asp
            660                 665                 670
Pro Met Met Glu His Glu Met Gly Gly His His Pro Gly Ala Asp Tyr
        675                 680                 685
Pro Val Asp Gly Leu Pro Asp Leu Gly His Ala Gln Asp Leu Met Asp
    690                 695                 700
Gly Leu Pro Pro Gly Asp Ser Asn Gln Leu Ala Trp Phe Asp Thr Asp
705                 710                 715                 720
Leu
<210>10
<211>781
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>10
Met Ala Thr Gln Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro
 1               5                  10                  15
Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gln Gln Gln Ser Tyr Leu Asp
            20                  25                  30
Ser Gly Ile His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly
        35                  40                  45
Lys Gly Asn Pro Glu Glu Glu Asp Val Asp Thr Ser Gln Val Leu Tyr
    50                  55                  60
Glu Trp Glu Gln Gly Phe Ser Gln Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gln Arg Val Arg Ala
                85                  90                  95
Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gln Ile Pro Ser Thr
            100                 105                 110
Gln Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn Val Gln Arg Leu Ala Glu Pro
        115                 120                 125
Ser Gln Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu Ile Asn Tyr Gln Asp
    130                 135                 140
Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Thr Lys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp Glu Asp Gln Val Val Val Asn Lys Ala Ala Val Met Val His
                165                 170                 175
Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg His Ala Ile Met Arg Ser Pro
            180                 185                 190
Gln Met Val Ser Ala Ile Val Arg Thr Met Gln Asn Thr Asn Asp Val
        195                 200                 205
Glu Thr Ala Arg Cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His His
    210                 215                 220
Arg Glu Gly Leu Leu Ala Ile Phe Lys Ser Gly Gly Ile Pro Ala Leu
225                 230                 235                 240
Val Lys Met Leu Gly Ser Pro Val Asp Ser Val Leu Phe Tyr Ala Ile
                245                 250                 255
Thr Thr Leu His Asn Leu Leu Leu His Gln Glu Gly Ala Lys Met Ala
            260                 265                 270
Val Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gln Lys Met Val Ala Leu Leu Asn Lys
        275                 280                 285
Thr Asn Val Lys Phe Leu Ala Ile Thr Thr Asp Cys Leu Gln Ile Leu
    290                 295                 300
Ala Tyr Gly Asn Gln Glu Ser Lys Leu Ile Ile Leu Ala Ser Gly Gly
305                 310                 315                 320
Pro Gln Ala Leu Val Asn Ile Met Arg Thr Tyr Thr Tyr Glu Lys Leu
                325                 330                 335
Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys Val Leu Ser Val Cys Ser Ser
            340                 345                 350
Asn Lys Pro Ala Ile Val Glu Ala Gly Gly Met Gln Ala Leu Gly Leu
        355                 360                 365
His Leu Thr Asp Pro Ser Gln Arg Leu Val Gln Asn Cys Leu Trp Thr
    370                 375                 380
Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln Glu Gly Met Glu Gly
385                 390                 395                 400
Leu Leu Gly Thr Leu Val Gln Leu Leu Gly Ser Asp Asp Ile Asn Val
                405                 410                 415
Val Thr Cys Ala Ala Gly Ile Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
            420                 425                 430
Lys Asn Lys Met Met Val Cys Gln Val Gly Gly Ile Glu Ala Leu Val
        435                 440                 445
Arg Thr Val Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp Ile Thr Glu Pro Ala
    450                 455                 460
Ile Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gln Glu Ala Glu Met
465                 470                 475                 480
Ala Gln Asn Ala Val Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro Val Val Val Lys
                485                 490                 495
Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu Ile Lys Ala Thr Val Gly
            500                 505                 510
Leu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Arg
        515                 520                 525
Glu Gln Gly Ala Ile Pro Arg Leu Val Gln Leu Leu Val Arg Ala His
