产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒及检测方法.pdf

本发明提供了一种产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒及其检测方法。所述检测试剂盒主要包括特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物(dNTP)和DNA聚合酶，所述特异性扩增引物如下：上游引物序列为：5’-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGTACG-3’；下游引物序列为：5’-CGTCAGACAGCCACTGGACACGG-3’。本发明有益效果主要体现在：1.早期预报：本法是快速准确的受黄曲霉毒素潜在威胁的食物或饲料样品的微生物检测技术，是解决问题的根本的早期预报途径；2.操作方便省时省力：与传统的产毒培养技术相比，本发明提供的检测方法省时省力，可在3天内完成检测；3.灵敏度高特异性强，由于产毒培养受环境影响较大，易产生假阴性，采用特异性基因扩增技术，诊断的灵敏度更高，特异性更强。

1.  一种产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于：所述特异性扩增引物如下：
上游引物序列为：
5’-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGTACG-3’；
下游引物序列为：
5’-CGTCAGACAGCCACTGGACACGG-3’。

2.  一种产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR的检测方法，所述方法包括：
(1)提取样品DNA；
(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、MgCl₂、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，加入待测样品DNA配成PCR反应液，进行PCR扩增反应：
所述特异性扩增引物如下：
上游引物序列为：
5’-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGTACG-3’；
下游引物序列为：
5’-CGTCAGACAGCCACTGGACACGG-3’；
(3)PCR扩增产物进行电泳凝胶成像，在DNA分子量标记物1000bp处出现条带，则判断为产黄曲霉毒素调节基因阳性。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于所述脱氧三磷酸核苷混合物为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1的混合物。

4.  如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR反应液终浓度组成如下：
PCR缓冲液          终浓度为1×
MgCl₂              1～3mM
特异性扩增引物     0.1～0.3μM
rTaq DNA聚合酶     0.5～5U/反应
dNTPs              0.2～0.4mM
待测样品DNA        10～10⁵ng/反应
溶剂为DEPC水。

5.  如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件如下：94℃变性2min，94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸7min。

6.  如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下：
(1)取待测菌株培养物，提取待测菌株DNA；
(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、MgCl₂、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入待测菌株DNA、阳性对照菌株DNA或空白对照作为分析样本，配成PCR反应液，进行PCR扩增反应：
所述PCR反应液终浓度组成如下：
PCR缓冲液             终浓度为1×
MgCl₂                 2.0mM
特异性扩增引物        0.2μM
rTaq DNA聚合酶        1U/反应
dNTPs              0.2mM
分析样本DNA        400ng/反应
溶剂为DEPC水；
PCR扩增反应条件如下：
94℃变性2min，94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)取PCR扩增产物进行电泳凝胶成像，在DNA分子量标记物1000bp处出现条带，则判断为产黄曲霉毒素调节基因阳性。

