一、技术领域
本发明涉及的是一种提纯方法，具体地说是一种甜叶菊糖苷的提纯方法。
二、背景技术
目的意义：工业生产中甜味剂主要有三大类：
第一类是为化工合成产品：糖精、甜蜜素、阿斯巴甜等；
第二类是化学改性的天然植物性糖，如木糖醇、甘露糖醇；
第三类是天然植物性糖。天然植物性糖又包括有能量代谢(蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄 糖等)，无能量代谢(甘草糖苷、甜叶菊糖苷等)。
随着人类生活水平的不断提高，人们更加倾向于使用安全性较高的天然产物：甘草糖苷 和甜叶菊糖苷，因此在未来的生活中甘草糖苷和甜叶菊糖苷有较广阔的应用前景。
甜叶菊糖苷具有如下的特点：
1、甜叶菊糖苷甜度高，与糖苷浓度有关，大约为蔗糖的250～450倍，甜味接近于蔗糖， 可代替糖精和部分蔗糖；甜叶菊糖苷主要有8种成分组成，其中Stevioside和 Rebaudioside成分达到90％以上，而且Rebaudioside甜味最接近于蔗糖。
2、低热量，其热量大约为蔗糖的1/300，稳定性好，其在人体内不参与代谢。
3、无毒性的特点，大量的动物实验证明了甜叶菊糖苷无毒性，1970年开始，日本将从甜 叶菊中叶片中提取甜叶菊糖苷作为了甜味剂在食品、保健品、药品等行业广泛应用。
4、还有报道甜叶菊糖苷对糖尿病、小儿龋齿、肥胖症、高血压、心脏病有一定防治功能 和辅助疗效。
2004年8月，JECFA在第63次会议上认可了甜叶菊提取物使用的试行案。该试行案允 许甜叶菊糖苷作为甜味剂使用，认为成人每天的安全摄取甜叶菊糖苷量为2mg/kg。该试行案 的实施意味着：甜叶菊糖苷的应用将从部分地区走向世界。但是JECFA认为作为甜味剂的甜 叶菊糖苷纯度必须在95％以上；目前在中国生产的甜叶菊糖苷纯度只有80％，还没有达到该 试行案的要求。
三、发明内容
本发明的目的在于提供一种可以将甜叶菊糖苷的纯度达到95％以上，使甜叶菊糖苷的浓 度可以达到药用标准的高纯度甜叶菊糖苷的制备方法。
本发明的目的是这样实现的：
1、Al2O3柱层析法纯化
(1)Al2O3的前处理：称取一定重量的Al2O3，经5％的HCL浸泡12h后，用蒸馏水洗 至中性，湿法装柱，径高比为1∶10；
(2)上样：称取80℃下烘至恒重的纯度为80％甜叶菊糖苷粗干粉，粗干粉高度为Al2O3高度的1/5；
(3)洗脱和定性检测：用第一次柱层析的第一次流动相即丙酮∶石油醚＝1∶1进行洗脱， 自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测，至无红色为止；改用用第 一次柱层析的第二次流动相即100％乙醇进行洗脱，同时用自动部分收集器进行收集；对洗脱 液进行硫酸显色定性检测，至无粉红色为止；
2.浓缩：收集第一次柱层析的第二次流动相洗脱液，进行浓缩；
3.硅胶柱层析法纯化
(1)装柱：称取一定重量的硅胶，用水浸泡后湿法装柱，径高比为1∶10；
(2)上样：将第2步的浓缩液体上样，上样量为硅胶柱高度的1/10；
(3)洗脱：用第二次柱层析的流动相即20％乙醇进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差为 1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测，从粉红色出现到无粉红色为止，收集该段洗脱液得到 本发明的产品。
本发明的产品可以通过这样的方法来定性、定量检测：
(1)甜叶菊糖苷的定性检测法----硅胶薄层层析：用0.1mol/L的硼酸溶液调浆制硅胶板， 展开体系：(正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1)；显色剂：50％的硫酸。本方法能够将 甜叶菊糖苷中的两种主要单体成分(St和RA)、麦芽糖、葡萄糖区分开。
(2)甜叶菊糖苷的定量检测有5种方法参考。
A.分光光度计可见光法。郝再彬申请的专利：快速测定甜叶菊糖苷含量的方法和专用 试剂，专利申请号：200510010277.3；专利公开号：CN1731144A；2006年2月8日公示，见 发明专利公报2006，22(06)：311；
B.流动注射化学发光法。杨丹，郝再彬(2005)，化学工程师04：23～25；
C.铁氰化钾-鲁米诺流动注射化学发光法。郝再彬申请的专利(正在申请中)；
D.高压液相色谱紫外检测法。坂牧成惠等(2004)。食品卫生志(日文)。45(2)： 81～86；
E.毛细管电泳紫外检测法等方法。邵寒娟，胡涌刚(2001)。植物学通报，18(1)： 113～117。
