结核分枝杆菌快速检测的方法.pdf

本发明公开了一种结核分枝杆菌快速检测的方法，它包括：1.将经过修饰的荧光蛋白基因和结核分枝杆菌启动子基因整合到结核分枝杆菌噬菌体内；2.取患者痰等标本用2～5倍的消化液室温消化10～50分钟，离心机离心10～30分钟，除上清液，用PBST缓冲液稀释沉淀后备用；3.取第二步中处理后的标本置于容器内，同时用缓冲液做空白试验，向标本和缓冲液中分别添加经过重组的结核分枝杆菌噬菌体，37度温育1～6小时；4.用荧光扫描仪在280～600nm波长下分别对标本和空白对照进行荧光强度检测即可。整个检测过程在4～6小时即可得到结果，而且不同标本的检测在同一个板子上实现，荧光检测同步进行，能够实现快速和高通量。

1、  一种结核分枝杆菌快速检测的方法，其特征在于：它包括下述步骤：
第一步，结核分枝杆菌噬菌体的重组：将5端用一个强启动子修饰的荧光蛋白基因和结核分枝杆菌启动子基因整合到结核分枝杆菌噬菌体内；
第二步，标本中结核分枝杆菌的富集：取患者痰标本，用2～5倍的消化液室温消化10～50分钟，在离心机内离心10～30分钟，去除上清液，用缓冲液稀释沉淀后备用；
第三步，用重组的噬菌体感染标本中的结核分枝杆菌：取第二步中处理后的标本置于容器内，同时用缓冲液做空白试验，向标本和缓冲液中分别添加第一步得到的经过重组的结核分枝杆菌噬菌体，37度温育1～6小时；
第四步，检测荧光强度：用荧光扫描仪在280～600nm波长下分别对标本和空白对照进行荧光强度对照检测即可。

2、  根据权利要求1所述的结核分枝杆菌快速检测的方法，其特征在于：所述经过基因重组的结核分枝杆菌噬菌体为D29或L5。

3、  根据权利要求1所述的结核分枝杆菌快速检测的方法，其特征在于：所述消化液为碱和N-乙酰-L-半胱氨酸混合液，二者重量之比为1000∶1～10。

结核分枝杆菌快速检测的方法
技术领域
本发明涉及一种医学领域的检测方法，尤其是涉及一种结核分枝杆菌快速检测的方法。
背景技术
作为一种古老的传染病，结核病的疫情在全球呈上升趋势。据WTO估计，目前全世界约有20亿人感染结核杆菌，每年有800万新发病例和300万人的死亡。在我国，根据2000年第四次全国结核病调查估算，全国约有5.5亿结核病例，将近全国人口的一半。我国目前结核病的形式严峻，尽快建立先进的诊断技术和治疗措施，是一个紧迫的任务，不仅关系到千万人的身心健康，也是关系到国计民生和国家经济发展的重要问题。
传统的结核病诊断方法是涂片显微镜检查和细菌培养法，这些方法从1880年Robert Koch鉴定结核分枝杆菌一直沿用至今。虽然涂片法检查比较简单，但检出率低，单独应用会造成大量漏检；普通培养法虽然比较经典，结果准确，但非常缓慢(一般需40天左右)，延误诊断和及时治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在4～6小时即可得出结果的结核分枝杆菌快速检测的方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的结核分枝杆菌快速检测的方法，它包括下述步骤：
第一步，结核分枝杆菌噬菌体的重组：将5`端用一个强启动子修饰的荧光蛋白基因和结核分枝杆菌启动子基因整合到结核分枝杆菌噬菌体内；
第二步，标本中结核分枝杆菌的富集：取患者痰标本，用2～5倍的消化液室温消化10～50分钟，在离心机内离心10～30分钟，去除上清液，用缓冲液稀释沉淀后备用；
第三步，用重组的噬菌体感染标本中的结核分枝杆菌：取第二步中处理后的标本置于容器内，同时用缓冲液做空白试验，向标本和缓冲液中分别添加第一步得到的经过重组的结核分枝杆菌噬菌体，37度温育1～6小时；
第四步，检测荧光强度：用荧光扫描仪在280～600nm波长下分别对标本和空白对照进行荧光强度对照检测即可。
所述经过基因重组的结核分枝杆菌噬菌体为D29或L5。
所述消化液为碱和N-乙酰-L-半胱氨酸混合液，二者重量之比为1000∶1～10。
本发明的优点在于将经过启动子基因修饰的荧光蛋白基因整合到结核分枝杆菌噬菌体内，用经过基因重组的噬菌体感染结核分枝杆菌，噬菌体将基因片段注入结核分枝杆菌体内，在启动子的作用下，利用结核分枝杆菌的细胞器对荧光蛋白的基因进行复制和荧光蛋白的合成，应用荧光检测仪来检测标本中的荧光强度，间接判断标本中是否有结核分枝杆菌的存在，整个检测过程在4～6小时即可得到结果，而且不同标本的检测在同一个板子上实现，荧光检测同步进行，能够实现快速和高通量。
具体实施方式
本发明所述的结核分枝杆菌快速检测的方法，它包括下述步骤：
第一步，结核分枝杆菌噬菌体的重组：将绿色荧光蛋白基因重组到结核分枝杆菌噬菌体D29或L5中，在绿色荧光蛋白的5`端用一个强启动子修饰；
第二步，标本中结核分枝杆菌的富集：取患者痰标本0.5～5毫升，用2～5倍的消化液(碱和N-乙酰-L-半胱氨酸按照重量比1000∶1～10配制的混合液)室温消化10～50分钟，在离心机内3000～10000rpm离心10～30分钟，去除上清液，用0.1～0.5毫升的缓冲液稀释沉淀后备用；
第三步，用重组的噬菌体感染标本中的结核分枝杆菌：取第二步中处理后的标本0.1～0.5毫升置于洁净容器内，同时用PBST缓冲液做空白试验；向标本和PBST缓冲液中分别添加0.01～0.1毫升经过重组的结核分枝杆菌噬菌体D29或L5，37度温育1～6小时；
第四步，通过荧光扫描仪检测标本中的荧光强度：用荧光扫描仪在280～600nm波长下分别对各个标本和空白对照进行检测，记录各个标本和空白对照的荧光强度。
通过与空白对照的对比来判断标本中是否存在结核分枝杆菌：
将各标本的荧光强度分别与空白对照的荧光强度进行比较，如果标本的荧光强度比空白对照的荧光强度大，说明该标本里存在结核分枝杆菌，则为结核分枝杆菌检测阳性；如果标本的荧光强度小于或等于空白对照的荧光强度，则说明标本中不存在结核分枝杆菌，即结核分枝杆菌检测阴性。