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1、(10)授权公告号 CN 101497878 B (45)授权公告日 2012.11.07 CN 101497878 B *CN101497878B* (21)申请号 200810050353.7 (22)申请日 2008.01.30 C12N 9/50(2006.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 38/48(2006.01) A61K 47/42(2006.01) A61K 49/14(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 房学迅 地址 130021 吉林省长春市朝阳区解放大路 2519 号吉林大学分子酶学工程教育部 重点实验室 。
2、(72)发明人 房学迅 朱雷 王会玲 王丽萍 李惟 CN 1898234 A,2007.01.17, 全文 . CN 1985259 A,2007.06.20, 全文 . CN 1853732 A,2006.11.01, 全文 . (54) 发明名称 特异性高效亲和膜型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽、 蛋白及其应用 (57) 摘要 本发明公开了特异性高效亲和膜 I 型基质金 属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽序列 ； 同时公开了特 异性高效亲和膜 I 型基质金属蛋白酶的多肽含有 的基序。含有特异性高效亲和膜 I 型基质金属蛋 白酶 (MT1-MMP) 的多肽序列或基序的多肽或蛋白。
3、 可以经过化学修饰直接或间接连接发光基团， 用 来特异性高亲和的标记 MT1-MMP 或表达 MT1-MMP 的细胞或组织。 同时， 含有特异性高效亲和膜I型 基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽序列或基序的 多肽或蛋白可以用于 MT1-MMP 分子的定量检测。 此外， 含特异性高效亲和膜 I 型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽序列或基序的多肽或蛋白还可 以作为靶向药物的载体， 应用于 MT1-MMP 过度表 达的疾病的治疗。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 范东升 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12。
4、)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 含有特定基序的特异性高效亲和膜 I 型基质金属蛋白酶 MT1-MMP 的多肽或蛋白， 所 述的特定 MT1-MMP 亲和多肽或蛋白含有的基序是 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys -Thr-Phe-Leu。 2. 如权利要求 1 所述多肽或蛋白在制备作为检测 MT1-MMP 含量的定量试剂方面的应 用， 所述的特定 MT1-MMP 亲和多肽或蛋白含有的基序是 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Th r-Lys-Thr-Phe-Leu。 3. 如权利要求 。
5、1 所述多肽或蛋白在制备作为特异性亲和 MT1-MMP 的药物载体中的应 用， 所述的特定 MT1-MMP 亲和多肽或蛋白含有的基序是 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Th r-Lys-Thr-Phe-Leu。 4. 如权利要求 3 中所述的应用， 其中含有特定序列或基序的特异性亲和 MT1-MMP 的多 肽或蛋白作为药物载体可经过化学修饰连接各种化合物或基团。 5. 如权利要求 4 中所述的应用， 其中含有特定序列或基序的特异性亲和 MT1-MMP 的多 肽或蛋白作为药物载体所连接的基团或化合物是对 MT1-MMP 活性有抑制作用， 或对能表达 MT1-MMP 的细胞。
