技术领域
本发明涉及生物发酵方法技术领域，具体是指绿僵菌(Metarhizium anisopliae)的一种固体培养方法。
背景技术
绿僵菌是广谱性寄生真菌，可感染200余种昆虫，对蝗虫及地 下害虫等有特效，无残毒，无公害，使用安全，对害虫天敌亦有保 护作用。是一种可持续、低消耗的害虫防治制剂，可代替大量化学 农药的使用，减轻环境污染，在生物防治中具有重要应用价值。
绿僵菌的大量培养是满足田间应用需求的基础。目前国内外绿僵菌 固体培养一般采用框架式或塑料袋法培养，其培养过程中不仅设备复杂， 污染率高和对湿度要求条件高，而且发酵周期长，相对生产效率低。
发明内容
本发明的目的是提供一种绿僵菌固体培养方法，将框架式与塑料 袋法培养结合起来，可有效减少培养过程中的污染机率和后期对湿 度的要求，并可明显改善培养基的通气性能，其发酵工艺简单，不 需要复杂设备，发酵周期短，生产效率高，生产成本低，有较高的 经济效益和社会效益。
本发明的主要技术方案是：一种绿僵菌的固体培养方法，包括液体 菌种的制备及固体培养，其特征在于固体培养前期采用框架式培养，后 期采用塑料袋法培养，固体培养基中具有营养原料麦麸和作为原料载体 的玉米秸秆粉。
所述的固体培养基中具有以下组份及重量配比的固体基质为佳，麦 麸∶玉米秸秆粉＝60-90份∶5-40份。
所述的固体培养基中添加无机盐的较佳组份及重量配比为，按其 固体基质成分总量为100g，添加葡萄糖0.8-1.5g、硫酸铵1.5-2.5g、 磷酸二氢钾0.6-1.8g；将这些成分溶于70-200ml水后再与固体基 质搅拌均匀，蒸汽灭菌。
所述的固体培养前期框架式培养接种时液体菌种量为固体培养基 总重量的5-20％为佳。
所述的框架式培养2-3天长满白色菌丝时，将菌种轻轻捣碎，再 装入灭菌的聚丙烯塑料袋中进行塑料袋法培养3-4天。
所述的液体菌种制备的方法用的斜面培养基具有如下组份及重 量配比较佳：马铃薯80～120g、蔗糖16～24g、酵母膏4～6g、KH2PO41～4g、MgSO4 1.2～1.8g、琼脂15g、水1L。
所述的液体菌种制备的方法用的液体培养基具有如下组分及重量 配比为佳：葡萄糖32～48g、酵母膏4～6g、蛋白胨8～12g、KH2PO4 3～ 8g、MgSO4 0.4～0.6g、水1L。
本发明的积极效果是：将框架式与塑料袋法培养结合起来，可有 效减少培养过程中的污染机率和后期对湿度的要求，并可明显改善 培养基的通气性能，其发酵工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期 短，生产效率高，生产成本低，有较高的经济效益和社会效益。
与现有技术相比，本发明利用液体培养快速生长的大量菌丝体， 转接到固体营养基质上产生气生分生孢子，从而缩短菌丝生长周期， 提高产率，避免前期污染；其次，本发明前期采用框架式培养，后 期塑料袋法培养，生产工艺简单，显著减少了培养过程中的污染机 率，缩短了发酵时间，而且不需要复杂设备，对湿度的要求降低； 第三，原料主要为农副产品麦麸、玉米秸秆粉，来源广泛、充足， 成本低廉，易调控，成功率高；第四，在培养原料中添加部分玉米 秸秆粉，不仅可以使农业废弃物得到有效利用，而且明显改善了培 养基的粘度、空隙率和疏松度，培养过程中不用额外通气。因此， 本发明的实现，不仅对农业废弃物的利用、促进农业可持续发展、 保护生态环境方面意义重大，而且有着切实的经济效益和广阔的应 用前景。
以下结合实例作详述，但不作为对本发明的限定。
具体实施方式
生产工艺：
(1)液体菌种的制备，包括如下步骤：
菌种：金龟子绿僵菌M105-32(或用其他的绿僵菌亦可)，河北 省生物研究所保存，为公知公用菌种。
斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面在25℃传代培养、活 化，当斜面长满绿色孢子时即可；
液体培养基：每个250ml三角瓶中放入60ml培养基，115℃蒸 汽灭菌30分钟；
接种：从固体斜面中挑出一小块菌苔接入液体摇瓶；
培养：25±1℃摇床振荡培养36-42小时，长成白色粘稠菌丝体 即可向固体培养基中接种。
(2)固体培养：
a.固体培养基：麦麸60-90％、玉米秸秆粉5-40％(上两种为 100)；以下为占上两种的百分数：葡萄糖0.8-1.5g、硫酸铵1.5-2.5g、 磷酸二氢钾0.6-1.8g；将这些成分溶于70-200ml水后再与固体基 质搅拌均匀，pH自然，115℃蒸汽灭菌50分钟；
