动物源草酸青霉发酵产饲料级果胶酶工艺.pdf

一种以鹅体内分离所得到的草酸青霉发酵产饲料级果胶酶工艺，属于微生物发酵领域。通过固态发酵，生产出酶活力大，保存期长，耐贮性好，各组分百分含量稳定和纯度高的酶制剂。生产的果胶酶制剂总酶活力达10123.22U·g-1；聚半乳糖醛酸酶活力5101.23U·g-1，为总酶活力的50％；果胶酯酶活力6986.52U·g-1，为总酶活力的69％；果胶裂解酶0.56U·g-1，为总酶活力的0.005％。将果胶酶制剂在动物日粮添加0.2％时，粗纤维(CF)的消化率提高了17.04％，中性洗涤纤维(NDF)提高了12.15％，酸性洗涤纤维(ADF)提高了13.95％；净蛋白利用率(NPU)提高了9.53％；Ca、P的表观消化率分别比对照组提高了7.04％和8.38％；该工艺的发明，解决了生产中复合菌发酵饲料用酶制剂其酶组分及含量不确定的关键生产技术问题，为果胶酶不同组分酶制剂的合理配伍及应用提供了新技术。

1、  从健康鹅肠道菌群中分离筛选出的一种果胶酶高产菌株——草酸青霉F67(Penicillium oxalicum Currie&Thom)(微生物保藏号：CGMCC NO.2260)用来发酵产饲料级果胶酶；主要工艺包括：菌种的选择与优化、培养基组成和发酵条件的确定、载体的选择、冷冻干燥等；其特征在于：通过固态发酵，生产出酶活力大，保存期长，耐贮性好，各组分百分含量稳定的酶制剂。生产的果胶酶制剂总酶活力达10123.22U·g^-1；聚半乳糖醛酸酶活力5101.23U·g^-1，为总酶活力的50.39％；果胶酯酶活力6986.52U·g^-1，为总酶活力的69.01％；果胶裂解酶0.56U·g^-1，为总酶活力的0.005％。将果胶酶制剂添加到动物日粮，结果粗纤维(CF)的消化率提高了17.04％，中性洗涤纤维(NDF)提高了12.15％，酸性洗涤纤维(ADF)提高了13.95％；净蛋白利用率(NPU)提高了9.53％；Ca、P的表观消化率分别比对照组提高了7.04％和8.38％。

2、  根据权利要求书1所述的草酸青霉F67产饲料级果胶酶工艺，其特征在于菌种草酸青霉F67源于动物体内，较土壤、腐烂物以及粪便等其它来源的菌株所产的果胶酶能更好的适应动物肠道环境条件，使用安全，是理想的果胶酶生产菌株。

3、  根据权利要求书1所述的草酸青霉F67产果胶酶工艺，其特征在于发酵培养基中最佳氮源为硫酸铵，其适宜添加量分别为8％。

4、  根据权利要求书1所述的草酸青霉F67产果胶酶工艺，其特征在于在固态发酵过程中，用麸皮作为底物，以调节发酵底物的营养，起到膨松剂的作用，有助于提高发酵效果。

5、  根据权利要求书1所述的草酸青霉F67产果胶酶工艺，其特征在于最佳发酵条件为发酵时间48h，发酵温度28℃。最佳接种量为8％，最佳初始pH为4.5。产品中聚半乳糖醛酸酶活力5101.23U·g^-1；果胶酯酶活力6986.52U·g^-1；果胶裂解酶0.56U·g^-1。

6、  根据权利要求书1所述的草酸青霉F67产果胶酶工艺，其特征在于果胶酶制剂可添加到动物日粮中，提高动物对营养物质的消化率。

7、  根据权利要求书1所述的草酸青霉F67产果胶酶工艺，其特征在于发酵产生的果胶酶制剂耐贮性好，在0～4℃冷藏9个月，酶活力不受影响。在常温15～30℃保存时，3月之内酶活不受影响；到6个月时，固态酶制剂仍保留有原始活力的84.33％，到9个月时为61.51％，达到国际标准。