    530                 535                 540
Gln Asp Thr Gln Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr Gln Gln Gln Phe
545                 550                 555                 560
Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu Ile Val Glu Gly Cys Thr Gly Ala
                565                 570                 575
Leu His Ile Leu Ala Arg Asp Val His Asn Arg Ile Val Ile Arg Gly
            580                 585                 590
Leu Asn Thr Ile Pro Leu Phe Val Gln Leu Leu Tyr Ser Pro Ile Glu
        595                 600                 605
Asn Ile Gln Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu Leu Ala Gln Asp
    610                 615                 620
Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Glu Ala Glu Gly Ala Thr Ala Pro Leu
625                 630                 635                 640
Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ala
                645                 650                 655
Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gln Asp Tyr Lys Lys
            660                 665                 670
Arg Leu Ser Val Glu Leu Thr Ser Ser Leu Phe Arg Thr Glu Pro Met
        675                 680                 685
Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ala Gln Gly
    690                 695                 700
Glu Ala Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Phe His
705                 710                 715                 720
Ser Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Ala Leu Gly Met Asp Pro Met Met Glu
                725                 730                 735
His Glu Met Gly Gly His His Pro Gly Ala Asp Tyr Pro Val Asp Gly
            740                 745                 750
Leu Pro Asp Leu Gly His Ala Gln Asp Leu Met Asp Gly Leu Pro Pro
        755                 760                 765
Gly Asp Ser Asn Gln Leu Ala Trp Phe Asp Thr Asp Leu
    770                 775                 780
<210>11
<211>781
<212>PRT
<213>红原鸡(Gallus gallus)
<400>11
Met Ala Thr Gln Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro
 1               5                  10                  15
Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gln Gln Gln Ser Tyr Leu Asp
            20                  25                  30
Ser Gly Ile His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly
        35                  40                  45
Lys Gly Asn Pro Glu Glu Glu Asp Val Asp Thr Thr Gln Val Leu Tyr
    50                  55                  60
Glu Trp Glu Gln Gly Phe Ser Gln Ser Phe Thr Gln Glu Gln Val Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gln Arg Val Leu Ser
                85                  90                  95
Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gln Ile Pro Ser Thr
            100                 105                 110
Gln Phe Asp Ala Ala His Pro Thr Asn Val Gln Arg Leu Ala Glu Pro
        115                 120                 125
Ser Gln Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu Ile Asn Tyr Gln Asp
    130                 135                 140
Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Thr Lys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp Glu Asp Gln Val Val Val Asn Lys Ala Ala Val Met Val His
                165                 170                 175
Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg His Ala Ile Met Arg Ser Pro
            180                 185                 190
Gln Met Val Ser Ala Ile Val Arg Thr Met Gln Asn Thr Asn Asp Val
        195                 200                 205
Glu Thr Ala Arg Cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His His
    210                 215                 220
Arg Glu Gly Leu Leu Ala Ile Phe Lys Ser Gly Gly Ile Pro Ala Leu
225                 230                 235                 240
Val Lys Met Leu Gly Ser Pro Val Asp Ser Val Leu Phe Tyr Ala Ile
                245                 250                 255
Thr Thr Leu His Asn Leu Leu Leu His Gln Glu Gly Ala Lys Met Ala
            260                 265                 270
Val Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gln Lys Met Val Ala Leu Leu Asn Lys
        275                 280                 285
Thr Asn Val Lys Phe Leu Ala Ile Thr Thr Asp Cys Leu Gln Ile Leu
    290                 295                 300
Ala Tyr Gly Asn Gln Glu Ser Lys Leu Ile Ile Leu Ala Ser Gly Gly
305                 310                 315                 320
Pro Gln Ala Leu Val Asn Ile Met Arg Thr Tyr Thr Tyr Glu Lys Leu
                325                 330                 335
Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys Val Leu Ser Val Cys Ser Ser
            340                 345                 350