6、或肿瘤有抑制或毒性作用， 或是从天然产物中提取或化学方法合成的对肿 瘤细胞有抑制或毒性的基团或化合物。 权 利 要 求 书 CN 101497878 B 2 1/7 页 3 特异性高效亲和膜I型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)的多肽、 蛋白及其应用 技术领域 0001 本发明涉及含有特定序列或基序的膜I型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)的特异性高 亲和力的多肽或蛋白， 这种多肽或蛋白的用途， 包括含有这些序列或基序的多肽或蛋白作 为靶向药物的载体、 生物标记物和检测手段， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 基质金属蛋白酶即 Matrix Metalloproteinases， 简称 MM。
7、Ps， 是由细胞分泌的 Zn2+ 金属内肽酶家族的总称， 参与细胞外基质 (ECM) 的降解。MMPs 是一个 Zn2+依赖性蛋白酶家 族， 主要由成纤维细胞、 内皮细胞、 巨噬细胞、 中性粒细胞等合成与分泌， 通常在中性条件下 及 Ca2+参与下发挥作用， 目前已发现 24 种人源 MMPs。这些 MMP 可以根据其结构分为膜型 和分泌型， 其中， 膜型 MMP 有六种。 0003 膜 I 型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP， MMP-14) 与其它膜型 MMP 有着很高的同源性， 它 们都含有一个前肽结构域， 含有 Zn2+离子结合位点的催化结构域， 铰链结构域， 血红素样结 构域和一个胞。
8、质尾端结构域。而它本身又有着自身的特殊结构， MT1-MMP 在 C- 末端含有一 个胞浆区以及 N- 末端含有一个 furin 蛋白识别位点。MT1-MMP 在膜型 MMP 中发挥着很重要 的作用， 主要与正常及肿瘤细胞的细胞外基质的降解和重塑相关。MT1-MMP 可以降解细胞 外基质中多种成分， 如 ： I 型和 II 型胶原， 纤维连接蛋白， 玻璃粘连蛋白， 层粘连蛋白， 纤维 蛋白和蛋白聚糖等。同时 MT1-MMP 还可以活化与肿瘤迁移和浸润密切相关的 MMP-2 酶原和 MMP-13 酶原。另外， MT1-MMP 还涉及到许多细胞表面分子的裂解， 如 ： 转谷氨酰胺酶， CD44 在。
9、调控细胞外周蛋白， 整和蛋白， 低密度脂蛋白和 L- 聚糖等。MT1-MMP 还可以介导细胞外 的水解过程， 调节细胞间的粘附和细胞的运动性， 使细胞能够适应不断改变的组织微环境。 MT1-MMP 可以在哺乳动物中以活化形式广泛表达于细胞表面上， 而酶原的活化却可能是在 细胞质中完成的， 然后再运输到细胞膜表面上的。 0004 MT1-MMP 对细胞外基质和细胞表面粘附分子的水解在生命的许多正常生理功能中 ( 伤口愈合， 骨骼的生长和重塑 ) 和病理过程中 ( 关节炎和癌症 ) 都发挥着重要的作用。例 如基因敲除 MT1-MMP 的小鼠模型中小鼠会表现为侏儒并且在成年后就会发生死亡。正常情 况。
10、下， MT1-MMP 在组织中低表达， 而在肿瘤组织中 MT1-MMP 的表达均有不同程度的增加。在 疾病方面， MT1-MMP 在肺、 结肠、 头和颈部癌症中表达。在不同类型的癌症中 MMP 的过度表 达是不同的， 且原发肿瘤与其转移性癌中酶的表达也有差异。 MT1-MMP在肿瘤中有过量的表 达， 并且这种高表达同时又伴随着肿瘤的高迁移， 浸润和转移的增强， MT1-MMP 在肿瘤细胞 从正常到具有迁移能力转换过程中发挥着重要作用。MT1-MMP 表达调节主要发生在转录水 平， 也可发生在 mRNA 稳定性水平， 以适应肿瘤浸润细胞和肿瘤基质细胞分泌的生长因子和 细胞因子的需要。 MT1-M。
11、MP涉及原发性肿瘤生长和转移性肿瘤的生成。 在肿瘤迁移过程中， 都涉及到 MMP-2 的高表达， 而 MMP-2 的活化又是由 MT1-MMP 来完成的。所以从促进肿瘤迁 移和活化肿瘤浸润相关酶等方面， MT1-MMP 作为关键因子， 在科研和临床上都占据着重要位 说 明 书 CN 101497878 B 3 2/7 页 4 置。例如在人类鳞屑癌细胞 A431 中， MT1-MMP 就有很高量的表达而同时促进了癌细胞的浸 润能力。同样的， 对于人纤维肉瘤细胞 HT1080， 采用热激法处理后， MT1-MMP 的表达减少， 进 而表现出 HT1080 细胞浸润能力的下降。在对人卵巢癌的临床检测。
