PDK1SIRNA序列及其融合表达载体.pdf

本发明公开了PDK1-siRNA序列及其融合表达载体，属于生物技术领域。该序列与PDK1 mRNA互补；具有降低PKD1蛋白表达的功能。其核酸序列为：GAAGGATACGGACCTCTTAAA和CACGCCTAACAGGACGTATTA。PDK1-siRNA融合表达载体是由合成的抑制PDK1基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成，将其转染MDA-MB-231细胞后能够特异降解与siRNA同源的PDK1的mRNA，抑制PDK1蛋白表达，为进一步研究PKD1基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。

1.  PDK1-siRNA序列，其特征是：该序列与PDK1 mRNA互补；具有抑制人PKD1蛋白表达的功能，其核酸序列分别如下：
5’-GAAGGATACGGACCTCTTAAA-3’，其作用位点：AF017995(1071-1091)；
5’-CACGCCTAACAGGACGTATTA-3’，其作用位点：AF017995(1631-1651)。

2.  一种PDK1-siRNA融合表达载体，其特征在于：该融合表达载体是由合成的抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成，将其转染MDA-MB-231细胞后能够特异降解与siRNA同源的PDK1的mRNA，抑制PDK1蛋白表达，
其中合成人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列模板为：两端带有酶切位点，3’端为HindIII，5’端为BamH I，合成抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列如下：
5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA
TTTAAGAGG TCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’；
5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGA
TAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。

