分离与纯化单个病毒的方法.pdf

本发明提供一种单个病毒的分离与纯化方法，该方法包括以下步骤：①将病毒样品放置于平整的基底表面；②利用原子力显微镜对病毒进行成像，获取病毒的物理性质；③在适当的区域根据物理性质选定单个病毒；④用原子力显微镜针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖快扫描到病毒时，根据物理性质确定降低针尖的高度，使针尖与病毒接触，并进行“推”的纳米操纵，通过改变探针针尖的减低的高度来调节针尖与病毒之间的作用力，使病毒吸附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。本发明能够对单个病毒进行分离，且能进行定位分离，即根据病毒的形貌、大小、弹性等物理性质的不同有目标性的分离特定的病毒颗粒。此外，本发明使得可以对RNA或DNA进行后续生化分析，具有重要的生物学意义和应用价值。

1、  一种单个病毒的分离与纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤：
(1)将病毒样品放置于平整的基底表面；
(2)利用可成像的分离装置对病毒样品进行成像，并获取病毒的物理性质；
(3)根据物理性质选定单个病毒；
(4)用分离装置探针针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖扫描到病毒附近时，根据所要分离的病毒的物理性质，降低针尖到一定高度，使针尖与病毒接触并将病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。

2、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于该基底为原子级平整的基底。

3、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于病毒样品是经纯化或不纯化的病毒溶液或含有病毒的组织或细胞切片。

4、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于选定单个病毒的步骤中，所述病毒的物理性质是根据病毒的形貌、大小、弹性选择。

5、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述使针尖与病毒接触并将病毒黏附在针尖上的步骤是通过推的纳米操纵，改变探针针尖的降低的高度来调节针尖与病毒之间的作用力而实现。

6、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述单个病毒的分离包括一次只分离一个病毒或连续分离单个病毒。

7、  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述分离装置为原子力显微镜或基于原子力显微镜原理的装置。

8、  、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于该基底为云母、硅片、玻璃、石墨或化学修饰后的基底。

9、  根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于病毒样品中的单个病毒是有包膜的病毒颗粒或裸露病毒。

10、  根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述病毒样品为处于空气、液体或真空环境的样品。

11、  根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述探针针尖的降低通过抬高样品、改变设置点或振幅大小实现。

12、  根据权利要求1、5或11所述的方法，其特征在于所述探针的针尖为经过修饰的或不经修饰的。

13、  根据权利要求1、5或11所述的方法，其特征在于所述探针的针尖为单个或阵列。

14.  根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述病毒样品为处于空气、液体或真空环境的样品。