12、中， 通过对不同时期卵巢 癌病人癌变组织的免疫组化染色显示 ： MT1-MMP 的表达量多少， 关系到卵巢癌发展的阶段， MT1-MMP 表达量的增多， 也就加剧了卵巢癌的恶化， 同时也促进了这种癌症迁移和组织学上 的进一步恶化。在人类神经胶质瘤方面， 通过对正常人脑和患病人脑的免疫组化染色比较 显示， 在正常人脑中 MT1-MMP 几乎没有表达， 而在胶质瘤病人的脑中检测到了大量 MT1-MMP 的表达。 在黑色素瘤细胞中， 通过对MT1-MMP的mRNA的Northern blot研究发现MT1-MMP的 mRNA 的含量越高黑色素瘤的迁移能力越强。然而， 并不是所有的肿瘤细胞都表达MT1。
13、-MMP， 如 western 检测人乳腺癌细胞 MCF-7 中就观察不到 MT1-MMP 的表达。 0005 如上所述， MT1-MMP 在肿瘤中有较正常组织中高的表达， 那么靶向 MT1-MMP 的细胞 投递药物就可以作为一种治疗癌症的方法。而 MMPs 之间的同源性要求对 MT1-MMP 的亲和 要有很高选择性。早期的关于诊断或标记肿瘤的方法主要集中于对抗体或其衍生物的研 究， 尽管这些试剂在肿瘤成像诊断上取得些许成功， 但是它们的缺点同样限制了抗体类试 剂在肿瘤诊断上的广泛应用 ： 它们半衰期短或是容易产生免疫原性。因此找到新的标记肿 瘤分子势在必行， 而多肽类物质由于其出色的药物代谢。
14、和低或无免疫原性可能成为优秀的 药物、 药物载体或肿瘤标记物质。 发明内容 0006 我们发明并证明了含有特定序列或基序的多肽对 MT1-MMP 的特异性高亲和作用。 多肽的基序 His-X-His(X 为任意一种氨基酸 )、 His-Trp、 Arg-Ser 是和 MT1-MMP 产生结合 作用的关键的氨基酸基序。含有这些特定序列或基序的一系列多肽或蛋白可以与 MT1-MMP 选择性特异性结合并具有高亲和力。本发明公布了含有特定序列或基序的特异性高效亲 和膜 I 型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽、 蛋白及其应用。对这些多肽和蛋白的应用包 括 ： 应用含有这些序列或基序的多肽或蛋白。
15、在细胞水平或组织水平标记 MT1-MMP， 定量的 检测 MT1-MMP 表达 ； 含有这些序列或基序的多肽或蛋白可以用来作为一种亲和试剂定量的 检查 MT1-MMP 的含量和活性 ； 含有这些序列或基序的的多肽或蛋白可作为一种靶向药物的 载体， 应用于包括癌症在内的疾病的靶向治疗。 0007 一方面， 本发明涉及含有特定序列的特异性高效亲和膜 I 型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽、 蛋白及在特异性亲和标记 MT1-MMP 中的应用 ； 含有特定基序的特异性高 效亲和膜 I 型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽、 蛋白在特异性亲和标记 MT1-MMP 中的应 用， 所述的特。
16、定 MT1-MMP 亲和多肽、 蛋白含有的基序是 His-X-His(X 为任意一种氨基酸 )， 或His-Trp， 或Arg-Ser， 或包含这些基序的组合。 含特定多肽序列或氨基酸基序的MT1-MMP 的亲和多肽或蛋白用于检测 MT1-MMP 在细胞中的位置和含量 ； 以及在正常或疾病组织中 MT1-MMP 的表达位置和含量。 0008 另一方面， 本发明还涉及含有特定序列或基序的特异性高效亲和膜 I 型基质金属 蛋白酶 (MT1-MMP) 的多肽、 蛋白及在 MT1-MMP 定量方面的应用， 所述的特定 MT1-MMP 亲和多 肽、 蛋白含有的基序是His-X-His(X为任意一种氨基酸。
17、)， 或His-Trp， 或Arg-Ser， 或包含这 些基序的组合。MT1-MMP 的定量是指对 MT1-MMP 的浓度或活性的定量检测。 说 明 书 CN 101497878 B 4 3/7 页 5 0009 第三， 本发明还涉及含有特定序列或基序的特异性高效亲和膜 I 型基质金属蛋白 酶 (MT1-MMP) 的多肽、 蛋白作为药物载体的应用， 所述的特定 MT1-MMP 亲和多肽、 蛋白含有 的基序是 His-X-His(X 为任意一种氨基酸 )， 或 His-Trp， 或 Arg-Ser， 或包含这些基序的组 合。 具体实施方式 0010 下列实施例更详细地说明本发明， 但是并不是要将。
18、本发明限定为实施例。 0011 我们合成了含有 His-X-His(X 为任意一种氨基酸 ) 和 His-Trp 基序的一段氨基酸 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu， 应用于下列实施例。 0012 实施例 1.Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对膜 I 型基质金属蛋白酶有特异性选择和高亲和作用。 0013 实验步骤 ： 0014 用 100-200l 100g/ml 的 靶 分 子 MT1-MMP， MMP-1， MMP-7， MMP-13， 。