动物源草酸青霉发酵产饲料级果胶酶工艺
技术领域
本发明涉及一种动物源草酸青霉菌(Penicillium oxalicum Currie & Thom)发酵产饲料级果胶酶工艺。
背景技术
随着饲料工业和畜牧业的迅猛发展，饲料资源短缺的问题日益严重，已成为影响我国饲料工业和畜牧业进一步发展的主要限制因素。2007年8月份全国玉米平均价格为1.66元/公斤，比去年同期上涨16.1％；豆粕平均价格为2.83元/公斤，同比上涨13.7％；苜蓿干草比去年同期增长了20％以上。据预测，2010年，中国能量饲料将短缺22～38％，蛋白饲料将短缺40％。解决饲料资源缺乏的两个主要途径为：提高现有饲料资源的利用率和开发新的饲料资源。运用现代生物技术将酶制剂应用于饲料中是当前世界饲料工业重点研究和发展的方向，是提高饲料转化率、扩大饲料资源行之有效的措施。目前大量的试验研究表明，酶制剂的合理应用可扩大饲料资源的应用范围，而且可有效提高现有饲料资源的利用效率。
果胶(Pectin)是植物组织中与纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质等结合的不溶于水的一类物质，主要是由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物，是非淀粉多糖(NSP)的成分之一。果胶广泛存在于高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态；一般以豆科植物中果胶含量较多，如苜蓿中含量达5％～10％，豆粕果胶含量10％～14％，菜籽粕果胶含量11.5％。在动物的蛋白饲料中，果胶作为豆粕中含量最高的抗营养因子，目前并没有受到研究者的重视。
果胶酶(Pectinase，PE)是最早在人们生活中得到应用的酶类之一，商业应用最早见于1930年，用来制备酒水和果汁。果胶酶是一个多酶复合体系，能够水解果胶中以α-1，4糖苷键结合的半乳糖醛基，产生还原糖，提高营养物质的利用率。
目前，有关果胶酶产生菌主要来源于土壤和腐败植物，有关动物源的菌株来源生产饲料级果胶酶工艺国内外未见报道。
目前，饲用酶领域的研究多集中在蛋白酶和淀粉酶上，对饲用果胶酶并没有进行深入的研究。另外，生产上多数采用复合菌发酵获得粗酶制剂，其产品组分和比例不够清楚，各种酶的功能也不够明确，导致难以科学、合理的应用于动物生产。经查新，我国与本项研究相关的报道尚未发现。
发明内容
本发明目的在于提供组分确定的果胶酶产品发酵工艺，该产品适宜在动物日粮中添加，并能够提高日粮中营养成分利用率。
本发明目的通过以下技术方案来实现的：
使用的微生物
用来发酵产果胶酶的微生物是一种新的微生物，属于真菌的青霉属，草酸青霉菌种(Penicillium oxalicum Currie & Thom)。名称为F67，简称F67菌。它是果胶酶高产菌株。F67来自鹅盲肠内，经动物毒力试验表明，该菌株安全无毒性。已于2004年11月通过中国科学院微生物研究所的鉴定，保藏日期：2007年11月23日；微生物保藏号为CGMCC NO.2260；分类命名：草酸青霉(Penicillium oxalicum)。生物材料样品保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101。
F67菌株具有以下性质
菌落在查氏培养基上，25℃、7d直径41mm-44mm，质地丝绒状，平坦，深绿色，边缘白绿色，整齐；分生孢子结构较多，易脱落；反面浅绿色。菌落在查氏酵母膏琼脂培养基上生长迅速，25℃、7d直径59mm-60mm，质地丝绒状，平坦，分生孢子结构大量，深灰绿色。菌落在麦芽汁琼脂培养基上，25℃、7d直径54mm-60mm，质地丝绒状，平坦，分生孢子结构大量，灰绿色；反面呈不同程度的黄褐色。分生孢子梗发于基质菌丝，壁光滑，直径3.8mm-5.4μm；帚状枝双轮生，梗基每轮2个-4个，近柱状，19-24×3.7-4.0μm；瓶梗每轮4个-8个，披针形，10.8-14.6×2.4-3.8μm；分生孢子灰绿色，椭圆形，5.5-6.1×2.8-3.4μm，壁光滑；分生孢子链长圆柱形。
本发明所述F67菌株培养基的制备
固态发酵培养基：麸皮15g，葡萄糖0.9g，(NH₄)₂SO₄1.2g，KH₂PO₄0.075g，水15ml，培养基起始pH为4.5，250ml三角瓶分装，0.1MPa灭菌25min。
培养的F67菌株，贮存于-20℃冰箱中。
斜面菌种→活化→接种1环至5ml液态培养基→28℃，150rpm摇床培养24h→以8％的接种量接种至三角瓶→将F67按8％的接种量接入固态发酵培养基。发酵时间为48h，料水比为1∶1，发酵温度为28℃。
本发明的优点是：
1、用来发酵产果胶酶的微生物草酸青霉F67分离于鹅的盲肠内，生产的果胶酶酶活力大。总酶活力达10123.22U·g^-1，其中聚半乳糖醛酸酶活力达51013U·g^-1，果胶酯酶活力达6986.52U·g^-1，果胶裂解酶达0.56U·g^-1。
2、发酵所产的果胶酶组分固定，保存期长，耐贮性好，各组分百分含量稳定。其中聚半乳糖醛酸酶活力为总酶活力50％，果胶酯酶为总酶活力的69％，果胶裂解酶为总酶活力的0.005％。结果详见表1和表2。
表1贮存时间对果胶酶总酶活力的影响(U·g^-1)