产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒及检测方法
(一)技术领域
本发明涉及一种产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒及其检测方法。
(二)背景技术
黄曲霉毒素是目前所知最强的致癌物质，其致癌力是致癌物二甲基奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3，4-苯并芘的致癌力大4000倍。黄曲霉毒素对于人、畜、禽的毒害均与其抑制细胞中遗传信息的传递进而干扰蛋白质的合成有关。黄曲霉毒素还与人类的其它致病因素(如肝炎病毒等)具有叠加效应。2004年至2005年间，肯尼亚持续暴发了历史上最大规模的黄曲霉毒素中毒事件，导致150人死亡。2005年7月美国疾病预防控制中心和世界卫生组织在日内瓦联合召开国际真菌毒素专家与行政官员研讨会，讨论如何在发展中国家降低食品污染导致黄曲霉毒素中毒发病率和死亡率的公共卫生策略。会议的宗旨体现了国际组织已经将控制食品中真菌毒素污染和控制人群暴露导致中毒提升为全球公共卫生管理的重要目标。世界各国卫生监管部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并强制监督企业执行。然而，污染源头的控制仍是非常困难的，因为产毒素的黄曲霉在食物或食品原料中的存在相当普遍，而被黄曲霉污染的粮食和食品，在尚未产毒前或黄曲霉毒素含量水平很低时，国内还缺乏快速有效的技术进行检测监控。目前有关黄曲霉毒素的检测已有成熟的检测规范，而对产黄曲霉毒素病原物本身的检测关注不多，远落后于有关毒素检测技术的研究和应用。
传统检测产黄曲霉毒素真菌的手段多采用待检菌株经产毒培养后用薄层层析法测定其产毒能力。通过稀释平板接种，采用鉴别培养基或免疫学的方法，既费时费力，又需要昂贵的设备，还要具备丰富的真菌学专业知识。即便如此，对假阳性出现及非必须纯化的样品也显得束手无策。比如，TLC法样品处理繁琐，分析时间长，灵敏度差。HPLC法虽能完成各毒素的分离，定量准确，但仪器昂贵，专业性很强，所需样品纯度要求高，常用的流动相和衍生生化试剂有剧毒，一般实验室难以采用。ELISA法虽可进行大批量检测，但重复性差，试剂寿命短，需低温保存，假阳性发生率较高。RIA要求使用放射性元素，对检测人员和环境极易造成污染。更加需要指出的是，上述所有方法都是针对已产生毒素样品的检测，而对于那些产黄曲霉菌株已经污染、但毒素尚未产生或产毒水平极低的样品却无能为力。即这些方法并不能对食品中污染的活菌进行检验，所以检测的情况只能静态地反映产品在取样时的污染状况，对于需要储藏和长时间运输的产品，则不能提供充分的安全数据。因此，开发研究快速准确的受黄曲霉毒素潜在威胁的食物或饲料样品的微生物检测技术，是解决问题的根本途径。
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1+X)ⁿ计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100％，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
目前PCR方法已广泛用于各种细菌的检测，但是在产毒真菌的检测却相对较少，1996年报道的检测产黄曲霉毒素调节基因aflR的引物，虽然有多篇报道使用，但经多次实验发现扩增效率不稳定，对阳性样品常不能出现扩增产物，进一步分析发现该产黄曲霉毒素调节基因上游引物：a.易形成引物二聚体，b.经Genbank的Blast分析(到2008年12月)87个aflR基因记录中有25个出现了多态性位点。很明显这对引物不能胜任目前对产黄曲霉毒素调节基因的PCR检测需要。本研究重新设计上下游引物并建立了相应的PCR方法为今后在产毒真菌的检测、鉴定领域开展进一步的研究和更大规模的使用奠定可靠的理论与技术基础。
该方法对提高进出口食品、饲料中产黄曲霉毒素真菌的检测效率及灵敏度、降低检测成本、提高我国进出口检验检疫的技术壁垒都具有十分重要的意义。同时，所建立的方法还可以应用于国内疾病控制中心、动物防疫站、粮食生产企业等单位对产黄曲霉毒素真菌的检测。随着我国加入WTO后粮食(谷物)、饲料(玉米、花生)进出口业务的不断上升，亟需采用先进的检测技术手段杜绝有潜在危险的粮食和饲料进入我国市场。建立常见产毒素真菌潜在危险的快速检测方法和评估体系，这不仅是开拓国内、国际畜产品和食品市场中急需解决的问题，而且为该领域的检测技术跻身世界先进行列均有重要意义，具有巨大的经济和社会效益。
(三)发明内容
本发明是根据上述原理，设计适合产黄曲霉毒素调节基因核酸的特异性引物，提供一种PCR检测产黄曲霉毒素调节基因核酸快速检测试剂盒及检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒，主要包括特异性扩增引物、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物(dNTP)和DNA聚合酶，所述特异性扩增引物如下：
上游引物序列为：
5’-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGTACG-3’；
下游引物序列为：
5’-CGTCAGACAGCCACTGGACACGG-3’。
本发明是以黄曲霉毒素生化合成途径中已知的产黄曲霉毒素调节基因aflR为目的基因设计引物，建立基于常规PCR的检测方法，用于快速准确地检测饲料或食品的潜在黄曲霉毒素污染，为在饲料和食品检测中推广应用这一技术提供科学和技术依据。
