猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母及表达蛋白.pdf

本发明公开了一种猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母及表达蛋白，涉及生物蛋白制备领域。主要经基因的获得、表达载体的构建、目的蛋白的表达。利用PCR方法用设计的引物从猪肺炎支原体基因组DNA中扩增获得目的基因，再经酶切和连接克隆入酵母表达载体pPICZα-A，构建成分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A/P97R1，pPICZα-A/P97R1经Sac I酶切线性化后电转化入毕赤酵母菌株GS115。重组的毕赤酵母经甲醇诱导分泌表达P97R1蛋白。该方法制备的猪肺炎支原体P97R1蛋白较纯，且具有良好的免疫反应性，可用于猪肺炎支原体P97蛋白的研究、猪肺炎支原体免疫检测试剂盒和基因工程疫苗的研制。

1.  猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母，该重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1属巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M209071。

2.  权利要求1所述猪肺炎支原体P97R1基因毕赤酵母表达载体的构建方法，包括：
1)引物设计
设计两条引物，序列为：
P1：5′ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3′      EcoR I
P2：5′CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3′        Xba I
2)PCR获取P97R1目的基因
以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；
3)将P97R1目的基因克隆入pPICZα-A表达载体
PCR产物和pPICZα-A均用EcoR I、Xba I双酶切，T4DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli DH5α，对用EcoR I、Xba I双酶切进行鉴定阳性的重组表达质粒进行测序，测序结果见SEQ ID NO.1，构建正确的重组表达质粒命名为pPICZα-A/P97R1；
4)重组毕赤酵母菌株的筛选和鉴定
毕赤酵母GS115感受态与Sac I线性化的pPICZα-A/P97R1相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，28-30℃培养至单菌落出现，采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通用引物5’AOX和3’AOX为引物，其序列分别为5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′和5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′，进行PCR鉴定，筛选到的阳性酵母菌即为猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1。

3.  权利要求1或2所述猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母表达的蛋白。

4.  权利要求3所述表达蛋白的制备方法，包括：
将猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1接种到5mLBMGY中，28～30℃、200r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达到2～6时，室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达，28～30℃、200r/min培养72h，期间每24h补加至终浓度体积比为1％的甲醇，72h后，5000r/min离心10min，收集培养液上清，即为获得的表达蛋白以可溶形式存在的上清液。

猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母及表达蛋白
一、技术领域
本发明涉及一种猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母及表达蛋白，属于生物蛋白制备技术领域。特别是涉及猪肺炎支原体P97R1毕赤酵母表达载体的构建与表达方法。制备的蛋白可用于P97R1研究、试剂盒和基因工程疫苗的研制。
二、背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪气喘病(MPS)的病原。后者是猪群中流行最广、传播最快、最难净化的疫病之一。猪肺炎支原体通过呼吸道传播，感染呼吸道上皮后导致呼吸道纤毛萎缩、脱落、损坏，上皮细胞坏死，降低呼吸道黏膜的免疫功能，引起肺部功能损伤，容易产生其它呼吸道病原的继发感染。据报道，该病可使猪的饲料转化率降低10％，生长速度降低12％～15％，出栏时间延长1个月，与胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染时，情况更为严重，该病一旦爆发就难以控制，给养殖业造成巨大的经济损失。
目前对该病致病机理还不十分清楚。在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测方法，如免疫琼扩和间接血凝等，但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。由于Mhp与非致病支原体之间存在着交叉反应，所以血清学检测方法的研发困难重重。猪肺炎支原体的黏附因子(P97蛋白)被证明参与猪肺炎支原体对猪呼吸道黏膜上皮纤毛的黏附，另外，研究发现猪肺炎支原体感染时P97引发的免疫反应远远早于其他抗原蛋白所引起的免疫反应。Hsu等(1998)利用Tn1000插入诱变产生的不同的重组产物，初步定位了P97的黏附作用部位和抗原识别表位。免疫印迹显示，单抗识别的表位在R1，需要至少2.5个5aa重复基元。不同重组产物的体外吸附测定表明，R1区是直接参与黏附的区域，R1区下游的序列不起作用。而且与猪体内常寄居的其他支原体进行比较后发现，P97R1区高度保守，为肺炎支原体种特异性抗原成份，无交叉反应。因此，可以应用P97R1蛋白作为抗原，建立ELISA诊断方法，对于猪支原体肺炎的早期诊断有很重要的意义。