15、  根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述探针的针尖为单个或阵列。

分离与纯化单个病毒的方法
技术领域
本发明涉及一种病毒的分离与纯化方法，特别是一种基于原子力显微镜纳米操纵技术分离单个病毒的方法。
背景技术
对生物分子的分离分析一直是生物学研究的关键技术和重要内容。生命科学和生物技术的迅猛发展迫切需要在更加微观的尺度上(单细胞或单分子水平)将其分离进而获取相关生物化学信息的手段和工具(大学化学，2004，19：10-15)。近十年来，先后涌现出了各式各样可以分离微量甚至单个特定生物体的技术(分析试验室，2002，21：97-104)，主要包括流式细胞术(Cytometry，2000，42：284-289)、激光捕获显微分离(Science，1996，274：998-1001)、毛细管电泳(Journal of Chromatography B，1999，722：141-151)、双向电泳(Trends Food.Sci.Technol.，1995，6：51-58)、光镊(Trends Food.Sci.Technol，1995，6：51-58)、磁镊(Nature ReviewsMolecular Cell Biology，2000，1：130-136)、微流控芯片(Applied PhysicsLetters，2004，84：1786-1788)。由于技术局限，目前这些手段大多还处于分离单个细胞或者痕量分子，其分辨率也只有微米尺度，但对单个病毒和单个病毒的分离仍然是比较困难的，并且不能够定位分离。
原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)不仅是一种具有纳米分辨率的成像手段，而且也是一种可以进行纳米定位操纵的工具(Micron，2002，33：385-397)。人们先后尝试了用AFM探针分离微量甚至单个生物分子。如Heckl教授领导的研究小组于1997年率先实现了对染色体的特定区域的精确分离(J Struct.Biol.，1997，119：232-237)，但获得的物质是包括蛋白质与核酸等在内的混合物，无法每次都获得完全一致的样品；后来，Oesterhalt等用AFM针尖从嗜盐菌紫膜上分离出了单个蛋白质分子(Science，2000，286：143-146)，但问题在于事先要特定的抗体对针尖做修饰，其重复性也存在问题；2003年Osada等将AFM针尖插入到细胞内部分离mRNA，从而研究了基因在细胞内的表达情况，但这只能够通过随机黏附的方式来实现，无法准确定位，更不能保证每次分离的数量(Journal of Nanobiotechnology，2003，1：2)。Lu等用AFM针尖成功地实现了对单个DNA分子的定位切割和分离(J.Am.Chem.Soc.，2004，126：11136-11137)，但由于病毒大多为蛋白质外壳包被的颗粒，直径在几十纳米到几百纳米大小，要比蛋白质和DNA大很多，且十分易碎，但目前还没有用AFM来分离单个病毒的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是克服上述已有技术的局限，提供一种可对单个病毒分离与纯化的方法。
本发明所提供的一种单个病毒的分离方法概括地说就是采用纳米操纵技术分离单个病毒的方法。具体地说，该方法包括下列步骤：
(1)将病毒样品放置于平整的基底表面；
(2)利用可成像的分离装置对病毒样品进行成像，并获取其物理性质；
(3)根据物理性质不同选定单个病毒；
(4)用分离装置探针针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖扫描到病毒附近时，根据所要分离的病毒的物理性质，降低针尖到一定高度，使针尖与病毒接触并将病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。
所说的基底，最好是原子级平整的基底，可以是云母，也可以是硅，也可以是玻璃、也可以是石墨，还可以是化学修饰后的基底。
所说的病毒样品可以是经纯化或不纯化的病毒溶液，也可以是含有病毒的组织或细胞切片。
所说的单个病毒可以是病毒颗粒，也可以是裸露病毒。
所说的根据物理性质不同选定单个病毒，是根据病毒的形貌、大小、弹性选择。
所述使针尖与病毒接触并将病毒黏附在针尖上的步骤是通过推的纳米操纵，改变探针针尖的降低的高度来调节针尖与病毒之间的作用力而实现。
所说的分离单个病毒，可以是一次只分离一个病毒，也可以是连续分离单个病毒。
所述分离装置为原子力显微镜或基于原子力显微镜原理的装置。
所说的分离装置的探针可以经过修饰或不经修饰。
所说分离装置的探针的针尖为单个，也可以是探针阵列，从而可以进行并行分离。
所说的分离装置的探针可对处于空气、液体或真空环境的样品进行分离。