b.接种：按5-20％接种量，将液体种倒入固体培养基中，搅拌 均匀，放入下铺灭菌报纸的浅盘中培养(厚度3-4cm)，浅盘底为尼 龙网，通气性好，注意各环节均需无菌操作；
c.培养方法：培养室温度为25±1℃，湿度30-70％，培养2-3 天，长满白色菌丝时，轻轻捣碎，装入可蒸汽灭菌的聚丙烯塑料袋 中，袋子两端塞入灭菌棉花，再用细绳捆住继续培养3-4天(装入 袋后室内无湿度要求)，内外均长出绿色孢子即可，从袋中倒出，在 阴凉通风处晾干即为粗品(或在35℃烘24h，含水率≤12％)。
实施例1：
(1)液体菌种的制备：
a.斜面菌种：预先将金龟子绿僵菌M105-32菌种用试管斜面培 养基在25℃传代培养、活化，当斜面长满绿色孢子时即可；
b.液体培养基：配制0.5L液体培养基，每个250ml三角瓶中放 入60ml培养基，115℃蒸汽灭菌30分钟；
c.接种：从固体斜面中挑出一小块菌苔接入液体摇瓶，一只斜面 可接6-8个瓶子；
d.培养：25±1℃摇床振荡培养36-42小时，长成白色粘稠菌丝 体即可向固体培养基中接种。
(2)固体培养：
a.固体培养基：麦麸4.2kg玉米秸秆粉0.8kg、葡萄糖60g、 硫酸铵90g、磷酸二氢钾55g、自来水为6L，先用水将葡萄糖、硫酸 铵、磷酸二氢钾溶解，再倒入固体培养基中搅拌均匀，pH自然，分 装成几个小布袋，放入高压灭菌锅内115℃蒸汽灭菌50分钟；
b.接种：将液体种倒入固体培养基中，搅拌均匀，放入下铺灭 菌报纸的浅盘中培养(厚度3-4cm)，浅盘底为尼龙网，通气性好， 几个盘子可以叠放，最上层再盖层塑料布(保湿)，注意各环节均需 无菌操作；
c.培养方法：培养室预先消毒，温度25±1℃，湿度30-70％， 培养2-3天，长满白色菌丝时，轻轻捣碎，装入可蒸汽灭菌的聚丙 烯塑料袋中，袋宽15cm，袋长35-40cm，袋子两端塞入灭菌棉花，再 用细绳捆住继续培养3-4天(装入袋后室内无湿度要求)，内外均长 出绿色孢子，从袋中倒出，放在阴凉通风处晾干即为粗品(或在35 ℃烘24h，含水率≤12％)。血球计数板计数：1.31×1010孢子/克 粗品，平板计数：1.15×1010孢子/克粗品。
固体斜面培养基具有如下组份及重量配比较佳：马铃薯80～ 120g、蔗糖16～24g、酵母膏4～6g、KH2PO4 1～4g、MgSO4 1.2～1.8g、 琼脂15g、水1L。(例2同)
液体菌种制备的方法用的液体培养基具有如下组份及配比为 佳：葡萄糖32～48g、酵母膏4～6g、蛋白胨8～12g、KH2PO4 3～8g、 MgSO4 0.4～0.6g、水1L。(例2同)
实施例2：
(1)液体菌种的制备：
a.斜面菌种：预先将金龟子绿僵菌M105-32菌种用试管斜面培 养基在25℃传代培养、活化，当斜面长满绿色孢子时即可；
b.液体培养基：配制1.7L液体培养基，每个250ml三角瓶中放 入60ml培养基，115℃蒸汽灭菌30分钟；
c.接种：从固体斜面中挑出一小块菌苔接入液体摇瓶，一只斜面 可接6-8个瓶子；
d.培养：25±1℃摇床振荡培养36-42小时，长成白色粘稠菌丝 体即可向固体培养基中接种。
(2)固体培养：
a.固体培养基：麦麸12.0kg、玉米秸秆粉3.0kg、葡萄糖120g、 硫酸铵280g、磷酸二氢钾140g、自来水为13L，先用水将葡萄糖、 硫酸铵、磷酸二氢钾溶解，再倒入固体培养基中搅拌均匀，pH自然， 分装成几个小布袋，放入高压灭菌锅内115℃蒸汽灭菌50分钟；
b.接种：将培养好的液体种倒入灭菌固体培养基中，搅拌均匀， 放入下铺灭菌报纸的浅盘中(厚度3-4cm)，浅盘底为尼龙网，通气 性好，几个盘子可以叠放，最上层再盖层塑料布(保湿)，注意各环 节均需无菌操作；
c.培养方法：培养室预先消毒，温度25±1℃，湿度30-70％， 培养2-3天，长满白色菌丝时，轻轻捣碎，装入可蒸汽灭菌的聚丙 烯塑料袋中，袋宽15cm，袋长35-40cm，袋子两端塞入灭菌棉花，再 用细绳捆住继续培养3-4天(装入袋后室内无湿度要求)，内外均长 出绿色孢子，从袋中倒出，放在阴凉通风处晾干即为粗品(或在35 ℃烘24h，含水率≤12％)。血球计数板计数：1.16×1010孢子/克 粗品，平板计数：1.05×1010孢子/克粗品。
其他实施例，方法同上，配比如下表1。
其他实施例配比
表1
效果：发酵周期由同类技术的12-14天缩短到6-7天，发酵水 平≥100亿/克粗品。不仅明显缩短了发酵周期，而且不需要复杂设 备，对湿度的要求降低。