吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的制备方法及其应用 【技术领域】
本发明属于杂环化合物，含有两个或更多的杂环，以氮原子作为仅有的环杂原子技术领域，具体涉及一种被环原子-环原子的键直接连接的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
背景技术
凝血酶是一种重要的生理蛋白酶，在血液凝固、炎症和创伤愈合等生理及病理过程中发挥重要作用。由于恶性肿瘤患者常有不同程度的出血倾向，肿瘤组织对周围组织的侵袭、转移的形成以及肿瘤组织和肿瘤患者血液本身的变化，均可导致病人凝血机制的改变，而凝血酶的浓度及活性作为衡量凝血机制的重要指标，对揭示肿瘤的发生机制，或作为早期诊断、分子分型、疗效及预后判断具有重大意义。因此检测凝血酶在医学上有重要意义。传统直接测定凝血酶方法主要有荧光法和发色底物法。荧光法是用荧光底物标记凝血酶，通过测定荧光强度得出凝血酶的含量，其中标记步骤较繁琐。发色底物法利用凝血酶切断其与发色肽的作用点，使对硝基苯胺游离出来，溶液显浅黄色，在405～410nm波长处对光有最大吸收，据此可进行定量测定，该法简单易行。但两种方法都有一个共同缺点就是灵敏度不高，不宜进行微量分析，无法适应现代医学要求的痕量检测。
电化学发光分析法具有灵敏度高、线性范围宽、设备简单、操作方便、快速、易于实现自动化、可控性强、可提供高活性的发光反应物质和节省试剂等特点，已经应用于环境科学、生命科学和材料科学等领域。在电化学发光分析众多的电化学发光试剂中，三联吡啶钌Ru(bpy)32+由于具有水溶性好，化学性能稳定，氧化还原可逆，发光效率高，应用的pH范围较宽等特点而广泛应用于电化学发光分析的研究中。但在流动体系的液相电化学发光分析检测应用中，由于昂贵的Ru(bpy)32+或相关衍生物作为流动反应试剂被大量消耗，导致较高的分析成本，从而限制了Ru(bpy)32+的应用。而目前的固定负载方法主要有物理包埋，静电吸附，共价键合等，其中物理包埋，静电吸附等普遍存在泄漏的问题，共价键合的固定较为牢固，但若固定在一般块体材料上，固定量不大，若固定在无机纳米材料上，如二氧化硅微球上，由于其不良的导电性会影响电子的传导，对电化学发光分析目标物产生一定的影响。
聚吡咯类聚合物具有良好的环境稳定性、简易合成、高电导率以及良好的生物相容性等诸多优点，这些性质赋予其不同于其他导电聚合物的特异性能，成为化学或生物传感器优先选择的材料之一。尤其是纳米结构的聚吡咯类聚合物拥有特殊的力学、磁学、热学、光学和电化学活性；而聚吡咯类聚合物纳米化简单，化学氧化聚合和电氧化聚合均可施行，使其在生物医学工程、临床诊断、环境监测、食品卫生和科学等领域展现出广阔的应用前景。尤其是将纳米技术引入生物传感器，提高了检测灵敏度、缩短检测响应时间、延长使用寿命，可实现高通量的实时检测。聚吡咯类聚合物纳米材料对生物分子进行固定可以提高固载量，对基底电极进行修饰可以提高电催化活性，从而制备出响应性高、敏感性高、选择性高以及稳定性高的新型纳米生物传感器。目前将N-(2-羧乙基)吡咯单体(英文名称为1H-Pyrrole-1-propanoic acid)为功能化试剂与吡咯单体采用化学氧化聚合的方法制备吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子并应用于制备凝血酶电化学发光探针的研究尚未见报道。
【发明内容】
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种操作简便、所制备的产物为纳米级且粒度均匀的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的制备方法。
本发明所要解决的另一个技术问题在于为吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子提供一种用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是它由下述步骤组成：
1、预处理吡咯单体
将市售吡咯在0.02MPa减压蒸馏，收集70～80℃馏分，得到吡咯单体，充氮气保护，避光保存于4℃冰箱内，备用。
2、化学反应
将吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体按摩尔比为1∶0.125～1加入到盛有正戊醇的锥形瓶中，震荡溶解，再加入质量浓度为86.8g/L的表面活性剂水溶液，充分搅拌30分钟，缓慢加入氧化剂，吡咯单体与正戊醇、质量浓度为86.8g/L的表面活性剂水溶液、氧化剂的体积比为1∶1.5～2.7∶80～160∶12～21.1，室温搅拌反应12小时，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液。
上述的吡咯和N-(2-羧乙基)吡咯单体购于Sigma公司；表面活性剂为十二烷基硫酸钠或苯磺酸钠或十二烷基苯磺酸钠，购于阿拉丁公司；氧化剂为FeCl3·6H2O或(NH4)2S2O8，由西安化学试剂厂生产。
3、分离
在含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液中加入甲醇破乳，含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液与甲醇的体积比为1∶2，8000转/分钟离心分离10分钟，沉淀物用甲醇洗涤2～3次，再用蒸馏水洗至蒸馏水无色为止。