PDK1-siRNA序列及其融合表达载体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是两段能抑制人PDK1基因表达的PDK1-siRNA序列及其融合表达载体。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是多数真核细胞本身固有的一种自我保护现象，既能对抗如病毒基因或人工转基因所表达的mRNA等外源基因的侵害，又能降解自身异常基因产生的mRNA。以基因转录后沉默的方式或诱导DNA甲基化的方式对含有其同源序列的基因表达进行干涉。
近年来，人们利用这一现象针对要研究的基因表达进行阻断，从而产生相应的功能缺失表型，形成RNAi技术。新近的RNAi技术，是利用DNA表达载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA)，特异性封闭相应的靶基因mRNA，抑制mRNA的翻译。这与早期的RNA干扰技术相比，该方法的特异性和干扰效率均有较大提高，已广泛应用于多种研究领域。
3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(Phosphoinositide-dependent kinase1，PDK1)是1997年被发现的一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是EGFR下游的重要信号分子，它可以通过磷化某个苏氨酸位点激活很多下游的信号分子，如Akt、PKC(Protein kinase C)zeta、PKA(Protein kinase A)、S6K(p70 ribosomal S6 kinase)、SGK(serum-andglucocorticoid-stimulated protein kinase)、RSK(p90 ribosomal S6kinase)等。PDK1和这些下游底物均属于AGC超家族中的成员。PDK1下游的这些激酶参与了很多细胞生理过程，使得PDK1在细胞生长和增殖、细胞迁移、细胞周期、蛋白合成、糖原合成、细胞分化、细胞存活及细胞骨架重排中发挥着不可磨灭的作用。此外，在乳腺癌细胞特别是高转移性的乳腺癌细胞中PDK1的表达水平都有所升高。由此可见，PDK1生物学特性在肿瘤增值和转移过程中起到重要作用。
发明内容
本发明是为进一步研究PDK1在肿瘤发生发展中的作用，以及为PDK1为靶点的肿瘤的基因治疗提供了一个新的技术手段，而提供了两段抑制人PDK1基因表达的PDK1-siRNA序列及其融合表达载体。
本发明通过基因敲除技术，即siRNA方法抑制PDK1的表达。利用RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持在沉默或休眠状态，从而使肿瘤细胞增殖速度减慢，凋亡加快，显示了RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性。RNAi过程中，由双链RNA分子加工而成的19-23个核苷酸的RNAs就称为siRNA，是诱导基因沉默的第一步，它与RNAi特异性酶结合，形成沉默复合物，特异降解与siRNA同源的靶mRNA。
PDK1-siRNA序列，该序列与PDK1 mRNA互补；具有抑制人PKD1蛋白表达的功能，
其核酸序列如下：
5’-GAAGGATACGGACCTCTTAAA-3’，
其作用位点AF017995(1071-1091)；
5’-CACGCCTAACAGGACGTATTA-3’，
其作用位点AF017995(1631-1651)。
一种PDK1-siRNA融合表达载体，该融合表达载体是由合成的抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成，将其转染MDA-MB-231细胞后能够特异降解与siRNA同源的PDK1的mRNA，抑制PDK1蛋白表达，
其中合成人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列模板为：两端带有酶切位点，3’端为HindIII，5’端为BamH I，合成抑制人PDK1基因表达的siRNA序列模板的核酸序列如下：
5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA
TTTAAGAGGTCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’；
5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGA
TAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’。
本发明通过脂质体将融合载体转入MDA-MB-231人乳腺癌细胞系中，以control-siRNA作为对照，通过潮霉素压力筛选得到稳定细胞株，用RT-PCR、Western Blot方法检测细胞的PDK1表达水平。
结果表明：表达PDK1-siRNA作用的细胞其PDK1的合成明显降低，与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)。
本发明设计的PDK1-siRNA序列及融合表达载体能够在人乳腺癌细胞中表达特定的siRNA，并能够有效地抑制人PDK1的基因表达，为进一步研究PDK1基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。
这样设计的本发明为进一步研究PDK1在肿瘤发生发展中的作用以及为以PDK1为靶点的肿瘤基因治疗提供了一个新的技术手段。
附图说明
附图是转染PDK1-siRNA融合载体后细胞PDK1蛋白和mRN A表达量。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
一.实验材料来源：
人乳腺癌MDA-231细胞由美国国家癌症研究所Dr.Joost J.Oppenheim赠送；pRNAT-U6.1/Hygro质粒购自GenScript公司；Hygromysin来自Invitrogen。PDK1抗体购自BD Transduction(SanJose，CA)。
二.实施方法：
1.PDK1-siRNA的设计
依据Ambion公司在网上提供的设计软件
(www.ambion.com/techlib/misc/siRNA finder.html)选择siRNA序列，合成以下PDK1特异的siRNA：
5’-GGATCCCAAGAAGGATACGGACCTCTTAAATTCAAGAGA
      TTTAAGAGG TCCGTATCCTTCTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’，
其作用位点：AF017995(1071-1091)；
5’-GGATCCCAACACGCCTAACAGGACGTATTATTCAAGAGA
     TAATACGTCCTGTTAGGCGTGTTTTTTTTCCAAAAGCTT-3’，
其作用位点：AF017995(1631-1651)。
2.PDK1-siRNA融合表达载体构建
表达载体pRNAT-U6.1/Hygro其结构为线性，两端分别为BamHI和HindIII酶切位点的粘性末端。将合成的PDK1-siRNA模板退火，连入pRNAT-U6.1/Hygro质粒载体中，转染感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养。挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列。
阴性对照Control-siRNA载体由试剂盒提供，含有一段与人类已知基因均不同源的siRNA。
3.融合表达载体转染乳腺癌细胞株
应用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒提取纯化质粒，用800μl低渗液将20μg重组质粒与1×10⁶细胞混合，采用1000v电压电转100μs，静置5min，传入96孔板，5％CO2温箱孵育24h。添加0.8mg/ml HygromycinB压力筛选至非转染对照组细胞完全死亡，约20d，将表达GFP的单克隆挑出扩大培养。
结果表明得到5个稳定克隆，其编号分别为52、60、63、97、99.
4.检测转染后细胞中PDK1的表达水平
定量PCR检测Akt2的表达水平：将对照细胞和Akt2-siRNA转染的细胞(52、60、63、97、99)，用Trizol试剂提取细胞的总RNA，电泳检测质量，紫外分光定量。以相同量RNA作为起始模板，逆转录反应合成cDNA。用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒在定量PCR仪GeneAmp 5700上进行实时定量PCR，反应体系为95℃预变性15min，94℃变性15s，50℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次。用SDS Software及琼脂糖凝胶电泳分析结果。
免疫印迹的方法检测PDK1的表达水平：将对照细胞和PDK1-siRNA转染的细胞(52、60、63、97、99)预留足够数量至离心管中，离心后裂解细胞，煮样，超声，再离心。制得样品后，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。根据样品的浓度，取相同的蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室温牛奶封闭2小时。简单洗涤后，一抗(鼠抗人PDK1单克隆抗体)室温孵育2小时。然后用抗鼠的二抗室温孵育1小时。最后用化学发光试剂盒检测。根据曝光后条带的宽窄和深浅判断蛋白的表达量。每个克隆至少通过3次免疫印迹进行检测。
如图1所示，PDK1-siRNA融合表达载体转染入乳腺癌细胞，通过定量PCR和免疫印迹的方法证明：与对照细胞相比，克隆52、60、63、97、99中的PDK1表达量均有所降低。
SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学附属肿瘤医院
<120>PDK1-siRNA序列及其融合表达载体
<130>DNA
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400>1
gaaggatacg gacctcttaa a                                              21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>2
<222>(1)..(21)
<223>
<400>1
cacgcctaac aggacgtatt a                                              21
<210>3
<211>78
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>3
<222>(1)..(78)
<223>
<400>1
ggatcccaag aaggatacgg acctcttaaa ttcaagagat ttaagaggtc cgtatccttc    60
ttttttttcc aaaagctt                                                  78
<210>4
<211>78
<212>DNA
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>4
<222>(1)..(78)
<223>
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ggatcccaac acgcctaaca ggacgtatta ttcaagagat aatacgtcct gttaggcgtg    60
ttttttttcc aaaagctt                                                  78