19、MMP-16， MMP-26 和 MMP-28( 溶于 0.1M pH8.6 NaHCO3中 ) 包被 ELISA 板的每个孔， 每个待鉴定克隆 一排包被孔。在密封的湿盒 ( 如 ： 排有湿纸巾的封口塑料盒 ) 中 4包被过夜。 0015 甩出多余靶分子溶液， 并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液。另 外， 每个待鉴定克隆的一排未包被孔也加入封阻液， 以检测所选序列对 BSA 包被塑料板的 结合力。 在将多肽加入靶分子包被板前， 还要再准备一个微量滴定板进行多肽的系列稀释， 这个板也要封阻。 单独在另外一个封阻板中进行稀释是为了避免稀释过程中有多肽吸附到 靶分子上。最后， 所有封阻板。
20、 4封阻 1-2hrs。 0016 甩出封阻液， 用 1TBS/Tween 洗板 6 次， 每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗 液， Tween 浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。 0017 在单独的封阻板中每孔预先加入 200l TBS， 稀释各个不同多肽小肽到 1/10 或 1/100。 0018 用多通道移液器将每排稀释好的多肽加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用 1-2hrs。 0019 用 1TBS/Tween 洗板 6 次。 0020 加入稀释好的 HRP 标记的亲和素抗体， 每孔加入 100l， 室温震荡作用 1 小时。 0021 用 1TBS/Tween 洗板 6 次。 0。
21、022 每孔加 200l 底物溶液， 室温作用 10-60min。 0023 每孔加入 50l 1M H2SO4终止反应。 0024 用读板仪记录 450nm 处的吸光值。OD 值的大小表示多肽与 MMPs 的结合情况， OD 值越大， 多肽与 MMP 的结合力越强。 0025 附图 1 是 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 与 MT1-MMP， MMP-13， -16， -26 结合能力图。 0026 附图 2 是 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-。
22、Leu 与 MT1-MMP， MMP-1， -7， -28 得结合能力图。 0027 结论 ： 测试 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 与多 种 MT1-MMP 同家族成员结合时， 对 MT1-MMP 有很高的选择性和高的亲和力， 与其它 MMPs 结 说 明 书 CN 101497878 B 5 4/7 页 6 合性和选择性很差。 0028 实施例 2.Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对膜 I 型基质金属蛋白酶 (MT1-MMP) 在酶学和。
23、细胞水平上没有抑制作用。 0029 实验步骤 ： 0030 酶 学 上 检 测 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对 MT1-MMP 的抑制实验 ： 0031 我们所用的底物为DQ-Gelatin和P126 ； 在室温条件下测定， 反应总体积为100ul。 在加有抑制剂时， 酶与抑制剂应在缓冲液体系中孵育 30 分钟， 37然后再加底物测定。所 有检测的仪器为 FLX800 荧光酶标仪 (Bio-Tek)， 对于 DQ-Gelatin 激发波长 495nm， 发射波 长 515nm， 而对于 P126， 激发波长 32。
24、8nm， 发射波长 393nm。测定反应时间为 8 分钟， 取荧光 值的点所组成的线的斜率为速度， 其中未加抑制剂的记为V0， 加抑制剂的为Vi， 以Vi/V0表示 抑制剂的抑制程度 ； 然后以所加抑制剂的浓度为横坐标， 以 Vi/V0的值为纵坐标， 做出相应 曲线 ； 在 Vi/V0为 0.5 处所对应的抑制剂的浓度为 IC50。 0032 在此， 我们所用的底物 DQ-Gelatin 和 P126 均为荧光底物， 其原理为一段 MMP 切割 的小肽两端连有荧光基团和淬灭基团。随着 MMP 将其降解， 荧光基团和淬灭基团分离， 从而 发出荧光， 并且在一定范围内， 荧光密度的增强速度与酶反应。