4、干燥
洗涤后的沉淀物在真空度为0.01MPa的电热恒温真空干燥箱内60℃干燥3～5小时，制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
在本发明地化学反应步骤2中，将吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体按最佳摩尔比为1∶0.5加入到盛有正戊醇的锥形瓶中，震荡溶解，再加入质量浓度为86.8g/L的表面活性剂水溶液，充分搅拌30分钟，缓慢加入氧化剂，吡咯单体与正戊醇、质量浓度为86.8g/L的表面活性剂水溶液、氧化剂的最佳体积比为1∶2∶120∶16，室温搅拌反应12小时，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液。
吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子在制备凝血酶电化学发光探针中的用途。
吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子在制备凝血酶电化学发光探针中的使用方法如下：
将N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐溶于pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液中，在磷酸盐缓冲溶液中N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量浓度均为0.1mol/L，加入吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子，室温活化1小时，再加入物质的量浓度为10μmol/L的凝血酶适体II和物质的量浓度为6.3μmol/L的氨基钌联吡啶衍生物，氨基钌联吡啶衍生物与凝血酶适体II、N-氨基琥珀酰胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐、吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的质量比为1∶11∶4020∶6678∶700，室温搅拌过夜，12000转/分钟离心分离10分钟，沉淀物用物质的量浓度为0.5mol/L的NaCl水溶液洗涤3次，所得沉淀震荡分散于pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液中，制备成凝血酶电化学发光探针。
将石墨电极插入含有物质的量浓度为0.005mol/L的对氨基苯磺酸和物质的量浓度为0.10mol/L的氯化钾的水溶液中，用循环伏安法以10mV/s的扫速从0.5～1.40V扫四圈，取出电极，用蒸馏水冲洗1分钟，在物质的量浓度为0.04mol/L的PCl5的丙酮溶液中浸泡30分钟，取出电极，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面3分钟，向电极表面滴加物质的量浓度为10μmol/L的凝血酶适体I，室温培育6小时，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液清洗电极表面3分钟，制备成凝血酶适体传感器。在凝血酶适体传感器上滴加物质的量浓度为1.0×10-15～1.0×10-12mol/L的凝血酶，室温培育30分钟，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液清洗电极表面3分钟，再滴加凝血酶电化学发光探针，室温培育20分钟，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液清洗电极表面3分钟，室温放置至电极表面干燥。所得电极用于检测凝血酶。
上述的N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐均购自Sigma公司；氨基钌联吡啶衍生物(英文名字为Ruthenium bis(2，2’-bipyridine)(2，2’-bipyridine-4，4’-dicarboxylic acid)-ethylenediamine)为本实验室根据文献(Terpetschnig，E.；Szmacinski，H.；Malak，H.；Lakowicz，J.R.Biophys.J.1995，68，342-350.)合成；凝血酶适体I为5′-NH2-(CH2)6-GGT TGG TGT GGTTGG-3′(15个碱基)，凝血酶适体II为5′-NH2-(CH2)6-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGGTGA CT-3′(29个碱基)，均购于上海生物工程有限公司；凝血酶购于华美生物公司；对氨基苯磺酸购于国药集团化学试剂有限公司。
本发明制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子，具有较高的比表面积和较多的羧基官能团，增大了氨基钌联吡啶衍生物的负载量，使电化学发光信号增强。采用吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子制备凝血酶电化学发光探针，可用于检测凝血酶，具有良好的选择性、灵敏度及检出限，可在医学痕量检测仪器上使用。
