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中药中马种源性成分的PCR鉴定方法
    【技术领域】

    本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及中药的鉴定技术领域，特别是指一种中药中马种源性成分的PCR鉴定方法，非常适合于深度加工型马种源性产品，尤其是针对因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的马皮胶，操作简单，可用于产品检验部门对市场假冒伪劣的该种中草药的灵敏快速鉴定。

    背景技术

    我国传统中药博大精深，可用作中药的物质种类繁多，其中有一类是利用动物皮、骨熬制而成的胶类中药，包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶等。这些胶类中药十分名贵，是滋阴潜阳、增强体质的上乘佳品。

    阿胶本品为马科动物驴(Equus asinus)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，作为一种名贵中药，它有着2000多年的历史。早在东汉时期就有其药用记载。阿胶性平，其功能主要补血滋阴，润燥、止血。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽唠血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，在临床上，阿胶常用于各类妇科疾病的治疗如痛经、子宫出血、流产和一些慢性病的治疗如失眠、焦虑、眩晕、心烦不安、吐血尿血等。目前，阿胶系列产品已经拓展到药品、食品和保健品领域，它以其良好的功效在“补血”市场上占据着重要地位。

    龟甲胶是以龟科动物乌龟(Chinemys reevesii)的背甲及腹甲为原料，经水煎煮、浓缩制成的固体胶，性成、甘、凉，归肝、肾、心经。能够滋阴、养血、止血，主要用于阴虚潮热、骨蒸盗汗、腰膝酸软、血虚萎黄、崩漏带下等。有研究表明，长期服用龟甲胶有利于增强机体自身调节，能够延年益寿，也利于阴虚阳亢患者的身体康复。

    据2005年版中国药典记载，鹿角胶是用鹿角经水煎煮浓缩制成的固体胶，性甘、成、温，能够温补肝肾，益精养血。用于肝肾不足所致的腰膝酸冷，阳痿遗精，虚劳赢瘦，崩漏下血，便血尿血，阴疽肿痛等。

    由此可见，胶类中药主要用于调节身体机能，滋阴潜阳，增强体质，并且对肾虚，贫血病人具有很好的疗效。因此，该类中药在整个中药市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。

    近些年来，随着胶类中药市场的不断发展，生产胶类中药的厂家也不断增多，生产能力以及产品质量参差不齐。以阿胶为例，由于驴的畜牧价值在不断下降，而其经济价值确未见提高，驴的数量在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，甚至脏皮、烂皮、病死动物之皮等来取代驴皮进行熬制。这类假冒伪劣产品不止没有任何疗效，还对人体危害极大，影响着人们的身心健康。此外，对于其他胶类中药包括龟甲胶、鹿角胶等，也存在类似情况，这些伪品严重阻碍了整个胶类中药市场的健康发展。

    由于胶类中药一旦成形，无论是外观或是色泽等都区别不大，人们难以通过感观水平的差异来对胶类中药进行真伪鉴别，而只能借助生物学鉴定的手段，通过生物学大分子的差异来对真伪胶类中药进行区分。然而，由于驴和马的亲缘关系较近，它们在生物学本质上的差异也是十分有限的，因此，检测胶类中药中的马种源性成分用于区分阿胶和马皮胶变得尤其困难。

    目前，利用DNA分子标记的方法区分驴、马源性成分的相关报道非常有限，并且大都是利用线粒体DNA(Chisholm J，Conyers C，Booth C，Lawley W，Hird H.Thedetection of horse and donkey using real-time PCR.Meat Sci.2005，70：727-732)(Kesmen Z，Sahin F，Yetim H.PCR assay for the identification of animal species incooked sausages.Meat Sci.2007，77：649-653)(Tanabe S，Hase M，Yano T，Sato M，Fujimura T，Akiyama H.A real-time quantitative PCR detection method for pork，chicken，beef，mutton，and horseflesh in foods.Biosci Biotechnol Biochem.2007，71：3131-3135)，其拷贝数有限，比较适合DNA保存完好，或者轻度破坏样品的PCR鉴定。胶类中药大多经过高温高压长时间作用，其DNA含量极少，片段极短，传统的分子标记难以满足这类深加工产品的检测需要。