本发明关键在于特异性引物的设计，试剂盒中的其他组分，比如DNA聚合酶、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物等，均可参照本领域常规试剂盒组成。通常的，PCR反应液通常按如下组成配制(终浓度)：1×PCRbuffer、1～3mM MgCl₂、0.1～0.5μM的引物、0.5～5U/反应的rTaq DNA聚合酶、0.2～0.4mM的dNTPs，通常取2～μL的模板，溶剂为DEPC水，反应总体积通常为20～50μL。
本发明中，所述DNA聚合酶等基础试剂为rTaq DNA聚合酶试剂(其中已包括反应所需的DNA聚合酶和PCR缓冲液)，所述脱氧三磷酸核苷混合物通常为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1的混合物。
本发明还涉及一种产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR的检测方法，所述方法包括：
(1)提取样品DNA；
(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、MgCl₂、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，加入待测样品DNA配成PCR反应液，
进行PCR扩增反应：
所述特异性扩增引物如下：
上游引物序列为：
5’-CGAAAGCTCCGGGATAGCTGTACG-3’；
下游引物序列为：
5’-CGTCAGACAGCCACTGGACACGG-3’；
(3)PCR扩增产物进行电泳凝胶成像，在DNA分子量标记物1000bp处出现条带，则判断为产黄曲霉毒素调节基因阳性。
所述脱氧三磷酸核苷混合物(dNTP)为dATP、dTTP、dCTP、dGTP物质的量比1∶1∶1∶1的混合物。
所述PCR反应液终浓度组成如下：
PCR缓冲液         终浓度为1×
MgCl₂             1～3mM
特异性扩增引物    0.1～0.3μM
rTaq DNA聚合酶    0.5～5U/反应
dNTPs             0.2～0.4mM
待测样品DNA       10～10⁵ng/反应
溶剂为DEPC水。
所述PCR扩增反应条件如下：94℃变性2min，94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸7min。
PCR缓冲液终浓度为1×，是指PCR缓冲液中各组分在反应液中的终浓度与1×PCR buffer相同。10×PCR buffer组成为：100mmol/l Tris-HClpH8.3，15mmol/L KCl，0.01％(W/V)明胶，溶剂为DEPC水。
具体的，所述方法如下：
(1)取待测菌株培养物，提取待测菌株DNA；
具体方法如下：
真菌的培养：在无菌条件下用灼烧过的接菌环挑取一环的可疑产黄曲霉毒素真菌的孢子到装有5ml萨氏培养液的试管中，在25℃，180r/min，摇床培养48小时。产黄曲霉毒素真菌DNA的提取：从液体萨氏培养基中挑取菌丝(约0.3克)到研钵中。加液氮研磨菌丝至粉末状。加入500μLDNA提取液入研钵继续研磨使粉末状菌丝成悬浮液，菌丝悬浮液吸入灭菌的2.0ml EP管中。加5uL RNA酶液(10mg mL^-1)，37℃水浴10min后，再加约等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)后，剧烈震荡1min。4℃下2300×g离心10min。收集上清转移到新2.0mL EP管中，加等体积的氯仿-异戊醇(氯仿、异戊醇体积比24∶1)混匀后再同样离心10min。上清液转移至新的2.0ml的EP管中，添加10％体积NaAc，2.5体积无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃下保温1h。然后4℃下9300×g离心10min，收集沉淀，用75％乙醇600ul洗涤后相同条件下再次离心5min。空气中干燥沉淀5min。最后将200ul DEPC水溶解的DNA样品置于-20℃下保存备用。
(2)取特异性扩增引物、PCR缓冲液、MgCl₂、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，分别加入待测菌株DNA、阳性对照菌株DNA或空白对照作为分析样本，配成PCR反应液，进行PCR扩增反应：
所述PCR反应液终浓度组成如下：
PCR缓冲液         终浓度为1×
MgCl₂             2.0mM
特异性扩增引物    0.2μM(上下游引物各0.2μM)
rTaq DNA聚合酶    1U/反应
dNTPs             0.2mM(dNTP的总浓度)
分析样本DNA       400ng/反应
溶剂为DEPC水；
PCR扩增反应条件如下：
94℃变性2min，94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)取PCR扩增产物进行电泳凝胶成像，在DNA分子量标记物1000bp处出现条带，则判断为产黄曲霉毒素调节基因阳性。
具体步骤如下：