【附图说明】
图1是实施例1制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的透射电镜图。
图2是实施例1制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的扫描电镜图。
图3是实施例1制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的红外光谱图。
图4是实施例1制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的X射线电子衍射谱图。
图5是吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯不同摩尔比所制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的红外光谱图。
【具体实施方式】
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、预处理吡咯单体
将市售吡咯在0.02MPa减压蒸馏，收集70～80℃馏分，得到吡咯单体，充氮气保护，避光保存于4℃冰箱内，备用。
2、化学反应
取N-(2-羧乙基)吡咯单体0.5026g、吡咯单体0.5mL，加入到盛有1mL正戊醇的锥形瓶中，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.5，震荡溶解，加入60mL质量浓度为86.8g/L的十二烷基硫酸钠水溶液，充分搅拌30分钟，缓慢加入8mL物质的量浓度为1.35mol/L的FeCl3·6H2O水溶液，吡咯单体与正戊醇、质量浓度为86.8g/L的十二烷基硫酸钠水溶液、物质的量浓度为1.35mol/L的FeCl3·6H2O水溶液的体积比为1∶2∶120∶16，室温搅拌反应12小时，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液。
3、分离
在含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液中加入甲醇破乳，含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液与甲醇的体积比为1∶2，8000转/分钟离心分离10分钟，沉淀物用甲醇洗涤2～3次，再用蒸馏水洗至蒸馏水无色为止。
4、干燥
洗涤后的沉淀物在真空度为0.01MPa的电热恒温真空干燥箱内60℃干燥3～5小时，制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
所制备的产物用透射电镜、扫描电子显微镜、红外光谱仪、X-射线衍射仪进行了表征，透射电镜观测结果见图1，扫描电子显微镜照片见图2，红外光谱图见图3，X-射线衍射谱图见图4。
由图1、图2可见，产物呈类球形，分散较为均匀，粒径为40～50nm。
由图3可见，3440、1545cm-1为吡咯环上-NH的特征吸收峰，1308cm-1和1043cm-1分别为吡咯环上C-N伸缩振动吸收峰和C-H键的变形振动吸收峰，1702cm-1处的特征吸收峰则证实了聚合物上羧基的存在。通过红外光谱数据分析，所制备的产物为吡咯和N-(2-羧乙基)吡咯两种单体的复合物，且表面具有功能化羧基官能团。
由图4可见，2θ在15°和30°之间出现了聚吡咯的无定型衍射峰，另外还出现一些尖峰，说明所制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的结晶度好于聚吡咯，对于改善聚吡咯不溶不融、难以加工的性质具有一定的意义。目前，通过X-射线衍射图谱计算结晶度最常用的方法是分峰法。分峰法首先对衍射图谱进行分峰处理，计算各个峰的面积，然后以总的峰面积除以总衍射面积，计算出结晶度。通过计算机软件模拟，吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的结晶度为7.9％。
实施例2
在本实施例的化学反应步骤2中，取N-(2-羧乙基)吡咯单体0.1256g、吡咯单体0.5mL，加入到盛有0.75mL正戊醇的锥形瓶中，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.125，震荡溶解，加入40mL质量浓度为86.8g/L的十二烷基硫酸钠水溶液，充分搅拌30分钟，缓慢加入6mL物质的量浓度为1.35mol/L的FeCl3·6H2O水溶液，吡咯单体与正戊醇、质量浓度为86.8g/L的十二烷基硫酸钠水溶液、物质的量浓度为1.35mol/L的FeCl3·6H2O水溶液的体积比为1∶1.5∶80∶12，室温搅拌反应12小时，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液。其他步骤与实施例1相同。制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
实施例3