Asn Lys Pro Ala Ile Val Glu Ala Gly Gly Met Gln Ala Leu Gly Leu
        355                 360                 365
His Leu Thr Asp Pro Ser Gln Arg Leu Val Gln Asn Cys Leu Trp Thr
    370                 375                 380
Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln Glu Gly Met Glu Gly
385                 390                 395                 400
Leu Leu Gly Thr Leu Val Gln Leu Leu Gly Ser Asp Asp Ile Asn Val
                405                 410                 415
Val Thr Cys Ala Ala Gly Ile Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
            420                 425                 430
Lys Asn Lys Met Met Val Cys Gln Val Gly Gly Ile Glu Ala Leu Val
        435                 440                 445
Arg Thr Val Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp Ile Thr Glu Pro Ala
    450                 455                 460
Ile Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gln Glu Ala Glu Met
465                 470                 475                 480
Ala Gln Asn Ala Val Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro Val Val Val Lys
                485                 490                 495
Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu Ile Lys Ala Thr Val Gly
            500                 505                 510
Leu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Arg
        515                 520                 525
Glu Gln Gly Ala Ile Pro Arg Leu Val Gln Leu Leu Val Arg Ala His
    530                 535                 540
Gln Asp Thr Gln Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr Gln Gln Gln Phe
545                 550                 555                 560
Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu Ile Val Glu Gly Cys Thr Gly Ala
                565                 570                 575
Leu His Ile Leu Ala Arg Asp Val His Asn Arg Ile Val Ile Arg Gly
            580                 585                 590
Leu Asn Thr Ile Pro Leu Phe Val Gln Leu Leu Tyr Ser Pro Ile Glu
        595                 600                 605
Asn Ile Gln Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu Leu Ala Gln Asp
    610                 615                 620
Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Glu Ala Glu Gly Gly Thr Ala Pro Leu
625                 630                 635                 640
Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ala
                645                 650                 655
Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gln Asp Tyr Lys Lys
            660                 665                 670
Arg Leu Ser Val Glu Leu Thr Ser Ser Leu Phe Arg Thr Glu Pro Met
        675                 680                 685
Ala Trp Asn Glu Thr Ala Asp Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ala Gln Gly
    690                 695                 700
Glu Pro Leu Gly Tyr Arg Pro Asp Asp Pro Ser Tyr Arg Ser Phe His
705                 710                 715                 720
Ser Gly Gly Tyr Gly Gln Asp Ala Leu Gly Met Asp Pro Met Met Glu
                725                 730                 735
His Glu Met Gly Gly His His Pro Gly Ala Asp Tyr Pro Val Asp Gly
            740                 745                 750
Leu Pro Asp Leu Gly His Ala Gln Asp Leu Met Asp Gly Leu Pro Pro
        755                 760                 765
Gly Asp Ser Asn Gln Leu Ala Trp Phe Asp Thr Asp Leu
    770                 775                 780
<210>12
<211>781
<212>PRT
<213>爪蟾(Xenopus laevis)
<400>12
Met Ala Thr Gln Ala Asp Leu Met Glu Leu Asp Met Ala Met Glu Pro
 1               5                  10                  15
Asp Arg Lys Ala Ala Val Ser His Trp Gln Gln Gln Ser Tyr Leu Asp
            20                  25                  30
Ser Gly Ile His Ser Gly Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Leu Ser Gly
        35                  40                  45
Lys Gly Asn Pro Glu Asp Glu Asp Val Asp Thr Asn Gln Val Leu Tyr
    50                  55                  60
Glu Trp Glu Gln Gly Phe Ser Gln Ser Phe Thr Gln Asp Gln Val Ala
65                  70                  75                  80
Asp Ile Asp Gly Gln Tyr Ala Met Thr Arg Ala Gln Arg Val Arg Ala
                85                  90                  95
Ala Met Phe Pro Glu Thr Leu Asp Glu Gly Met Gln Ile Pro Ser Thr
            100                 105                 110
Gln Phe Asp Ser Ala His Pro Thr Asn Val Gln Arg Leu Ala Glu Pro
        115                 120                 125
Ser Gln Met Leu Lys His Ala Val Val Asn Leu Ile Asn Tyr Gln Asp
    130                 135                 140
Asp Ala Glu Leu Ala Thr Arg Ala Ile Pro Glu Leu Thr Lys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp Glu Asp Gln Val Val Val Asn Lys Ala Ala Val Met Val His