    定位于马科动物亚中央着丝点染色体着丝粒上的一段马种源性卫星DNA序列是Pauciullo等(Pauciullo，A.，Kubickova，S.，Cernohorska，H.，Petrova，K.，Di Berardino，D.，Ramunno，L.，&Rubes，J.(2006).Isolation and physical localization of newchromosome-specific centromeric repeats in farm animals.Veterinarni Medicina，51，224-231)在研究家畜动物的染色体图谱时发现的，其能够与马中央着丝点染色体着丝粒特异性结合，具有马种动物特异性。它同时属于高度重复序列，拷贝数较线粒体DNA多。

    【发明内容】

    本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种中药中马种源性成分的PCR鉴定方法，该PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定种源性产品的真伪，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型马皮胶的真伪，适于大规模推广应用。

    为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

    一种中药中马种源性成分的PCR鉴定方法，其特点是，包括下列步骤：

    a)提取所述中药中的DNA；

    b)用根据具有马特异性的卫星序列设计的马种源性特异性引物对所述DNA进行PCR扩增，获得扩增产物；

    c)电泳所述扩增产物，通过电泳结果判断所述DNA是否扩增出阳性扩增条带，如果所述DNA扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药源自马种动物，含有马种源性成分；如果所述DNA没有扩增出所述阳性扩增条带，则所述中药并不源自马种动物，也不含有任何马种源性成分。

    较佳地，在步骤a)中，所述中药是深度加工型中药。

    更佳地，所述深度加工型中药是深度加工型马皮源性中药。

    更进一步地，所述深度加工型马皮源性中药是因深度加工而导致DNA含量极少，片段破坏极其严重的马皮胶。

    更佳地，采用消化液和蛋白酶预处理所述深度加工型中药，再采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述DNA。

    较佳地，所述具有马特异性的卫星序列是位于马科动物亚中央着丝点染色体着丝粒上的核苷酸序列。

    更佳地，所述核苷酸序列是GenBank Accesion No.AJ937277代表的序列。

    更进一步地，所述马种源性特异性引物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

    较佳地，所述阳性扩增条带的长度在100bp以下。

    采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否混杂有马种源性成分，从而分辨真伪，且由于其采用基于种属特异性的卫星DNA序列，特异性好，大小适中，并且相对rDNA，mtDNA而言，其拷贝数更高，比较适合DNA破坏严重的样品的PCR检测。因此，尽管深度加工型胶类中药DNA含量极少，破坏极其严重，但本发明基于卫星DNA的PCR检测方法完全能够达到检测目的，并且能够将亲缘关系较近的驴源性成分和马种源性成分进行区分。此外，本发明并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测，操作简单、成本低、灵敏快速、能有效鉴定深度加工型胶类中药产品的真伪。

    【附图说明】

    图1是采用基于马特异性卫星DNA序列设计的马种源性成分特异性引物进行PCR反应获得的扩增产物电泳图，用于检测各种肉源性成分中的马种源性成分。其中，1.空白对照，2.驴肉基因组DNA，3.马肉基因组DNA，4.牛肉基因组DNA，5.猪肉基因组DNA，6.龟肉基因组DNA，7.鹿肉基因组DNA，M.DNA Marker。

    图2是采用基于马特异性卫星DNA序列设计的马种源性特异性引物进行PCR反应获得的扩增产物电泳图，用于检测各种胶类中药中的马种源性成分。其中M.DNAMarker，1.阳性对照(马基因组DNA)，2.阿胶DNA，3.马皮胶DNA，4.牛皮胶DNA，5.猪皮胶DNA，6.空白对照。

    图3是采用基于马特异性卫星DNA序列设计的马种源性特异性引物进行PCR反应获得的扩增产物的测序比对结果，用于验证扩增产物的可靠性。其中1.马肉基因组扩增产物，2.马皮胶DNA扩增产物，3.马种源性特异性卫星DNA序列(GenBank AccesionNo.AJ937277)片段。

    【具体实施方式】

    为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

    本发明以鉴定马皮胶为例，为了检测胶类中药中可能混杂的马种源性成分，并与其他各类动物源性成分进行区分，基于马科动物亚中央着丝点染色体着丝粒上一段马种源性特异性卫星DNA序列(GenBank Accesion No.AJ937277)优化设计引物如下：