25、速度称正比关系， 故可用荧光 的增加速度来代表酶活性。 0033 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对 MT1-MMP 的 抑 制效果抑制都在 20以下， 可以说对 MT1-MMP 的影响很小。 0034 附图 3 是 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对 MT1-MMP 的抑制能力图。 0035 结 论 ： Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 在 酶 学 水 平上对 M。
26、T1-MMP 的抑制作用很弱。 0036 实施例 3. 细胞水平上 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe -Leu 对几种 MT1-MMP 表达量不同的细胞的标记 ： 0037 实验步骤 ： 0038 取出培养至 80左右的细胞， 用胰酶消化下来， 加入 5ml 培养基， 反复吹打细胞 液， 将细胞吹成单个细胞， 取 200ul 细胞悬液滴至灭菌后的盖玻片上， 37细胞培养箱中培 养过夜。 0039 PBS 清洗盖玻片三次后， 加入 DMEM/FBS， 孵育 30mins。 0040 室温下加入 Biotin-His-Trp-Ly。
27、s-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu， 4 孵育过夜。 0041 PBS 洗涤三次， 加入 FITC-Avidin， 避光孵育 30min 0042 PBS 洗涤三次， 95乙醇后固定， 甘油封片。 0043 荧光显微镜下观察 0044 附图 4 是 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对三种 表达不同量 MT1-MMP 的细胞的标记图。 0045 其中 HT1080 人纤维肉瘤细胞高表达 MT1-MMP， A549 非小细胞肺癌细胞中度表达 M MMP， MCF-7 人乳腺癌细胞不。
28、表达 MT-MMP。柱形图代表三种细胞上的荧光强度。 说 明 书 CN 101497878 B 6 5/7 页 7 0046 附图 5 是 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对三种 表达不同量 MT1-MMP 的细胞的荧光标记图的量化柱形图。 0047 结论 ： 在高表达 MT1-MMP 的 HT1080 人纤维肉瘤细胞中， 中度表达 MT1-MMP 的 A549 非小细胞肺癌细胞， 不表达 MT1-MMP 的 MCF-7 人乳腺癌细胞中 Biotin-His-Trp-Lys-His-L eu-His-Asn-Thr-。
29、Lys-Thr-Phe-Leu 可特异性的定量化标记 MT1-MMP。 0048 实施例 4. 荧光素异硫氰酸呱 FITC 标记的肽段在标记不同表达量 MT1-MMP 方面的 应用 ： 0049 实验步骤 ： 0050 采用固相合成法合成 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 将 肽从树脂上切下之前， 根据欲标记的多肽总量， 按每毫克蛋白加 0.01mg 荧光素， 用分析天 平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。 0051 结合 ( 或称标记 ) ： 边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入蛋白溶液中， 避免将荧光 素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上。
30、 ( 大约 5 10min 内加完 )， 加毕后， 继续搅拌 12 18h。 结合期间应保持蛋白溶液于 4左右， 故须及时添冰去水 ； 可将结合装置安放在 4冰箱或 冰库中。 0052 透析 ： 结合完毕后， 将蛋白的溶液离心 (2500r/min)20min， 除去其中少量之沉淀 物， 装入透析袋中后再置于烧杯中， 用 pH8.0 缓冲盐水透析 (0 4 ) 过夜。 0053 纯化 ： HPLC 纯化荧光标记的多肽。 0054 利 用 FITC-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 标 记 细 胞 中 MT1-MMP 的实验步骤如利用。
