一种L色氨酸的发酵生产工艺.pdf

本发明属于生物工程技术领域，具体公开了一种L-色氨酸的发酵生产工艺：首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)培养成斜面试管菌种，然后再将斜面试管菌种培养成摇瓶种子，再将摇瓶种子培养成为一级种子，最后将一级种子接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵。本发明发酵法生产工艺产酸率达10％，转化率达60％，且工艺简单、成本低、无危险因素、工艺流程合理、自动化程度高、产品质量好、经济效益高。

1.  一种L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于包括下述步骤：
(1)种子制备：
a、首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接入装有斜面培养基的斜面试管中，于28～30℃培养55～72h，制得斜面试管菌种；
b、然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于28～30℃培养18～24h，制备成摇瓶种子；
c、将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，于22～26℃，以250～300转/分的转速培养24～48h，成为一级种子；
(2)发酵生产工艺：
将步骤(1)c的一级种子按体积比计，以0.1～1％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按1∶0.5～0.8vvm，12h后逐渐加大，最后风量达到1∶1.5vvm，发酵过程中，温度控制在22～26℃，罐压保持在0.05～0.07Mpa，pH值控制在6.0～6.1，通过不断加料，维持碳、氮平衡，经过45～60h后发酵培养成熟。

2.  如权利要求1所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(1)c中，接种量按体积比计为0.5～1％。

3.  如权利要求1或2所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(1)a中斜面培养基的组成为：葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄2.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.0～8.2。

4.  如权利要求3所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(1)b中种子培养基和步骤(1)c中摇瓶培养基的组成为：葡萄糖15g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄ 5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄ 0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0～8.2。

5.  如权利要求4所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(2)中发酵培养基的组成为：葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、柠檬二酸钠1.6g、(NH₄)₂SO₄ 4.2g、KH₂PO₄ 5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0～8.2。

6.  如权利要求5所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于：步骤(2)中，利用计量泵，双路进料，一路进糖、一路进氮，保持发酵罐里碳、氮平衡。

7.  如权利要求6所述的L-色氨酸的发酵生产工艺，其特征在于维持碳、氮平衡的具体操作为：发酵前12h，补糖的流量为120l/h，12h以后变为150l/h，补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡。