在本实施例的化学反应步骤2中，取N-(2-羧乙基)吡咯单体1.0052g、吡咯单体0.5mL，加入到盛有1.35mL正戊醇的锥形瓶中，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶1，震荡溶解，加入80mL质量浓度为86.8g/L的十二烷基硫酸钠水溶液，充分搅拌30分钟，缓慢加入10.55mL物质的量浓度为1.35mol/L的FeCl3·6H2O水溶液，吡咯单体与正戊醇、质量浓度为86.8g/L的十二烷基硫酸钠水溶液、物质的量浓度为1.35mol/L的FeCl3·6H2O水溶液的体积比为1∶2.7∶160∶21.1，室温搅拌反应12小时，得到含有吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的混合液。其他步骤与实施例1相同。制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
实施例4
在上述实施例1～3的化学反应步骤2中，所用表面活性剂十二烷基硫酸钠用等质量的苯磺酸钠替换，氧化剂FeCl3·6H2O用等摩尔的(NH4)2S2O8替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。其他步骤与实施例1相同。制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
实施例5
在上述实施例1～3的化学反应步骤2中，所用表面活性剂十二烷基硫酸钠用等质量的十二烷基苯磺酸钠替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。其他步骤与实施例1相同。制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
实施例6
采用本发明实施例1制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子在制备凝血酶电化学发光探针中的应用如下：
将N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐溶于pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液中，在磷酸盐缓冲溶液中N-氨基琥珀酰胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐的物质的量浓度均为0.1mol/L，加入2mg吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子，室温活化1小时，再加入350μL物质的量浓度为10μmol/L的凝血酶适体II和500μL物质的量浓度为6.3μmol/L的氨基钌联吡啶衍生物，氨基钌联吡啶衍生物与凝血酶适体II、N-氨基琥珀酰胺、1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐、吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的质量比为1∶11∶4020∶6678∶700，室温搅拌过夜，12000转/分钟离心分离10分钟，沉淀物用物质的量浓度为0.5mol/L的NaCl水溶液洗涤3次，所得沉淀震荡分散于1mL pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液中，制备成凝血酶电化学发光探针。
将石墨电极插入2mL含有物质的量浓度为0.005mol/L的对氨基苯磺酸和物质的量浓度为0.10mol/L的氯化钾的水溶液中，用循环伏安法以10mV/s的扫速从0.5～1.40V扫四圈，取出电极，用蒸馏水冲洗1分钟，在2mL物质的量浓度为0.04mol/L的PCl5丙酮溶液中浸泡30分钟，取出电极，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面3分钟，向电极表面滴加5μL物质的量浓度为10μmol/L的凝血酶适体I，室温培育6小时，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液清洗电极表面3分钟，制备成凝血酶适体传感器。在凝血酶适体传感器上滴加5μL物质的量浓度为1.0×10-15～1.0×10-12mol/L的凝血酶，室温培育30分钟，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液清洗电极表面3分钟，再滴加3μL凝血酶电化学发光探针，室温培育20分钟，用pH为7.40的磷酸盐缓冲溶液清洗电极表面3分钟，室温放置至电极表面干燥。所得电极用于检测凝血酶。
其他实施例制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子用于制备凝血酶电化学发光探针的方法与上述方法相同。
为了确定本发明的最佳工艺步骤，发明人进行了大量的实验室研究试验，各种试验情况如下：
实验仪器：高分辨透射电子显微镜，型号为JEM-2100，由日本电子公司生产；尼高力傅里叶变换红外光谱仪，型号为AVTAR360，由尼高力仪器公司生产。
1、N-(2-羧乙基)吡咯单体用量对吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子粒径的影响
取N-(2-羧乙基)吡咯单体0.1256g、0.1884g、0.2512g、0.3768g、0.5026g、1.0052g共6份，分别加入到盛有1mL正戊醇的锥形瓶中，再分别加入0.5mL吡咯单体，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比分别为1∶0.125、1∶0.167、1∶0.25、1∶0.333、1∶0.5、1∶1。其他步骤与实施例1相同，制备成吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子。