31、 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Le u 标记细胞中 MT1-MMP 一致。 0055 结论 ： 利用 FITC-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 可以用 于标记细胞中 MT1-MMP。 0056 实施例 5. 利用花青素 Cy5 FITC 标记的肽段在标记不同表达量 MT1-MMP 方面的应 用 ： 0057 实验步骤 ： 0058 固相合成法合成 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 后， 切割 下来。
32、溶于 50mM Tris_HCl， pH7.4 中与 1.4 倍摩尔浓度过量的溶于 DMSO 中的 Cy5 亚胺混合， 孵育 20 分钟后， 采用分子筛纯化。 0059 用 Cy5-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 标 记 细 胞 中 MT1-MMP 的实验步骤如利用 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Le u 标记细胞中 MT1-MMP 一致。 0060 结论 ： 利用 Cy5-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe。
33、-Leu 可以用于 标记细胞中 MT1-MMP。 0061 实施例6.利用Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu检 测 MT1-MMP 的浓度 ： 0062 实验步骤 ： 0063 用100-200l 100g/ml的靶分子(溶于0.1M pH8.6 NaHCO3中)Biotin-His-T rp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 包被 ELISA 板的每个孔， 每个待鉴定克隆 说 明 书 CN 101497878 B 7 6/7 页 8 一排包被孔。在密封的湿盒 ( 如 ： 排。
34、有湿纸巾的封口塑料盒 ) 中 4包被过夜。 0064 甩出多余靶分子溶液， 并倒置平板在纸巾上拍甩除去残液。每孔加满封阻液。 0065 甩出封阻液， 用 1TBS/Tween 洗板 6 次， 每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗 液， Tween 浓度应当与淘选清洗步骤中所用浓度相同。 0066 用多通道移液器将每排稀释好的已知浓度的 MT1-MMP 加入包被有靶分子 Biotin- His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 的板中。室温震荡作用 1-2hrs。 0067 用 1TBS/Tween 洗板 6 次。 0068 加入稀释好的 HR。
35、P 标记的山羊抗兔二抗， 每孔加入 100l， 室温震荡作用 1 小时。 0069 用 1TBS/Tween 洗板 6 次。 0070 每孔加 200l 底物溶液， 室温作用 10-60min。 0071 每孔加入 50l 1M H2SO4终止反应。 0072 用读板仪记录 450nm 处的吸光值。以 OD 值和 MT1-MMP 做出标准曲线。当要测定 某一未知浓度的 MT1-MMP 时， 单独以 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Th r-Phe-Leu 包被两个复孔， 加入待测样品， 其他步骤与测定标准曲线的步骤一致， 显色测定 OD45。
36、0 后， 在标准曲线上可以确定 MT1-MMP 的浓度。 0073 附图 6 是 Biotin-His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 对不同 量 MT1-MMP 的浓度测定图。 0074 我们有包被了另一个已知浓度的 MT1-MMP 来验证标准曲线的准确性， 结果表明 MT1-MMP 浓度为 0.045uM 时， 它的 OD450 为 0.022， 这与我们制定的标准曲线相符。 0075 结论 ： 利用含有亲和MT1-MMP的亲和基序得小肽， 可以用于亲和测定MT1-MMP的浓 度。 0076 实施例 7. 以 His-Trp-Lys-。