一种L-色氨酸的发酵生产工艺
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及了一种L-色氨酸的发酵生产工艺。
背景技术
L-色氨酸在药品、食品、饲料、化工等行业中有重要应用。天然提取或化学合成法生产色氨酸存在产量小，产品品质不稳定等诸多因素的影响，L-色氨酸限制氨基酸使用。而且纯化学合成法，其工艺路线长而复杂，成本高。目前的微生物发酵法工业化生产L-色氨酸工艺普遍也不成熟。
发明内容
为克服现有技术的不足之处，本发明的目的就是在于提供一种工艺简单、成本低、无危险因素、工艺流程合理、自动化程度高、产品质量好、经济效益高的L-色氨酸的发酵生产工艺。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤：
(1)种子制备：
a、首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接入装有斜面培养基的斜面试管中，于28～30℃培养55～72h，斜面应生长丰满，制得斜面试管菌种；
b、然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于28～30℃培养18～24h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮，分枝多，染色深，无空泡，无杂菌，效价高的种子备用；
c、将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，于22～26℃，以250～300转/分的转速培养24～48h，成为一级种子，一级种子菌丝健壮、稠、无空泡、分支多；
(2)发酵生产工艺：
将步骤(1)c的一级种子按体积比计，以0.1～1％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按1∶0.5～0.8vvm，12h后逐渐加大，最后风量达到1∶1.5vvm，发酵过程中，温度控制在22～26℃，罐压保持在0.05～0.07Mpa，pH值控制在6.0～6.1，通过不断加料，维持碳、氮平衡，经过45～60h后发酵培养成熟。
步骤(1)c中，接种量按体积比计为0.5～1％。
步骤(1)a中斜面培养基的组成为：葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄2.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.0～8.2。
步骤(1)b中种子培养基和步骤(1)c中摇瓶培养基的组成为：葡萄糖15g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0～8.2。
步骤(2)中发酵培养基的组成为：葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、柠檬二酸钠1.6g、(NH₄)₂SO₄4.2g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0～8.2。
步骤(2)中，通过不断加料，维持碳、氮平衡时的具体操作为：利用计量泵，双路进料，一路进糖、一路进氮，保持发酵罐里碳、氮平衡。
维持碳、氮平衡的具体操作为：正因为通风量随着发酵培养时间的变化逐渐增大，从原始的1∶0.5～0.8逐渐加大至1∶1.5的；相应的补糖的流量和补充氨水的流量也会根据发酵培养的改变而进行调整，前期(12h前)，补糖的流量为120l/h，12h以后变为150l/h，补氨水量根据工艺pH值要求变化进行调节，总体维持碳、氮平衡，保证发酵菌种的正常生长，从而代谢出更多的目的产物。
本发明主要是对菌种改良和新发酵工艺的开发，使菌种有谷氨酸棒杆菌，采用基因工程菌进行生产L-色氨酸的，本发明产酸率达10％，转化率达60％。本发明由于发酵生产所用的原辅材材料较少，大部分均为无机质材料，投入少，产出高，另发酵周期短，各种能耗低，故本发明生产成本低，同时本发明发酵法生产工艺简单、无危险因素、工艺流程合理、自动化程度高、产品质量好、经济效益高。
具体实施方式
以下以具体实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此：
以下实施中的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)购买于中国农业微生物研究所。
实施例1
一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤：
(1)种子制备：
a、首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接入装有斜面培养基的斜面试管中，于28℃培养72h，斜面应生长丰满，制得斜面试管菌种；
b、然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于28℃培养24h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮、分枝多、染色深、无空泡、无杂菌、效价高的种子备用；
c、将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，接种量为0.5％(体积比)，于22℃，以250转/分的转速培养48h，成为一级种子，一级种子菌丝健壮、稠、无空泡、分支多；
(2)发酵生产工艺：
将步骤(1)c的一级种子按体积比计，以0.1％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按1∶0.5～0.8vvm，12h后逐渐加大，最后风量达到1∶1.5vvm，发酵过程中，温度控制在22℃，罐压保持在0.05Mpa，用浓氨水控制pH值在6.0，利用计量泵，双路不断进料，一路进糖、一路进氮，发酵前12h，补糖的流量为120l/h，12h以后变为150l/h，补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡，经过60h后发酵培养成熟。
其中，步骤(1)a中斜面培养基的组成为：葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄2.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.0；步骤(1)b中种子培养基和步骤(1)c中摇瓶培养基的组成为：葡萄糖15g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.1；步骤(2)中，发酵培养基的组成为：葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、柠檬二酸钠1.6g、(NH₄)₂SO₄4.2g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0；上述斜面培养基、种子培养基、摇瓶培养基、发酵培养基的灭菌温度均为121℃，灭菌时间均为30分钟。
本实施例产酸率9.1％，转化率55％。
实施例2
一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤：
(1)种子制备：
a、首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接入装有斜面培养基的斜面试管中，于29℃培养63h，制得斜面试管菌种；
b、然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于29℃培养20h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮、分枝多、染色深、无空泡、无杂菌、效价高的种子备用；
c、将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，接种量为0.7％(体积比)；
于24℃，以270转/分的转速培养36h，成为一级种子，一级种子菌丝健壮、稠、无空泡、分支多；
(2)发酵生产工艺：
将步骤(1)c的一级种子按体积比计，以0.5％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按1∶0.5～0.8vvm，12h后逐渐加大，最后风量达到1∶1.5vvm，发酵过程中，温度控制在24℃，罐压保持在0.06Mpa，用浓氨水控制pH值在6.05，利用计量泵，双路不断进料，一路进糖、一路进氮，发酵前12h，补糖的流量为120l/h，12h以后变为150l/h，补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡，经过53h后发酵培养成熟。
其中，步骤(1)a中斜面培养基的组成为：葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄2.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.1；步骤(1)b中种子培养基和步骤(1)c中摇瓶培养基的组成为：葡萄糖15g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.2；步骤(2)中，发酵培养基的组成为：葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、柠檬二酸钠1.6g、(NH₄)₂SO₄4.2g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.1；上述斜面培养基、种子培养基、摇瓶培养基、发酵培养基的灭菌温度均为121℃，灭菌时间均为30分钟。
本实施例产酸率9.5％，转化率58％。
实施例3
一种L-色氨酸的发酵生产工艺，包括下述步骤：
(1)种子制备：
a、首先将母种谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)接入装有斜面培养基的斜面试管中，于30℃培养55h，制得斜面试管菌种；
b、然后再将步骤a的斜面试管菌种接入种子培养基中进行斜面活化，于30℃培养18h，制备成摇瓶种子，经镜检，挑选菌丝健壮、分枝多、染色深、无空泡、无杂菌、效价高的种子备用；
c、将步骤b的摇瓶种子接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，接种量为1.0％(体积比)；于26℃，以300转/分的转速培养24h，成为一级种子，一级种子菌丝健壮、稠、无空泡、分支多；
(2)发酵生产工艺：
将步骤(1)c的一级种子按体积比计，以1％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中发酵，发酵前12h通气量要小，风量按1∶0.5～0.8vvm，12h后逐渐加大，最后风量达到1∶1.5vvm，发酵过程中，温度控制在26℃，罐压保持在0.07Mpa，用浓氨水控制pH值在6.1，利用计量泵，双路不断进料，一路进糖、一路进氮，发酵前12h，补糖的流量为120l/h，12h以后变为150l/h，补氨水量根据发酵液pH值进行调节，总体维持碳、氮平衡，经过45h后发酵培养成熟。
其中，步骤(1)a中斜面培养基的组成为：葡萄糖15g、琼脂粉20g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄2.6g、水1000ml，灭菌前pH值8.2；步骤(1)b中种子培养基和步骤(1)c中摇瓶培养基的组成为：葡萄糖15g、酵母粉0.08g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.0；步骤(2)中，发酵培养基的组成为：葡萄糖85g、酵母粉0.05g、硫胺素0.0013g、柠檬二酸钠1.6g、(NH₄)₂SO₄4.2g、KH₂PO₄5.6g、MgSO₄·7H₂O 4.6g、MnSO₄0.0013g、水1000ml，灭菌前pH值8.2；上述斜面培养基、种子培养基、摇瓶培养基、发酵培养基的灭菌温度均为121℃，灭菌时间均为30分钟。
本实施例产酸率10％，转化率60％。