    根据马种源性特异性卫星DNA序列设计引物，理论目标条带大小78bp，用于检测胶类中药的马种源性成分。其序列如下：

    上游引物Horse up：SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列

    下游引物Horse down：SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列

    各实施例提取胶类中药的DNA的具体步骤如下：

    1、胶类中药的预处理：将胶块锤击成颗粒状，取出若干加入一只50ml无菌离心管中，并向其中加入消化缓冲液，该缓冲液pH 8.0，由10mmol/L Tris-HCl，25mmol/LEDTA，100mmol/L NaCl，0.5％SDS构成，然后将离心管置于50℃-60℃水浴中保温，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。待溶液冷却至室温后，加入蛋白酶K溶液，混匀，56℃保温1小时，其间不时轻微摇匀。

    2、胶类中药DNA的提取：向上述胶类中药预处理液中加入PN缓冲液，混匀，分若干次加入硅吸附柱中，离心，将溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱中加入PE缓冲液洗涤吸附柱膜，除去附着在膜上的少量蛋白及脂类物质，完毕之后用热的pH 8.0的TE缓冲液将吸附柱膜上的DNA洗脱收集下来并置于-20℃保存。提取得到的DNA可用紫外分光光度法定量。

    上述提取操作过程中所用试剂、耗材皆来自商业化试剂(德国QIAGEN公司)，包括PN缓冲液(Cat.No.19071)、PE缓冲液(Cat.No.19065)、硅吸附柱(Cat.No.28304)。

    用上述方法提取得到各个胶类制品DNA样之后，利用上述引物进行常规的PCR操作，将产物加于2％-3％的添加了荧光染料的琼脂糖凝胶中电泳，紫外下观察，根据是否出现阳性扩增条带判断待检测样品中是否含有马种源性成分，从而完成对这些样品的检测。

    实施例1检测各种肉基因组中所含有的马种源性成分

    1材料和试剂

    材料：各种肉类包括驴、马、牛、猪、龟、鹿的基因组DNA提取液(1ng/μL)。

    试剂：PCR预混酶Premix Ex-Taq^TM Hot Start Version：(购于TAKARA，Cat.No.DRR030A)；DNA荧光染料10000×GelRed^TM：DNA荧光染料(购于Biotium，Cat.No.41000)。

    2检测方法

    取各种肉基因组DNA提取液备用，使用根据具有马种源性成分特异性的卫星DNA序列所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10μM备用。25μL反应体系的具体加样情况如下：

    Premix Ex-Taq^TM Hot Start Version 12.5μL，引物Horse up 0.5μL，引物Horse down0.5μL，基因组DNA提取液1μL，无菌双蒸水10.5μL；

    (在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4μM，各种肉类DNA模板量1ng。)

    扩增条件：94℃6min；94℃30s，50℃30s，72℃30s(30循环)；72℃7min；4℃∞。

    PCR操作结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备2.5％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料GelRed^TM。按照比例将10μl的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。

    结果见图1，由于引物根据马种源性成分特异性卫星DNA序列来设计，泳道3具有阳性条带，而其它泳道均没有出现阳性条带，可见该方法能够特异性检测马种源性成分，而与其他各种动物源性成分包括驴、牛、猪、龟、鹿等进行区分。

    实施例2检测胶类中药中所含有的马种源性成分

    1材料和试剂

    材料：阿胶(山东东阿股份有限公司生产)DNA提取液(10ng/μL)；马皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用马皮熬制)DNA提取液(10ng/μL)；黄明胶(山东东阿股份有限公司研究所采用牛皮熬制)DNA提取液(10ng/μL)；猪皮胶(山东东阿股份有限公司研究所采用猪皮熬制)DNA提取液(10ng/μL)。

    试剂：PCR预混酶Premix Ex-Taq^TM Hot Start Version：(购于TAKARA，Cat.No.DRR030A)；DNA荧光染料10000×GelRed^TM：DNA荧光染料(购于Biotium，Cat.No.41000)。

    2检测方法

    取各种胶DNA提取液(10ng/μL)备用，使用根据马种源性特异性卫星DNA序列所设计的引物进行PCR反应，引物用无菌水溶解至浓度10μM备用。25μL反应体系的具体加样情况如下：

