《一种细菌耐氯性的评估方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种细菌耐氯性的评估方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811024489.0 (22)申请日 2018.09.04 (71)申请人 山东省城市供排水水质监测中心 地址 250101 山东省济南市高新区奥体中 路5111号 (72)发明人 贾瑞宝孙韶华褚福敏逯南南 王明泉 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 马祥明 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) (54)发明名称 一种细菌耐氯性的评估。
2、方法 (57)摘要 本发明公开了一种细菌耐氯性的评估方法， 包括采用贫营养驯化技术对菌株进行处理， 然后 对驯养后的菌液计数、 稀释、 消毒， 通过测定不同 作用时间点的消毒剂余量以及细菌存活数量， 通 过消毒公式计算细菌灭活率为99的CT值， 并与 参照菌株大肠埃希氏菌CT值大小比较， 实现对试 验菌株的耐氯性评价。 本发明包含菌株的复苏、 驯养、 菌液的制备以及消毒实验参数的设计和标 准的实验流程， 量化了实际水体中细菌的耐氯能 力， 为饮用水的微生物安全评估以及耐氯微生物 风险控制提供更准确的理论依据， 为水厂消毒工 艺的改进提供支撑， 从而更好的保证饮用水的生 物安全性。 权利要求书1。
3、页 说明书4页 附图3页 CN 109182169 A 2019.01.11 CN 109182169 A 1.一种细菌耐氯性的评估方法， 其特征在于， 采用菌株贫营养驯养处理静态消毒 实验灭活特性分析方法测定细菌灭活率为99的CT值， 其方法步骤如下： (1)驯养： 将冻存管中保存的菌液加入营养肉汤中， 震荡培养， 对冻存的菌株进行复苏； 取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中， 置于培养箱中培养； (2)菌浓度计数： 将驯养后的菌液进行梯度稀释， 选10-3、 10-4、 10-5稀释倍数采用营养琼 脂倾注平板法对样品进行计数， 37培养24h， 计数平板上菌落数， 乘以对应的稀。
4、释倍数， 即 为驯养后的菌液浓度； (3)静态消毒实验： 根据步骤(2)中计数的菌液浓度， 用管网水对其进行稀释， 制备成菌 浓度为105CFU/mL107CFU/mL的样品， 加入消毒剂进行消毒实验； 分别计数消毒剂加入 0min、 5min、 10min、 20min、 30min、 60min、 120min、 240min后的细菌存活数量及消毒剂余量； (4)CT值计算： 采用线性回归方法计算细菌灭活率为99CT值， 计算公式为： 式中： N-反应时间为t时的细菌存活量， CFU/mL； N0-灭菌之前的细菌浓度， CFU/mL； k-反应速率常数； t-反应时间， min； c-消毒。
5、剂浓度， mg/L； CT值以消毒剂浓度(mg/L)和反应时间(min)的乘积表示， CT值表示消毒剂的消毒效果， CT值越小， 消毒剂的消毒效果越好； (5)耐氯性评价： 以大肠埃希氏菌标准菌株作为参照菌株， 若待评价菌株灭活率为99 CT值小于大肠埃希氏菌菌株灭活率为99CT值， 评价为无耐氯性； 若待评价菌株灭活率为 99CT值大于大肠埃希氏菌菌株灭活率为99CT值， 依据灭活率为99CT值得大小评价其 耐氯性强弱， 灭活率为99CT值越大， 其耐氯性越强。 2.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的评估方法， 其特征在于， 步骤(1)中冻存菌株复 苏条件为加入5mL营养肉汤， 37震荡培养2。