37、His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 为载体连接 具有放射性治疗性的 131I， 在对肿瘤成像诊断及治疗方面的应用 ： 0077 实验步骤 ： 0078 放射性标记多肽的合成 ： 我们采用氯胺 -T 法在 N- 末端达到连接放射同位素 131I 的目的。Fmoc 法固相合成 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 后， 从树 脂上切割下来纯化前在连接 131I， 用 Sephdex G-25 柱纯化后， 质谱检测分子量。 0079 动物模型的构建 ： 采用 35 只体重在 237g 左右的昆明小鼠做为实验。
38、对象检测合成 的 131I 标记的亲和多肽在肿瘤成像和治疗方面的应用。无菌条件下， 取 HT1080 黑色素瘤细 胞悬液 0.5ml(107细胞 )， 注射至昆明纯系小鼠右前肢腋下， 定期观察瘤组织生长与荷瘤小 鼠状况， 10 天后， 待肿瘤直径至 500mm 左右， 供体内实验用。 0080 成像过程及对肿瘤杀伤效果分析 ： 轻微麻醉后， 鼠尾静脉注射 50-100uCi 的标记 后多肽。成像前， 每只小鼠按 13mg/mg 喂食甲苯噻嗪镇痛小鼠。在注射标记多肽后的 1 至 2 小时后， 对小鼠全身利用 gamma 射线相机拍摄小鼠全身， 之后在注射标记的多肽后每隔一 天， 三天， 五天和六。
39、天后分别对小鼠拍照， 分析 131I 标记的亲和多肽在体内分布及肿瘤大小 的变化。 0081 结论 ： 131I 标记的亲和多肽可以用在肿瘤成像方面和杀死肿瘤细胞方面。 0082 本发明所涉及的氨基酸序列 0083 说 明 书 CN 101497878 B 8 7/7 页 9 序列号 MT1-MMP 特异性高效亲和多肽的氨基酸序列 1 His-Trp-Lys-His-Leu-His-Asn-Thr-Lys-Thr-Phe-Leu 2 Ala-Ser-Ala-Lys-Met-Pro-His-Leu-His-His-Arg-Ser 3 His-Tyr-Ala-His-Asn-His-Ala-Arg。
40、-Leu-His-phe-Arg 4 His-Met-Leu-Ser-Arg-His-Asp-His-Ser-Tyr-Ser-Leu 5 His-Gly-Lys-Tyr-Leu-Gly-Ala-His-Leu-His-Lys-Tyr 6 Lys-His-Met-His-Trp-His-Pro-Pro-Ala-Leu-Asn-Thr 7 Val-Ser-Arg-His-Gln-Ser-Trp-His-Pro-His-Asp-leu 8 Leu-His-Lys-His-Hjs-Ser-Asn-Pro-Val-Phe-Ser-Asp 9 Ala-His-Ile-His-Trp-Lys-Pro-Arg。
41、-Pro-Pro-Pro-Leu 10 Leu-Pro-Gly-His-Arg-His-Pro-His-His-Pro-Pro-Pro 11 His-Gly-Lys-His-Ser-His-Thr-Ile-Pro-Asn-Arg-Tyr 12 Ser-His-His-His-His-His-Thr-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser 13 Gly-His-Arg-His-Ile-His-His-Ala-Lys-Leu-Asn-Thr 14 Ser-Pro-His-His-His-Ala-Asn-Pro-Pro-Pro-Arg-Ser 15 Ser-Gln-Ser-His-Ser-His-Gly-Ala-Val-Gly-Ser-Arg 16 Ala-Leu-Arg-His-His-Ser-His-Thr-Gly-Leu-Ser-Met 17 His-Ser-Gly-Asn-His-Ser-Lys-Ser-His-Pro-Gln-Arg 说 明 书 CN 101497878 B 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101497878 B 10 2/2 页 11 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 101497878 B 11 。