                165                 170                 175
Gln Leu Ser Lys Lys Glu Ala Ser Arg His Ala Ile Met Arg Ser Pro
            180                 185                 190
Gln Met Val Ser Ala Ile Val Arg Thr Met Gln Asn Thr Asn Asp Val
        195                 200                 205
Glu Thr Ala Arg Cys Thr Ala Gly Thr Leu His Asn Leu Ser His His
    210                 215                 220
Arg Glu Gly Leu Leu Ala Ile Phe Lys Ser Gly Gly Ile Pro Ala Leu
225                 230                 235                 240
Val Lys Met Leu Gly Ser Pro Val Asp Ser Val Leu Phe Tyr Ala Ile
                245                 250                 255
Thr Thr Leu His Asn Leu Leu Leu His Gln Glu Gly Ala Lys Met Ala
            260                 265                 270
Val Arg Leu Ala Gly Gly Leu Gln Lys Met Val Ala Leu Leu Asn Lys
        275                 280                 285
Thr Asn Val Lys Phe Leu Ala Ile Thr Thr Asp Cys Leu Gln Ile Leu
    290                 295                 300
Ala Tyr Gly Asn Gln Glu Ser Lys Leu Ile Ile Leu Ala Ser Gly Gly
305                 310                 315                 320
Pro Gln Ala Leu Val Asn Ile Met Arg Thr Tyr Ser Tyr Glu Lys Leu
                325                 330                 335
Leu Trp Thr Thr Ser Arg Val Leu Lys Val Leu Ser Val Cys Ser Ser
            340                 345                 350
Asn Lys Pro Ala Ile Val Glu Ala Gly Gly Met Gln Ala Leu Gly Leu
        355                 360                 365
His Leu Thr Asp Ser Ser Gln Arg Leu Val Gln Asn Cys Leu Trp Thr
    370                 375                 380
Leu Arg Asn Leu Ser Asp Ala Ala Thr Lys Gln Glu Gly Met Glu Gly
385                 390                 395                 400
Leu Leu Gly Thr Leu Val Gln Leu Leu Gly Ser Asp Asp Ile Asn Val
                405                 410                 415
Val Thr Cys Ala Ala Gly Ile Leu Ser Asn Leu Thr Cys Asn Asn Tyr
            420                 425                 430
Lys Asn Lys Met Met Val Cys Gln Val Gly Gly Ile Glu Ala Leu Val
        435                 440                 445
Arg Thr Val Leu Arg Ala Gly Asp Arg Glu Asp Ile Thr Glu Pro Ala
    450                 455                 460
Ile Cys Ala Leu Arg His Leu Thr Ser Arg His Gln Glu Ala Glu Met
465                 470                 475                 480
Ala Gln Asn Ala Val Arg Leu His Tyr Gly Leu Pro Val Val Val Lys
                485                 490                 495
Leu Leu His Pro Pro Ser His Trp Pro Leu Ile Lys Ala Thr Val Gly
            500                 505                 510
Leu Ile Arg Asn Leu Ala Leu Cys Pro Ala Asn His Ala Pro Leu Arg
        515                 520                 525
Glu Gln Gly Ala Ile Pro Arg Leu Val Gln Leu Leu Val Arg Ala His
    530                 535                 540
Gln Asp Thr Gln Arg Arg Thr Ser Met Gly Gly Thr Gln Gln Gln Phe
545                 550                 555                 560
Val Glu Gly Val Arg Met Glu Glu Ile Val Glu Gly Cys Thr Gly Ala
                565                 570                 575
Leu His Ile Leu Ala Arg Asp Ile His Asn Arg Ile Val Ile Arg Gly
            580                 585                 590
Leu Asn Thr Ile Pro Leu Phe Val Gln Leu Leu Tyr Ser Pro Ile Glu
        595                 600                 605
Asn Ile Gln Arg Val Ala Ala Gly Val Leu Cys Glu Leu Ala Gln Asp
    610                 615                 620
Lys Glu Ala Ala Glu Ala Ile Glu Ala Glu Gly Ala Thr Ala Pro Leu
625                 630                 635                 640
Thr Glu Leu Leu His Ser Arg Asn Glu Gly Val Ala Thr Tyr Ala Ala
                645                 650                 655
Ala Val Leu Phe Arg Met Ser Glu Asp Lys Pro Gln Asp Tyr Lys Lys
            660                 665                 670
Arg Leu Ser Val Glu Leu Thr Ser Ser Leu Phe Arg Thr Glu Pro Met
        675                 680                 685
Pro Trp Asn Glu Ala Ala Asp Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ala Gln Gly
    690                 695                 700
Glu Pro Leu Gly Tyr Arg Gln Asp Asp Ser Ser Tyr Arg Ser Phe His
705                 710                 715                 720
Ala Ala Gly Tyr Gly Gln Asp Ala Met Gly Met Asp Ser Met Met Asp
                725                 730                 735
His Asp Met Gly Gly His His Pro Gly Ala Asp Tyr Pro Val Asp Gly
            740                 745                 750
Leu Pro Asp Leu Ser His Ala Gln Asp Leu Met Asp Gly Leu Pro Pro
        755                 760                 765
Gly Asp Ser Asn Gln Leu Ala Trp Phe Asp Thr Asp Leu
    770                 775                 780