6、4h； 菌液采用管网水驯养， 22培养7d。 3.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的评估方法， 其特征在于， 所述管网水的pH值为 7.27.4。 4.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的评估方法， 其特征在于， 步骤(3)所述消毒剂的 投加浓度为相当于2.5mg/L余氯浓度。 5.根据权利要求1所述的细菌耐氯性的评估方法， 其特征在于， 步骤(5)耐氯性评价中 所述的参照菌株为大肠埃希氏菌标准菌株ATCC8739， 菌株来源为中国工业微生物菌种保藏 管理中心。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109182169 A 2 一种细菌耐氯性的评估方法 技术领域 0001 本发明涉及一种细菌耐氯性的评估。
7、方法， 尤其是针对水系统中分离的耐氯菌。 背景技术 0002 消毒剂的使用已有相当长的历史， 正如细菌对抗生素的耐药性一样， 长时间接触 同一种(类)消毒剂的细菌会对该类消毒剂产生抵抗力， 即产生抗性。 随着人类社会的发展 以及人们健康意识的不断增强， 消毒用品的使用越来越广泛， 细菌对消毒剂的抗性问题也 就越加严重， 这已引起人们的广泛关注与重视。 目前人们对消毒剂抗性还没有一个统一的 定义， 其中最能被人们接受的是Russell等就细菌对消毒剂的抗性判断标准所作的描述， 即 细菌消毒剂抗性是指对消毒剂的常用浓度不再敏感的菌株的出现， 也指那些在能杀灭或抑 制大部分该种细菌的消毒剂浓度下， 。
8、不能被杀灭或抑制的菌株的出现， 这种现象称为细菌 对消毒剂有一定的耐受性， 即消毒剂抗性。 细菌对消毒剂抗性的产生不仅会使消毒剂的消 毒效果削减甚至失效， 从而使国民经济蒙受巨大损失,而且还会严重影响人类健康。 0003 由于氯的消毒效率高、 稳定性好、 易于使用、 成本低廉等优势， 氯仍然是全世界使 用最广泛的消毒剂。 某些细菌可以在含有一定余氯浓度的净水厂、 供水管网中存活， 这些对 氯具有耐受性的细菌就可以称作 “耐氯菌” (chlorine-resistant bacteria)。 Langsrud等 人对耐氯菌作了一个相对更理论化的定义， 如果某个(或某种)微生物能够比其他微生物在 。
9、更高的氯消毒剂中存活或生长， 这就说明该微生物具有更高的耐氯性， 可以称为耐氯菌。 然 而， 因为消毒效率跟测试的条件、 方法密切相关， 因此， 在科学的范畴上， 耐氯菌的耐受性只 是一个相对的概念， 并不是一个准确的术语。 0004 由于细菌生存环境以及自身生理结构的差异性， 都可能影响其耐氯性， 针对供水 管网中普遍存在的耐氯菌问题， 有必要分析测定不同细菌的灭活特性， 进而实现对细菌耐 氯性的评估， 为供水水厂消毒技术的优选及耐氯菌的控制提供理论支撑及可行性建议。 发明内容 0005 在进行水中分离到的耐氯菌耐氯性研究的过程中发现， 细菌经过多次传代培养后 其耐氯性出现退化的现象， 实验。
10、的可重复性较差， 细菌的耐氯性量化评估困难等问题。 0006 本发明的目的在于提供一种细菌耐氯性的评估方法， 为供水水厂消毒技术的优选 及耐氯菌的控制提供理论支撑及可行性建议。 0007 本发明是通过以下措施实现的： 本发明先对细菌进行贫营养驯化， 再对驯化后的 样品进行异养菌计数(HPC)， 制备适宜菌浓度的污染样品， 然后进行设计好的消毒实验程 序， 最终计算细菌被99灭活的CT值， 通过与参照菌株的CT值比较， 实现对细菌耐氯性的评 估。 其具体技术方案如下： 0008 一种细菌耐氯性的评估方法， 包括采用贫营养驯化技术对菌株进行处理， 然后对 驯养后的菌液计数、 稀释、 消毒， 通过测。
11、定不同作用时间点的消毒剂余量以及细菌存活数 量， 通过消毒公式计算细菌灭活率为99的CT值， 并与参照菌株大肠埃希氏菌CT值大小比 说明书 1/4 页 3 CN 109182169 A 3 较， 实现对试验菌株的耐氯性评价。 具体实施步骤如下： 0009 (1)驯养： 将冻存管中保存的菌液加入5mL营养肉汤中， 37震荡培养24h， 对冻存 的菌株进行复苏。 取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中， 管网水pH 7.27.4， 置 于22培养箱中培养7d； 0010 (2)菌浓度计数： 将驯养后的菌液进行梯度稀释， 选10-3、 10-4、 10-5稀释倍数采用营 养琼脂倾注平板法对。