而目前的研究主要是在大肠杆菌里对其进行表达，表达的蛋白大多以融合蛋白的形式存在，对后续应用可能存在一定的干扰，并且由于大肠杆菌成份的存在，表达蛋白需要进行烦琐的纯化后才能用于后期的研究。而巴斯德毕赤酵母表达系统是近年发展起来的一种新型真核表达系统，它既可以进行胞内表达，也可进行分泌表达。据报道，在酵母表达系统里表达结核分枝杆菌CFP32蛋白与原核表达系统表达的该蛋白的Western Blotting结果显示，酵母表达系统表达的该蛋白与抗体的结合能力更强，而且ELISA结果也显示，结核病人的血清以及接种过疫苗的健康人的血清与酵母表达的CFP32蛋白的结合能力较原核表达的该蛋白强。因此，选用了酵母表达系统表达P97R1蛋白具有较好的前景。
三、发明内容
技术问题
针对上述领域中的缺陷，本发明提供了一种猪肺炎支原体P97R1基因毕赤酵母表达系统，其表达蛋白纯度高、工艺简单、生物安全度高、成本低廉、易于生产和应用等特点，为进一步研究P97蛋白、开发研制检测试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。
技术方案
本发明的具体实施方案如下：
1.猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1属巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2009年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M209071。
上述猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1的构建方法，包括：
1)引物设计
设计两条引物，序列为：
P1：5′ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3′  EcoR I
P2：5′CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3′    Xba I
2)PCR获取P97R1目的基因
以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株DNA为模板进行PCR扩增，回收PCR扩增产物；
3)将获取的目的基因克隆入pPICZα-A表达载体并进行序列测定
PCR产物和pPICZα-A均用EcoR I、Xba I双酶切，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli DH5α，重组表达质粒用EcoR I、Xba I双酶切进行鉴定阳性的测序，构建正确的重组表达质粒命名为pPICZα-A/P97R1；
4)重组毕赤酵母的筛选和鉴定
毕赤酵母GS115感受态与Sac I线性化pPICZα-A/P97R1相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯中，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板上，28～30℃培养至单菌落出现，采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通用引物5′-AOX和3′-AOX为引物，其序列分别为5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′和5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′，进行PCR鉴定，筛选到的阳性酵母菌即为猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1。
上述猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母表达的蛋白，其制备方法包括：
将猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1接种到5mL BMGY中，28～30℃、200r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达到2～6时，室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基，进行诱导表达，28～30℃、200r/min培养72h，期间每24h补加至终浓度体积比为1％的甲醇，72h后，5000r/min离心10min，收集培养液上清，即为获得的表达蛋白以可溶形式存在的上清液。
有益效果
本发明的特点和优点如下：
本发明所获得的重组表达蛋白是由基因工程菌株毕赤酵母GS115体外甲醇诱导表达后离心后取上清所得，该重组毕赤酵母含重组表达质粒pPICZα-A/P97R1。本实验选用的重组表达质粒为pPICZα-A载体，属于分泌型载体，它具有高效可调控启动子AOX(醇氧化酶)；具有Zeocin抗性筛选标记基因，具有a-因子前导信号序列，能有效地引导外源蛋白分泌到胞外。重组表达质粒pPICZα-A/P97R1的表达式为：-5’AOX1-a-factor-P97R1 gene-Zeocin-。
本发明的技术方案主要包括以下两个方面：
第一方面构建了表达载体pPICZα-A/P97R1。根据GenBank中报道的猪肺炎支原体P97R1基因序列，参照毕赤酵母偏嗜密码子自行设计一对特异性引物，引物两端分别加限制性酶切位点EcoR I和Xba I及保护性碱基(Invitrogen公司合成)，下划线部分为酶切位点。
P1：5′ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3′  EcoR I
P2：5′CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3′    Xba I
通过PCR获取P97R1目的基因，将目的基因克隆入pPICZα-A表达载体，构建重组表达质粒pPICZα-A/P97R1并进行序列测定，将重组质粒转化毕赤酵母GS115感受态细胞，PCR鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pPICZα-A/P97R1。