用0.5×TBE电泳缓冲液制备1.5％的琼脂糖凝胶(凝胶融化后冷却至60℃左右加入含量为0.5ug/mL的溴化乙锭，或者在电泳后用0.5ug/mL溴化乙锭溶液进行染色)，将8uLPCR产物与2uL加样缓冲液混合，分别加入到对应的凝胶孔中，另在一孔加入适量的DNA分子量标记物，选择合适的电压进行电泳(一般控制在50V/cm)，电泳时间30min，最后用凝胶成像系统进行观察分析，在DNA分子量标记物约1000bp处出现条带，则判断为产黄曲霉毒素调节基因阳性。
本发明有益效果主要体现在：
1、早期预报：传统检测黄曲霉毒素手段多采用薄层层析法HPLC法ELISA法，上述所有方法都是针对已产生毒素样品的检测，而对于那些产黄曲霉菌株已经污染、但毒素尚未产生或产毒水平极低的样品却无能为力。即这些方法并不能对食品中污染的活菌进行检验，所以检测的情况只能静态地反映产品在取样时的污染状况，对于需要储藏和长时间运输的产品，则不能提供充分的早期预报安全数据。因此，本法是快速准确的受黄曲霉毒素潜在威胁的食物或饲料样品的微生物检测技术，是解决问题的根本的早期预报途径。
2、操作方便省时省力：与传统的产毒培养技术相比(通常需要一周)，本发明提供的检测方法省时省力，可在3天内完成检测；
3、灵敏度高特异性强，由于产毒培养受环境影响较大，易产生假阴性，采用特异性基因扩增技术，诊断的灵敏度更高，特异性更强。
(四)附图说明
图1为浙江省粮食中分离的5株可疑产黄曲霉毒素真菌的产黄曲霉毒素调节基因PCR检测电泳结果图，图中标示，1：产黄曲霉毒素真菌调节基因阳性对照；2：产黄曲霉毒素真菌调节基因阴性对照；3和4：黄曲霉分离株AF05和AF18的产黄曲霉毒素调节基因检测阳性；5～7：黄曲霉分离株AF01、AF12和AF30的产黄曲霉毒素调节基因检测阴性。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
利用本发明所述的PCR方法对浙江省粮食中分离的5株可疑产黄曲霉毒素真菌进行检测，结果二株产黄曲霉毒素调节基因阳性，三株产黄曲霉毒素调节基因阴性，见图1。
具体方法如下：
(1)提取待测样品DNA；
真菌的培养：
取阳性对照和阴性对照菌株及5株可疑产黄曲霉毒素真菌，分别在无菌条件下用灼烧过的接菌环挑取一环的孢子到装有5ml萨氏培养液(4％葡萄糖，1％蛋白胨，1％酵母粉，溶剂为水)的7个试管中，在25℃，180r/min，摇床培养48小时。
产黄曲霉毒素真菌DNA的提取：
分别从液体萨氏培养基中挑取菌丝(约0.3克)到研钵中。分别加液氮研磨菌丝至粉末状。分别加入500μL DNA提取液入研钵继续研磨使粉末状菌丝成悬浮液，菌丝悬浮液吸入灭菌的2.0mL EP管中。分别加5uLRNA酶液(10mg/mL)(Takara公司)，37℃水浴10min后，再加约等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)后，剧烈震荡1min。4℃下2300×g离心10min。收集上清转移到新2.0mL7个EP管中，加等体积的氯仿-异戊醇(体积比24∶1)混匀后再同样离心10min。上清液转移至新的2.0ml的7个EP管中，添加等体积的10％(w/w)NaAc水溶液，2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀后置于-20℃下保温1h。然后4℃下9300×g离心10min，收集沉淀，用75％乙醇600ul洗涤后相同条件下再次离心5min。空气中干燥沉淀5min。最后将200ul DEPC水分别溶解的7个DNA样品(约100ng/μL)置于-20℃下保存备用。
(2)PCR扩增：
PCR反应液终浓度组成：
rTaq聚合酶试剂(Takara公司提供)    1μL
(其中含r Taq聚合酶1U/μL
MgCl₂                             2.0mM
dNTP                              0.2mM
(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各0.05mM)
特异性上游引物                    0.2μM
特异性下游引物                    0.2μM
待分析样本DNA(约100ng/μL)        4μL
DEPC水补足至25μL(其中PCR缓冲液浓度为1×)。
反应条件为94℃变性2min，94℃变性30s、59℃退火30s和72℃延伸90s，共35个循环，最后72℃延伸7min；
(3)凝胶电泳检测PCR产物和结果判断
用0.5×TBE电泳缓冲液制备1.5％的琼脂糖凝胶加样缓冲液(凝胶融化后冷却至60℃左右加入含量为0.5μg/mL的溴化乙锭)，将8uL PCR产物与2uL加样缓冲液混合，分别加入到对应的凝胶孔中，另在一孔加入适量的DNA分子量标记物，在50V/cm电压下进行电泳，电泳时间30min，最后用凝胶成像系统进行观察分析并记录，样品扩增凝胶电泳见图1。样品孔中得到约1000bp片段的菌株为产黄曲霉毒素调节基因检测阳性。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江省疾病预防控制中心
<120>产黄曲霉毒素调节基因核酸PCR检测试剂盒及检测方法
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>1
cgaaagctcc gggatagctg tacg    24
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>2
cgtcagacag ccactggaca cgg     23