12、样品进行计数， 37培养24h， 计数平板上菌落数， 乘以对应的稀释倍 数， 即为驯养后的菌液浓度； 0011 (3)静态消毒实验： 根据(2)中计数的菌液的浓度， 用pH 7.27.4的管网水对样品 进行稀释， 制备成菌浓度为105CFU/mL107CFU/mL的样品进行消毒实验。 制备好的样品中加 入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂， 分别计数消毒剂加入0min、 5min、 10min、 20min、 30min、 60min、 120min、 240min后的细菌存活数量及消毒剂余量； 0012 (4)CT值的计算： 采用线性回归的方法计算细菌灭活率为99CT值， 计算公式为： 001。
13、3 0014 其中： N-反应时间为t时的细菌存活量， CFU/mL； 0015 N0-灭菌之前的细菌浓度， CFU/mL； 0016 k-反应速率常数； 0017 t反应时间， min； 0018 c消毒剂浓度， mg/L； 0019 CT值以消毒剂浓度(mg/L)和反应时间(min)的乘积表示， 以CT值表示消毒剂的消 毒效果， CT值越小， 消毒剂的消毒效果越好。 0020 (5)耐氯性评价： 消毒过程中选大肠埃希氏菌标准菌株作为参照菌株， 若待评价菌 株灭活率为99CT值小于大肠埃希氏菌菌株灭活率为99CT值， 评价为无耐氯性； 若待评 价菌株灭活率为99CT值大于大肠埃希氏菌菌株灭活。
14、率为99CT值， 依据CT值的大小评价 其耐氯性强弱， 灭活率为99CT值越大， 其耐氯性越强。 0021 所述的参照菌株为大肠埃希氏菌标准菌株(ATCC8739)， 菌株来源为中国工业微生 物菌种保藏管理中心(CICC)。 0022 本发明的有益效果： 0023 本发明包含菌株的复苏、 驯养、 菌液的制备以及消毒实验参数的设计和标准的实 验流程， 量化了实际水体中细菌的耐氯能力， 为饮用水的微生物安全评估以及耐氯微生物 风险控制提供更准确的理论依据， 为水厂消毒工艺的改进提供支撑， 从而更好的保证饮用 水的生物安全性。 附图说明 0024 图1为消毒剂衰减曲线图； 0025 图2为大肠埃希氏。
15、菌灭活特性曲线； 0026 图3为烂泥假单胞菌灭活特性曲线； 0027 图4为土地戈登氏菌灭活特性曲线； 0028 图5为烂泥假单胞菌灭活率与CT值拟合曲线。 说明书 2/4 页 4 CN 109182169 A 4 具体实施方式 0029 下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的阐述， 但下述说明仅是为了解释本 发明， 并不对其内容进行限定。 0030 实施例1 0031 以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)为参照菌株， 测定其被2.5mg/L的余氯灭活 99CT值的情况： 0032 将冻存管中保存的大肠埃希氏菌(ATCC8739， 菌株来源为中国工业微生物菌种保 藏管理中心C。
16、ICC)加入5mL营养肉汤中， 37震荡培养24h， 对冻存的菌株进行复苏。 取1mL复 苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中， 置于22培养箱中培养7d； 将驯养后的菌液进行梯 度稀释， 选10-3、 10-4、 10-5稀释倍数采用营养琼脂倾注平板法对样品进行计数， 37培养 24h， 计数平板上菌落数， 乘以对应的稀释倍数， 即为驯养后的菌液浓度。 根据计数浓度， 对 样品进行稀释， 制备成菌浓度为105CFU/mL107CFU/mL的样品进行消毒实验。 制备好的样品 中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂， 分别计数消毒剂加入0min、 5min、 10min、 20min、 30m。