    Premix Taq^TM Hot Start Version 12.5μL，引物Horse up 0.5μL，引物Horse down0.5μL，模板5μL，无菌双蒸水6.5μL；

    (在该反应体系中，上游及下游引物终浓度皆0.4μM，待检测胶类DNA模板量50ng。)

    扩增条件：94℃6min；94℃30s，50℃30s，72℃30s(40循环)；72℃7min；4℃∞。

    PCR操作结束后，用1×TAE电泳缓冲液制备2.5％琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料GelRed^TM。按照比例将10μl的PCR产物与上样缓冲液均匀混合，加入凝胶孔中，选择合适的电压(4V/cm-10V/cm)进行电泳，电泳时间为40-60分钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。

    结果见图2，由于引物根据马种源性特异性卫星DNA序列设计，所以泳道1，泳道3都具存阳性条带，可见尽管由胶类中药中得到的DNA含量极少，利用针对马种源性成分特异性卫星DNA序列设计的引物，通过PCR能够检测出胶类制品中的马种源性成分，而在其它样品中没有扩增出阳性条带。接着对该实施例中的马基因组扩增产物以及马皮胶扩增产物进行连接载体并测序，将所得到的测序结果进行比对，结果见图3，同源性良好，并且与所设计的产物序列相符，进一步验证了检测结果的可靠性。因此利用这种方法能够特异性识别胶类中药中的马源性成分，实现了胶类中药中马源性成分与驴源性成分的区分。

    上述试验结果表明，针对马种源性成分特异性卫星DNA序列设计引物，以马皮胶DNA提取液作模板，确实能够得到清晰的条带。尽管该马种源性成分特异性卫星DNA序列从未被用于实际加工产品的马种源性特异性检测，但由于它具有马种动物特异性，同时属于高度重复序列，拷贝数较线粒体DNA多，根据该序列设计引物，通过PCR检测完全有可能特异性检测到深度加工型胶类中药中的马种源性成分。因此，利用该序列能够识别马源性成分，并与阿胶中的驴源性成分进行区分，从而实现胶类中药的真伪鉴别。

    卫星DNA序列相对rDNA及mtDNA而言，拷贝数高，特异性好。所以，本发明对待检测样品的初始DNA模板质量要求较低，尽管从深度加工胶类中药中提取得到的DNA浓度极低，破坏极其严重，但是，利用本发明进行检测，依然能够得到较为理想的结果。本发明的基于马种源性成分特异性卫星DNA序列的PCR检测方法能够适用于深度加工的各类胶类中药的马种源性成分检测，实现了马皮胶与阿胶的鉴别。这也是本发明最大的特点和优势。并且该法并不需要十分昂贵的仪器和繁琐的操作，常规PCR即可完成检测。

    因此，这种基于马种源性成分特异性卫星DNA序列所构建的深度加工型产品检测方法是从深度加工型胶类中药中鉴定马种源性成分的关键。这一点在利用分子生物学技术鉴别深度加工型胶类中药的领域意义重大，它首次实现了阿胶与马皮胶的区分鉴别。目前特异性检测胶类中药中马种源性成分的分子鉴别技术国内外尚未见报道。

    综上所述，本发明的中药中马种源性成分的PCR鉴定方法操作简单、灵敏快速、成本低、能有效鉴定种源性产品的真伪，有效区分马皮胶与阿胶，特别适用于鉴定因深度加工而导致DNA含量极少、片段极短的深度加工型马皮胶的真伪，适于大规模推广应用。

    在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

    【序列表】

    <110>华东理工大学，山东东阿阿胶股份有限公司

    <120>中药中马种源性成分的PCR鉴定方法

    <160>2

    <210>1

    <211>20

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <221>misc_feature

    <222>(1)...(20)

    <223>根据马科动物亚中央着丝点染色体着丝粒的马种源性特异性卫星DNA

         序列(GenBank Accesion No.AJ937277)设计的上游引物

    <400>1

    cacttgaact acagctcagc      20

    <210>2

    <211>18

    <212>DNA

    <213>人工序列

    <220>

    <221>misc_feature

    <222>(1)...(18)

    <223>根据马科动物亚中央着丝点染色体着丝粒的马种源性特异性卫星DNA

         序列(GenBank Accesion No.AJ937277)设计的下游引物

    <400>2

    gtggttccgt catagcag        18