所制备的产物用透射电子显微镜进行观测，观测结果见表1；采用傅里叶变换红外光谱仪进行了表征，红外光谱图见图5。
表1 N-(2-羧乙基)吡咯单体用量对吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子粒径的影响
吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体 摩尔比 1∶0.125 1∶0.167 1∶0.25 1∶0.333 1∶0.5 1∶1 吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子 粒径(nm) 200 100 50 40 40 80
由表1可知，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比对产物的粒径影响较大，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.125时，吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的粒径为200nm，摩尔比为1∶0.167时，吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子粒径为100nm，随着N-(2-羧乙基)吡咯单体量的加大，粒子粒径逐渐减小，摩尔比为1∶0.5时，吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的粒径为40nm，呈类球形，且分散较为均匀，摩尔比为1∶1时，粒径又增大为80nm。
在图5中，曲线a、b、c、d、e、f分别是吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.125、1∶0.167、1∶0.25、1∶0.333、1∶0.5、1∶1的红外光谱曲线。由图5可见，曲线a和曲线b上1702处羧基峰不太明显，随着N-(2-羧乙基)吡咯单体量的加大，红外光谱上1702cm-1峰的强度逐渐变强，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.5、1∶1时，羧基峰较为明显，证实了纳米粒子上羧基的存在，适用于制备凝血酶电化学发光探针。
由以上实验数据可知，吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.125～1时，所制备的吡咯/N-(2-羧乙基)吡咯复合纳米粒子的粒径均较小。本发明选择吡咯单体与N-(2-羧乙基)吡咯单体的摩尔比为1∶0.125～1，最佳选择1∶0.5。
为了验证本发明的有益效果，发明人利用电化学发光分析系统对实施例6制备的电极检测凝血酶的效果进行了测试，各种试验情况如下：
实验仪器：MPI-E型电致化学发光分析系统，由西安瑞迈分析有限仪器公司生产。
实验方法：将本发明实施例6制备的电极作为工作电极，插入到2mL含物质的量浓度为0.1mol/L的正三丙胺的磷酸盐缓冲溶液的电化学发光池中，以铂电极为对极，以Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极，在MPI-E电致化学发光分析仪上，采用计时电流法，在电位为1.35V时，对不同浓度的凝血酶进行电化学发光强度测试。
实验结果表明，凝血酶的浓度为1.0×10-15～1.0×10-12mol/L时，凝血酶浓度的对数和电化学发光强度呈线性相关，其线性回归方程为：
S＝722.01×lgC+10956
其中S是电化学发光强度，C是凝血酶的浓度，相关系数R2＝0.9958，检出限为5.0×10-16mol/L(S/N＝3)，低于已报道值6×10-11mol/L。
同时为了验证凝血酶适体I、凝血酶适体II仅对凝血酶有特异性识别作用，分别对1.0×10-10mol/L牛血清白蛋白、1.0×10-10mol/L血红蛋白、1.0×10-10mol/L免疫球蛋白G、1.0×10-10mol/L溶菌酶、1.0×10-12mol/L的凝血酶和1.0×10-12mol/L的凝血酶与上述四种同等浓度的蛋白混合成的混合溶液进行检测，以不加凝血酶为空白，在相同条件下测定电化学发光强度，平行测量三次，根据下述公式计算电化学发光强度增强值：
测试和计算结果见表2。
表2 实施例6制备的电极检测不同蛋白的电化学发光强度
溶菌酶 血红蛋白 牛血清蛋白 免疫球蛋白G 空白 凝血酶 混合溶液 发光强度 (a.u.) 126±29 136±35 125±22 139±21 110±23 2342±137 2333±240 发光强度 增强值(％) 0.72 1.2 0.67 1.3 —— —— 99.6
由表2可见，使用牛血清白蛋白、血红蛋白、免疫球蛋白G、溶菌酶进行实验时，只能检测到与空白值相近的电化学发光信号，与凝血酶的电化学发光强度增强值相比，分别增大0.67％、1.2％、1.3％、0.72％。这说明只有凝血酶存在时，才能构建夹心结构，检测到很强的电化学发光信号。混合溶液测得的电化学发光强度与1.0×10-12mol/L凝血酶所得的电化学发光强度无显著差异，说明制备的凝血酶电化学发光探针用于检测凝血酶具有良好的选择性。