17、in、 60min、 120min、 240min后的细菌存活数量及消毒剂余量， 大肠埃希氏菌灭活特性曲 线见图2； 利用公式1采用线性回归的方法计算大肠埃希氏菌(Escherichia coli)灭活率为 99的CT值为： 2.73mgmin/L 0033 实施例2 0034 以某水厂生物砂中分离到的烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)为例， 测定其被 2.5mg/L的余氯灭活99CT值， 评价其耐氯性： 0035 将冻存管中保存的烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)加入5mL营养肉汤中， 37 震荡培养24h， 对冻存的菌株进行复苏。 取1mL复苏后的菌液加入500。
18、mL灭菌的管网水中， 置 于22培养箱中培养7d； 将驯养后的菌液进行梯度稀释， 选10-3、 10-4、 10-5稀释倍数采用营 养琼脂倾注平板法对样品进行计数， 37培养24h， 计数平板上菌落数， 乘以对应的稀释倍 数， 即为驯养后的菌液浓度。 根据计数浓度， 对样品进行稀释， 制备成菌浓度为105CFU/mL 107CFU/mL的样品进行消毒实验。 制备好的样品中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂， 分别 计数消毒剂加入0min、 5min、 10min、 20min、 30min、 60min、 120min、 240min后的细菌存活数量 及消毒剂余量； 利用公式1采用线性回归的。
19、方法计算细菌灭活率为99的CT值为： 36.3mg min/L。 0036 烂泥假单胞菌拟合消毒曲线所需数据见表1， 图1所示为消毒剂衰减曲线、 图3所示 为灭活特性曲线、 图5所示为为烂泥假单胞菌灭活率与CT值拟合曲线。 0037 由计算可知， 烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)灭活99的CT值大于大肠埃希氏 菌灭活99的CT值， 有一定的耐氯性。 0038 表1烂泥假单胞菌拟合曲线所需数据 0039 时间t(min)余氯c(mg/L)CT(mgmin/L)ln(N/N0) 51.256.25-2.45 101.111-2.75 200.5911.8-3.11 300.618-。
20、2.96 说明书 3/4 页 5 CN 109182169 A 5 600.7746.2-4.83 1200.5768.4-8.95 2400.48115.2-8.68 0040 实施例3 0041 以某管网水中分离到的土地戈登氏菌(Gordonia terrae)为例， 测定其被2.5mg/L 的余氯灭活99CT值， 评价其耐氯性： 0042 将冻存管中保存的土地戈登氏菌(Gordonia terrae)加入5mL营养肉汤中， 37震 荡培养24h， 对冻存的菌株进行复苏。 取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中， 置于 22培养箱中培养7d； 将驯养后的菌液进行梯度稀释， 选10。
21、-3、 10-4、 10-5稀释倍数采用营养 琼脂倾注平板法对样品进行计数， 37培养24h， 计数平板上菌落数， 乘以对应的稀释倍数， 即为驯养后的菌液浓度。 根据计数浓度， 对样品进行稀释， 制备成菌浓度为105CFU/mL 107CFU/mL的样品进行消毒实验。 制备好的样品中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂， 分别 计数消毒剂加入0min、 5min、 10min、 20min、 30min、 60min、 120min、 240min后的细菌存活数量 及消毒剂余量； 利用公式1采用线性回归的方法计算细菌灭活率为99的CT值为： 551mg min/L。 0043 土地戈登氏菌(Gordonia terrae)消毒剂衰减曲线见图1， 灭活特性曲线见图4。 0044 由计算可知， 土地戈登氏菌(Gordonia terrae)灭活99的CT值大于大肠埃希氏 菌灭活99的CT值， 有耐氯性， 且其耐氯性大于烂泥假单胞菌。 说明书 4/4 页 6 CN 109182169 A 6 图1 图2 说明书附图 1/3 页 7 CN 109182169 A 7 图3 图4 说明书附图 2/3 页 8 CN 109182169 A 8 图5 说明书附图 3/3 页 9 CN 109182169 A 9 。