高纯度药用甜叶菊糖苷的定义：高纯度的含量为95％-98％；同时达到JECFA认可的甜 叶菊提取物使用的试行案中纯度必须在95％以上的要求。[注：2004年8月世界卫生组织和 联合国粮组织(WHO/FAO)所属的食品添加剂专家委员会(JECFA)在第63次会议上认可了 甜叶菊提取物使用的试行案，纯度必须在95％以上的要求]。
药用：符合中华人民共和国药典的要求。
本发明所基于的原理为：吸附层析就是利用吸附剂这种吸附能力可受溶媒影响而发生改 变的性质，在样品中的物质被吸附剂吸附后，用适当的洗脱液冲洗，改变吸附剂的吸附能力， 使被吸附的物质解吸，随洗脱液向前移动。经过反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的过程， 物质即可沿洗脱液的前进方向移动，其移动速度取决于当时条件下吸附剂对该物质的吸附能 力。若吸附剂对物质的吸附能力强，该物质向前移动的速度慢；反之，若吸附能力弱，其移 动速度快。由于吸附剂对样品中个组分的吸附能力不同，所以在洗脱过程中个组分便会由于 移动速度不同而逐渐的分离开来，这就是吸附层析的基本原理。
经本发明的方法可使甜叶菊糖苷的含量由80％提高到95％--98％，起到精细加工的目的， 为我国生产的高纯度甜叶菊糖苷走向国际市场奠定了基础。这对于改变我国是甜叶菊糖苷生 产大国，而不是生产强国的局面；对于中国的甜叶菊糖苷工业生产的未来，具有一定的理论 意义和实际应用价值。
第一次层析以Al2O3为固定相，用第一次层析流动相洗脱，可去除葡萄糖、麦芽糖、蛋 白质、色素等大分子的杂质，收集部分洗脱液后进行浓缩进行第二次层析。第二次层析以硅 胶为固定相，用第二次层析流动相洗脱，可去除其他等杂质，收集部分洗脱液后进行浓缩进 行经检测甜叶菊糖苷含量可达到95％--98％。
本发明的制备高纯度甜叶菊糖苷的方法，可使甜叶菊糖苷的含量达到98％，达到了JECFA 的要求，具有一定的理论意义和较高的实际应用价值。
四、附图说明
图1是甜叶菊糖苷的结构式，其中R是H时为St、R是葡萄糖时为RA；
图2是几种糖的显色反应，其中：1.St；2.RA；3.麦芽糖；4.葡萄糖；
图3几种糖的薄层层析图，其中：1.St；2.RA；3.葡萄糖；4.麦芽糖。
五、具体实施方式
下面对本发明做更详细的描述：
1.材料：甜叶菊糖苷粗粉。
2.仪器设备：
BT124S万分之一电子天平；
玻璃层析柱(直径5.0cm×长80.0cm)；
玻璃试管；
SBSZ100数控计滴自动部分收集器；
UV-1600紫外可见分光光度计。
3.试剂：
(1)柱层析用的试剂：第一次柱层析：Al2O3、第一次流动相(丙酮∶石油醚＝1∶1)， 第二次流动相(100％乙醇)；第二次柱层析：硅胶(100μm)、流动相(20％乙醇)。
(2)定性检测用的试剂：甜叶菊糖苷标准品(300倍蔗糖甜度的st和450倍蔗糖甜度的 RA)、葡萄糖、麦芽糖，正丁醇、乙酸、乙醚、水、50％的硫酸。
4.Al2O3柱层析法纯化甜叶菊糖苷
(1)Al2O3的前处理：称取一定重量的Al2O3，经5％的HCL浸泡12h后，用蒸馏水洗 至中性，湿法装柱，径高比为1∶10。
(2)上样：称取80□下烘至恒重的纯度为80％甜叶菊糖苷样品(粗干粉)，粗干粉高度 为Al2O3高度的1/5。
(3)洗脱和定性检测：用第一次柱层析的第一次流动相(丙酮∶石油醚＝1∶1)进行洗 脱，自然洗脱流速或液面高差为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测(图2)，至无红色为 止。改用用第一次柱层析的第二次流动相(100％乙醇)进行洗脱，同时用自动部分收集器进 行收集。对洗脱液进行硫酸显色定性检测(图2)，至无粉红色为止。
5.浓缩：收集第一次柱层析的第二次流动相(100％乙醇)洗脱液，进行浓缩。
6.硅胶柱层析法纯化甜叶菊糖苷
(1)装柱：称取一定重量的硅胶，用水浸泡后湿法装柱，径高比为1∶10。
(2)上样：将第5步的浓缩液体上样，上样量为硅胶柱高度的1/10。
(3)洗脱：用第二次柱层析的流动相(20％乙醇)进行洗脱，自然洗脱流速或液面高差 为1m，对洗脱液进行硫酸显色定性检测(图2)，从粉红色出现到无粉红色为止。收集该段 洗脱液。
7.定性、定量检测：
(1)硅胶薄层层析法定性检测甜叶菊糖苷：用0.1mol/L的硼酸溶液调浆制硅胶板，展 开体系：(正丁醇∶乙酸∶乙醚∶水＝9∶6∶3∶1)；显色剂：50％的硫酸。本方法能够将甜 叶菊糖苷中的两种主要单体成分(St和RA)、麦芽糖、葡萄糖区分开(图3)。
(2)分光光度法定量检测甜叶菊糖苷(参见郝再彬申请的专利：快速测定甜叶菊糖苷含 量的方法和专用试剂，专利申请号：200510010277.3；专利公开号：CN1731144A；2006年2 月8日公示，见发明专利公报2006，22(06)：311)