所说的探针针尖的降低可以通过抬高模式(lift mode)，也可以通过改变设置点(setpoint)或振幅大小实现。
所说的病毒可以为不同大小、不同形状、有或无包膜、DNA病毒或RNA病毒，类病毒或病毒样颗粒。
本发明能够对单个病毒进行分离，且能进行定位分离。由于是定位分离，就可以根据病毒的性质、大小、弹性等物理性质的不同有目标性的分离特定的病毒颗粒。且由于绝大多数病毒是由蛋白质包被的RNA或DNA的颗粒，并且容易破裂，所以通常分离DNA或蛋白质的技术是无法实现对单个病毒的分离的。也正是由于大多数病毒是蛋白质包被的RNA或DNA颗粒，本发明对单个病毒分离的实现，使得可以对RNA或DNA进行后续生化分析，具有重要的生物学意义和应用价值。
附图说明
图1是利用原子力显微镜探针分离病毒的过程示意图。其中a显示了分离前的状态，圈定的区域为要分离的病毒，b显示了探针黏附并分离病毒后的状态。
图2是利用原子力显微镜探针分离腺相关病毒：其中a为分离前的原子力显微镜图像；b为分离后的原子力显微镜图像。图中，标尺为500纳米。
图3是利用原子力显微镜探针分离古菌病毒：其中a为分离前的原子力显微镜图像；b为分离后的原子力显微镜图像。图中，标尺为500纳米。
具体实施方式
下面着重以腺相关病毒、古菌病毒、黄瓜花叶病毒、空壳腺相关病毒为例来说明本发明的方法。
实施例1：利用原子力显微镜纳米操纵技术分离与纯化单个腺相关病毒的方法
具体步骤如下：
1、将病毒样品放置于原子级平整的基底表面；
为了使病毒在基底表面有适中的吸附力以同时满足AFM成像和可以分离的需要，必须根据病毒本身的性质选择适当的基底或对基底进行适当的处理。为达到分离腺相关病毒的目的，我们选用了云母作为固态基底。
2、用原子力显微镜(AFM)对腺相关病毒进行成像，获得腺相关病毒的高度与大小等物理性质；
首先进行腺相关病毒样品准备，腺相关病毒购自本元正阳基因技术股份有限公司(目录号：A20115a，产品名称：rAAV2-Null)，病毒用超纯水稀释至107v.g/μl，取4μl上述病毒溶液滴加于洁净的云母片中心，静置5分钟用洁净空气或者液氮吹干，用AFM进行成像。成像时，采用AFM轻敲模式(tapping mode)，在相对湿度为30~40％下的大气条件下获取，见图2a。
3、在适当的区域选定单个病毒颗粒；
根据病毒的大小(直径20nm左右)与高度，选定所要分离的目标病毒。为了更有效的分离样品，最好是选择那些在基底上只有一个病毒，且在其周围一定距离内，没有其他样品存在的区域。选定样品后，将其定位在尽可能小的区域内的中心位置，然后执行分离过程。
4、用原子力显微镜针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖快扫描到病毒时，降低针尖，使针尖与病毒接触，并进行“推”的纳米操纵，通过改变设置点来改变探针针尖的减低的高度，从而调节针尖与病毒之间的作用力，使病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。
具体过程为：先用AFM轻敲模式扫描一条线，获得这条线的信息(力，或者它所转换成的高度)，然后对同一条线进行第二次接触模式(contact)扫描时进行监视和调整(改变扫描力的大小)从而实现对这条线的操纵。整个成像和操纵过程不用退出AFM的反馈系统而连续进行。这样的操纵可以获得很高的精确性，而这主要是受探针尺度的限制。在实行“分离”的纳米操纵时，获得一幅图像，如图3a，选定感兴趣的区域；接下来，通过增加力来驱动AFM探针与选定区域接触，从而利用AFM探针的移动，并且扫描的区域要尽量小，然后执行二维扫描过程，在此扫描过程中通过改变探针对样品分子所施力的大小，克服基底对样品的吸附使样品转移吸附到探针上，从而完成病毒颗粒的分离，见图2b。
本实施例中原子力显微镜的探针的针尖为单个。以上病毒的AFM成像和分离都是在NANOScope IIIa AFM系统上完成的，并在空气环境下进行。扫描头为E型。AFM探针为Force modulation探针(Digital Instrument，美国)。以上实施例中的原子力显微镜是现行商用仪器。
实施例2：利用原子力显微镜纳米操纵技术分离与纯化单个古菌病毒的方法
具体步骤如下：
1、将病毒样品放置于原子级平整的基底表面，此处选用硅片作为固态基底。
2、用原子力显微镜(AFM)对古菌病毒进行成像，获得古菌病毒的物理性质；
首先进行古菌病毒样品准备，古菌病毒为本实验室自行从古菌中提取，未经纯化。上述病毒溶液置于洁净的硅片中心，静置5分钟用洁净空气或者液氮吹干，用AFM进行成像。成像时，采用AFM接触模式，在相对湿度为30~40％下的大气条件下获取，见图3a。在图像上有两种大小明显不同的病毒，一种直径为40-50nm，一种为120nm左右，本实施例分离40nm的小病毒。
3、在适当的区域选定直径为80nm左右的单个病毒颗粒；