表2贮存时间对果胶酶不同组分酶活力的影响(U·g^-1)


3、本发明应用动物日粮，不仅可以提高饲料利用率，降低饲料成本，而且可以缓解饲料源短缺，达到节约饲料的效果。
4、本发明工艺简单，常温发酵，既适合于规模生产又可以分散加工，便于推广应用。
具体实施方式
实施例1
果胶酶制剂对鹅日粮消化率的影响
选取24月龄的健康鹅24只，随机分为4个组，每组6个重复。第1组为对照组(基础日粮)，其余3组为试验组。第2组，第3组，第4组果胶酶添加量分别为0.1％、0.2％、0.3％。采用全收粪法进行体内消化代谢试验，检测饲料和粪便中的粗蛋白(CP)、氨基酸(AA)、CF、氨态氮(NH₃-N)、钙(Ca)和磷(P)等多种营养成分及粪便微生物数量，确定其表观消化率，研究果胶酶对鹅玉米-豆粕日粮消化率的影响。
体内消化代谢试验结果表明，在代谢能(ME)和CP等营养成分摄入量一致的条件下，各试验组养分的消化率显著高于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。与对照组相比，CF的消化率提高了5.78％～17.04％，NDF提高了9.80％～12.15％，ADF提高了4.53％～13.95％；净蛋白利用率(NPU)提高了0.43％～9.53％，粪便中氨态氮浓度比对照组降低5.83mg/kg～26.37mg/kg；除甘氨酸(GLY)偏低之外，各种氨基酸表观消化率(AAAD)均较高，试验组达到75.92％～94.27％，而对照组为72.19％～90.54％；Ca、P的表观消化率分别比对照组提高了1.81％～7.04％和5.51％～8.38％；每克粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌分别提高了0.47～1.05、0.17～0.63、0.12～0.37数量级(lgn)。说明添加果胶酶制剂能够提高鹅对营养物质的消化吸收效果和改善肠道微生物区系。试验结果详见表3。
表3各试验组CF，NDF，ADF消化率的比较

注：表中数据以平均数±标准差表示，同列数据字母相同、相邻和相间分别表示差异不显著(P＞0.05)，显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)。