第二方面通过重组表达质粒pPICZα-A/P97R1体外诱导表达P97R1蛋白，经过SDS-PAGE电泳以及Western Blotting进行鉴定，证明该蛋白具有良好的抗原性，能特异性地与猪肺炎支原体阳性血清进行结合，后再对表达条件进行优化，提高表达量，用分光光度法测定蛋白浓度可达499μg/mL。
本发明选取的目的基因长度为253bp，表达载体pPICZα-A/P97R1构建容易；其次，pPICZα-A/P97R1的表达产物具有良好的抗原性；第三，其表达产物都分泌于上清液中，而毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；第四，纯化的表达蛋白不需要进行蛋白复性就可使用。
因此，本发明为进一步研究猪肺炎支原体P97蛋白、开发研制检测试剂盒和基因工程疫苗奠定了基础。
四、附图说明
图1猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母及表达蛋白技术路线示意图
图2重组表达质粒pPICZα-A/P97R1 PCR鉴定图谱
泳道M为DL-2000 Marker；泳道1为重组表达质粒pPICZα-A/P97R1 PCR鉴定结果；泳道2为pPICZα-A载体PCR鉴定结果。
图3重组表达质粒pPICZα-A/P97R1双酶切鉴定图谱
泳道M为DL-2000 Marker；泳道1为重组表达质粒pPICZα-A/P97R1EcoR I、Xba I双酶切；泳道2为pPICZα-A载体EcoR I、Xba I双酶切。
图4重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1的PCR筛选鉴定图
泳道1为载体质粒pPICZα-A电转化毕赤酵母GS115的克隆；泳道2为重组表达质粒pPICZα-A/P97R1电转化毕赤酵母GS115的阳性克隆；泳道M为DL-2000Marker。
图5重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1表达的SDS-PAGE图谱
泳道1、2、3、4分别为重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1的4个克隆诱导72h后离心取得上清；泳道5为毕赤酵母GS115/pPICZα-A诱导72h后离心取得上清；泳道M蛋白分子量标准。
图6表达蛋白的Western Blotting鉴定图
泳道M蛋白分子量标准；泳道1为毕赤酵母GS115/pPICZα-A诱导72h后离心取得上清；泳道2为重组毕赤酵母GS115/pPICZα-A/P97R1诱导72h后离心取得上清。
五、具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
1.引物设计
根据GenBank中报道的猪肺炎支原体P97R1基因序列(AE017243)，参照毕赤酵母偏嗜密码子设计两条引物，由TaKaRa公司合成，引物序列为：
P1：5′ATAGAATTCTTACCTCAGCCGCCAGCAG 3′  EcoR I
P2：5′CGCTCTAGAAAGCCATTGGGAAATAG 3′    Xba I
2.PCR获取P97R1目的基因
以P1和P2为引物，猪肺炎支原体JS99株(国家兽医微生物菌种保藏管理中心)DNA为模板进行PCR扩增，反应体系(25μL)：10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)2.0μL，dNTP(10mmol/L)1.0μL，引物P1、P2(20pmol/L)各0.25μL，Taq^TM0.25μL，模板0.25μL，ddH₂O 18.5μL(均购于TaKaRa公司)。混匀，瞬间离心，进行扩增反应。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，按94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s循环30次，再于72℃延伸10min。取10μL PCR产物于质量比1.5％TAE琼脂糖凝胶中电泳，切下目的片段，用小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。3.将获取的目的基因克隆入pPICZα-A表达载体并进行序列测定
PCR产物和pPICZα-A(Invirtrogen^TM life technologies)均用EcoR I、Xba I双酶切，T4 DNA连接酶连接，连接产物转化E.coli DH5α(宝生物工程(大连)有限公司)，重组表达质粒用上述PCR反应条件进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳可以看见一条约271bp(含目的基因、酶切位点和保护碱基)的条带出现(图2)，用EcoR I、Xba I双酶切进行鉴定，37℃水浴2h，琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到一条约271bp的条带出现(图3)。鉴定阳性的质粒送Invitrogen上海分公司测序(见序列表SEQ ID NO.1)。构建正确的重组表达质粒命名为pPICZα-A/P97R1。
4.重组毕赤酵母菌株的筛选和鉴定
毕赤酵母GS115感受态(Invirtrogen^TM life technologies)(80μL)与Sac I(TaKaRa公司)线性化pPICZα-A/P97R1(5μg)相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯(Bio-Rad)中，置冰上5min，1.5kV、25μF、200Ω电击，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于YPDS平板(按照Pichia Expression Kit配制)上，28-30℃培养至单菌落出现。详细步骤参照Pichia Expression Kit。采用PCR方法分析毕赤酵母转化子，用煮-冻-煮法制备PCR模板，以通用引物5AOX和3AOX为引物，其序列分别为5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′，和5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′反应体系(20μL)：2×PCR Mix 10μL，引物P1、P2(20pmol/L)各0.25μL，模板2.5μL，ddH₂O 7μL。混匀，瞬间离心，进行PCR扩增反应。PCR反应条件为94℃预变性4min后，按94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，循环30次，再于72℃延伸10min。取10μl PCR产物于质量比1％TAE琼脂糖凝胶中电泳，可见扩增到目的条带786bp(见图4)。