选择在基底上只有一个病毒，且在其周围一定距离内没有其他样品存在的区域。选定样品后，将其定位在尽可能小的区域内的中心位置，然后执行分离过程。
4、用原子力显微镜针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖快扫描到病毒时，降低针尖，使针尖与病毒接触，并进行“推”的纳米操纵，通过改变振幅大小来改变探针针尖的减低的高度调节针尖与病毒之间的作用力，使病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离，如图3b所示；在分离完一个病毒后，用同一个针尖，再次执行上述过程，分离获得了第二个病毒。
具体过程同实施例1。
本实施例中原子力显微镜的探针的针尖为单个。
以上病毒的AFM成像和分离是在Bioscopy(Digital Instrument，美国)上完成的，并在真空环境下进行。扫描头为J型。AFM探针为硅探针(Silicon-MDT Ltd.，俄罗斯)。以上实施例中的原子力显微镜是利用基于原子力显微镜原理设计的分离装置。
实施例3：利用原子力显微镜纳米操纵技术分离与纯化单个黄瓜花叶病毒的方法
具体步骤如下：
1、将含有病毒的组织切片放置于平整的基底表面，此处选用聚赖氨酸修饰的玻璃片基底。将患花叶病的黄瓜叶片按常规的组织切片的方法制备病毒样品。
2、用原子力显微镜(AFM)对黄瓜花叶病毒进行成像，在组织中找到含有病毒的区域；成像时，采用AFM接触模式，在近似真空的环境中。从图像中可以看到直径为25nm左右的颗粒，与周围组织有明显的差别。
3、在适当的区域选定圆形且直径为25纳米左右的单个病毒颗粒；
选择在基底上只有一个病毒，且在其周围一定距离内没有其他样品存在的区域。选定样品后，将其定位在尽可能小的区域内的中心位置，然后执行分离过程。
4、用原子力显微镜针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖快扫描到病毒时，降低针尖，使针尖与病毒接触，并进行“推”的纳米操纵，通过改变设置点的大小来改变探针针尖的减低的高度调节针尖与病毒之间的作用力，使病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。
具体过程同实施例1。
本实施例中原子力显微镜的探针的针尖为多个，用不同的针尖同时分离多个病毒。
以上病毒的AFM成像和分离是在Bioscopy(Digital Instrument，美国)上完成的，并在真空环境下进行。扫描头为E型。AFM探针为氮化硅探针(Silicon-MDT Ltd.，俄罗斯)。以上实施例中的原子力显微镜是利用基于原子力显微镜原理设计的分离装置。
实施例4：利用原子力显微镜纳米操纵技术分离与纯化单个空壳腺病毒的方法
具体步骤如下：
1、将病毒样品放置于原子级平整的基底表面；
为了使病毒在基底表面有适中的吸附力以同时满足AFM成像和可以分离的需要，必须根据病毒本身的性质选择适当的基底或对基底进行适当的处理。为达到分离腺相关病毒的目的，我们选用了用聚赖氨酸修饰的云母作为固态基底。
2、用原子力显微镜(AFM)对腺病毒进行成像，并获取病毒的物理性质，空壳病毒的弹性要小于非空壳的病毒。
首先进行空壳腺病毒样品准备，空壳腺病毒购自本元正阳基因技术股份有限公司(目录号：Ad0125d，产品名称：Ad5F35-Null)，病毒用超纯水稀释至10⁷v.g/μl，取4μl上述病毒溶液滴加于修饰后云母片中心，静置5分钟用者液氮吹干，用AFM进行成像。成像时，采用AFM轻敲模式(tappingmode)，在相对湿度为10~20％下的大气条件下获得该病毒的弹性特征。
3、在适当的区域选定单个空壳病毒颗粒；
通过phase相判断去弹性差异或者通过Xingfei Zhou等(PhysicalReview E，71：062901，2005)的方法测定其弹性，确定哪些是空壳病毒。为了更有效的分离样品，最好是选择那些在基底上只有一个病毒，且在其周围一定距离内，没有其他样品存在的区域。选定样品后，将其定位在尽可能小的区域内的中心位置，然后执行分离过程。
4、用原子力显微镜针尖在含有单个病毒的区域内扫描，当针尖快扫描到空壳病毒时，因为是要分离空壳病毒，要比分离实心病毒多降低1-2nm，使针尖与病毒接触，并进行“推”的纳米操纵，通过改变振幅来改变探针针尖的减低的高度，从而调节针尖与病毒之间的作用力，使病毒黏附在针尖上，从而实现单个病毒的分离。
本实施例中原子力显微镜的探针的针尖为单个。以上病毒的AFM成像和分离都是在NANOScope IV AFM系统上完成的，并在空气环境下进行。扫描头为E型。AFM探针为Force modulation探针(Digital Instrument，美国)。以上实施例中的原子力显微镜是现行商用仪器。
对其他不同大小、不同形状、有或无包膜、DNA病毒或RNA病毒也可以采用上述基于原子力显微镜的纳米操纵的方法得以分离，在此不再赘述。