将筛选到的阳性酵母菌接种到5mL BMGY(按照Pichia Expression Kit配制)中，28～30℃、200r/min振荡培养约22h至OD₆₀₀达到2～6，室温3000r/min离心2min，收集菌体重悬于25mL BMMY培养基(按照Pichia Expression Kit配制)，进行诱导表达。28～30℃、200r/min培养72h，期间每24h补加至终浓度体积比为1％的甲醇。72h后，5000r/min离心10min，收集培养液上清。培养上清进行SDS-PAGE电泳鉴定，约10KDa的表达蛋白以可溶形式存在于表达上清中(见图5)。然后再对重组菌株和表达条件进行筛选和优化，提高表达量，用分光光度法测定蛋白浓度可达499μg/mL。
5.表达蛋白的Western Blotting鉴定
将表达蛋白同上进行SDS-PAGE电泳后进行Western Blotting，以猪肺炎支原体阳性血清(中国兽医药品监察所)为一抗，HRP标记的羊抗猪IgG(武汉博士德公司)为二抗，用DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)显色，在醋酸纤维素膜上可见到约10KDa的目的条带(见图6)，推导的氨基酸序列见SEQ ID NO.2。Western Blotting鉴定证明表达的猪肺炎支原体P97R1蛋白具有良好的免疫反应性，能特异性地与猪肺炎支原体阳性血清进行结合。因此，本发明为进一步研究P97蛋白、开发研制检测试剂盒和基因工程疫苗奠定了基础。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>猪肺炎支原体P97R1基因重组毕赤酵母及表达蛋白
<130>说明书
<140>00
<141>2009-05-05
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3790
<212>DNA
<213>人工构建
<220>
<221>重组表达质粒pPICZα-A/P97R1
<222>(1)..(3790)
<223>
<400>1
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ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta  3420
actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg  3480
gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc  3540
ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta  3600
ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg  3660
gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt  3720
tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg  3780
tcatgagatc                                                         3790
<210>2
<211>87
<212>PRT
<213>重组酵母分泌表达
<220>
<221>分泌表达蛋白P97 R1
<222>(1)..(87)
<223>
<400>2
Glu Phe Leu Pro Gln Pro Pro Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro
1               5                   10                  15
Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu
            20                  25                  30
Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala
        35                  40                  45
Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Val Ala Thr
    50                  55                  60
Asn Thr Asn Thr Asn Thr Gly Phe Ser Leu Thr Asn Lys Pro Lys Glu
65                  70                  75                  80
Asp Tyr Phe Pro Met Ala Phe
                85
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>P97R1 PCR引物P1
<222>(1)..(28)
<223>
<400>3
atagaattct tacctcagcc gccagcag    28
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>P97R1 PCR引物P2
<222>(1)..(26)
<223>
<400>4
cgctctagaa agccattggg aaatag    26
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物5’AOX
<222>(1)..(21)
<223>
<400>5
gactggttcc aattgacaag c    21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物3’AOX
<222>(1)..(21)
<223>
<400>6
gcaaatggca ttctgacatc c    21